Receptor de imagen acoplados a proteína G (GPCR) mediada por eventos de señalización que la quimiotaxis de control de Dictyostelium discoideum

El objetivo general de este procedimiento es aplicar microscopía confocal de fluorescencia avanzada para monitorear la dinámica espacio-temporal de los eventos de señalización durante la detección de quimioterapia en células de dium discoide dictyostelium primero se preparan células de dium discoide dictyostelium quimiotácticas competentes. A continuación, se obtienen imágenes de un gradiente controlado de quimioatrayente para establecer una relación lineal entre la concentración de quimioatrayente y la intensidad fluorescente del atrayente de quimioterapia. El tercer paso es obtener un sistema de células inmóviles para obtener imágenes de eventos de señalización implicados en la detección de gradiente A MP cíclico.

El paso final es monitorear simultáneamente dos eventos de señalización controlados por G PCR R en células vivas, la activación heterotrimérica de la proteína G y la producción de PIP tres. En última instancia, cambios espacio-temporales en las intensidades de fluorescencia en células individuales que se simulan con un atrayente de quimioterapia. El MP A cíclico se puede visualizar a través de imágenes de células vivas con microscopía confocal avanzada.

La principal ventaja de esta técnica es que nos permite obtener información espacio-temporal sobre el evento de señalización en las células de vida. Estas mediciones de estilo de vida permiten una mejor comprensión de cómo la red de señalización A-G-P-C-R es capaz de detectar un ingrediente atrayente de quimioterapia y generar respuestas adecuadas. La demostración del procedimiento estará a cargo del Dr. Shu, quien es un experto en métodos de imágenes de estilo de vida. Para generar células de dsco dium que son quimiotácticas para el atrayente de quimioterapia cíclico A MP recolectar células que crecen en D tres medios de tricomoniasis a partir de un cultivo agitado a 22 grados centígrados.

Lave las células dos veces en tampón de desarrollo no nutriente por centrifugación a 400 g durante cinco minutos. A temperatura ambiente, resus suspende las células en el tampón DB a una densidad de dos veces 10 de la séptima célula por mililitro. Transfiera 20 millones de células en 10 mililitros de tampón de desarrollo a un matraz de 250 mililitros y luego agite las células a 100 RP M a 22 grados Celsius durante una hora.

A continuación, suministre 100 microlitros de material de 7,5 micromolares cíclicos a MP a los 10 mililitros de células cada seis minutos durante las próximas seis horas para lograr una concentración final de 75 ano molares cíclicos A MP. Ahora recoja las células competentes del atrayente de quimioterapia A MP cíclicas por centrifugación, esta vez a 200 Gs, y luego vuelva a suspender las células con tampón DB que contiene 2,5 milimolares de cafeína. Agitar las células de nuevo a 22 grados centígrados durante 20 minutos. Esta vez a 200 RPM para ensalar las células para la quimiotaxis.

En primer lugar, rellene una micropipeta con una solución de 30 mililitros recién preparada de un A MP cíclico micromolar y Alexa 5 94 a 0,1 microgramos por microlitro en tampón DB. A continuación, conecte una punta Femto a un soporte de micropipetas y conecte el tubo a un aparato de suministro de presión. Para establecer un gradiente estable, conecte el conjunto de micropipetas a un micromanipulador motorizado.

Llene una cámara técnica de laboratorio de un pozo con seis mililitros de tampón DB y luego monte la cámara sobre una lente de aceite de 40x en un microscopio confocal usando el centro óptico Brightfield, la punta Femto en el campo de visión. A continuación, encienda el suministro de presión y ajuste la presión de compensación a 70 Hector Pascals para establecer un gradiente de la mezcla cíclica A MP Alexa 5 94. Visualice el gradiente cíclico de A MP monitoreando la mezcla de la concentración deseada de A MP cíclico y la fluorescencia de Alexa 5 94 utilizando una excitación con una línea láser de 543 nanómetros.

Por último, utilice la función de posicionamiento automático del micromanipulador para colocar la micropipeta en las posiciones deseadas y ajuste la posición uno, la posición dos y la posición tres para manipular el gradiente al que están expuestas las células. Después del tratamiento con cafeína, retire una alícuota de células y granule las células a 500 G durante tres minutos. A temperatura ambiente, retire el tampón y diluya las células a cinco veces 10 de las quintas células por mililitro.

Con tampón DB fresco que contiene 2,5 milimolares de cafeína. A continuación, aplique un mililitro de la suspensión celular a una sola cámara de pocillo. Después de permitir que las células se adhieran durante 10 minutos, pipetee cuidadosamente el tampón para eliminar las células no adheridas y luego reemplácelo con el mismo volumen de tampón DB fresco con cafeína para comenzar a obtener imágenes, ubique las células deseadas bajo el microscopio.

A continuación, monitorizar la dinámica de los componentes de señalización en células expuestas a un gradiente constante. Trate las células con cinco micromolares LA truculento B durante 10 minutos antes de cualquier experimento. Este esquema muestra una breve vía de señalización de detección direccional en esta película.

Se puede ver cómo un gradiente A MP cíclico induce una quimiotaxis rápida de las células de discoste D, células que expresan la sonda PIP tres. P-H-G-F-P aparecen en verde. El degradado visualizado por Alexa 5 94 aparece en rojo. Aquí.

Un método sencillo para obtener una relación lineal entre la concentración cíclica de A MP y la intensidad de un colorante fluorescente. Alexa 5 94 por una serie de dilución de dos micromolares cíclicos A MP mezclados con 10 microgramos por mililitro de Alexa. Se muestra 5 94.

A continuación, se demuestra gráficamente una forma sencilla de establecer una medición cuantitativa de la concentración cíclica de A MP de un gradiente por la intensidad de Alexa 5 94. Esta figura muestra cómo las células cuya motilidad ha sido suprimida por el lattruculento B, un inhibidor de la polimerización de actones, aún mantienen su capacidad de detección direccional. Las celdas expresan la sonda PIP tres, P-H-G-F-P y aparecen en verde, mientras que el gradiente en rojo es visualizado por Lexi 5 94.

En esta película, se puede ver cómo el empleo de un sistema de células simplificadas no polarizadas y la estimulación A MP cíclica manipulable puede abordar cuestiones fundamentales de la detección direccional. Para demostrar la aplicación de imágenes de células vivas con una resolución espacial de alta temperatura, aquí, una célula en verde que exhibe una expresión bifásica de PIP tres. En respuesta a la exposición a un gradiente A cíclico constante en rojo.

Esta imagen muestra las regiones de interés para la medición de la cinética de la producción de PIP tres. La cinética de la producción de PIP tres en la parte delantera y trasera de las células tras la exposición a un gradiente constante se presenta aquí con la producción de PIP tres en la parte delantera y trasera, representada en negro y gris respectivamente. Aplicando imágenes de células vivas, hemos medido sistemáticamente la dinámica de una red de señalización específica de detección direccional desde la estimulación cíclica A MP hasta la producción de PIP tres.

Este esquema muestra la red de señalización de detección direccional desde la estimulación cíclica A MP hasta la producción de PIP tres. La cinética de cada componente se presenta con una línea del mismo color. En esta primera figura, se representa en esta película cómo una estimulación A MP cíclica aplicada uniformemente desencadena una activación persistente de la proteína G, que desencadena una producción transitoria de PIP tres.

Un arco iris de imágenes de células G y pH muestra que una estimulación cíclica de A MP aplicada uniformemente desencadena una activación persistente de la proteína G en la periferia celular, que simultáneamente desencadena una producción transitoria de PIP tres. Aquí, se muestra la cinética de la activación de la proteína G y la producción de PIP tres sobre una estimulación cíclica de A MP aplicada uniformemente. Al intentar estos experimentos, es importante tener en cuenta que la clave es obtener células reactivas, diferentes antecedentes genéticos de las células y condiciones ambientales.

Las condiciones de adquisición de imágenes cambian la fisiología de la célula y pueden hacer que la célula responda menos. Siguiendo este procedimiento, el modelado computacional se puede aplicar para responder preguntas adicionales, como cómo las interacciones dinámicas dentro de una red de señalización dan lugar al comportamiento de una célula. Estos métodos allanan el camino para los investigadores en el campo de los impuestos a la quimioterapia eucariota.

Podemos desarrollar un modelo computacional de detección de quimioatrayentes. Este modelo se puede utilizar para simular la dinámica de un evento de señalización. La interacción entre el refinamiento del modelo y la medición del estilo de vida puede conducir a una comprensión más profunda de los impuestos sobre la quimioterapia.

Después de ver este video, esperamos que tenga una mejor comprensión de cómo aplicar la microscopía confocal de fluorescencia avanzada para monitorear el evento de señalización en células vivas. Con suerte, puedes aplicar este método a tu estudio.