Name: Receptor de imagen acoplados a proteína G (GPCR) mediada por eventos de señalización que la quimiotaxis de control de Dictyostelium discoideum /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprende a aplicar microscopía confocal de fluorescencia avanzada para estudiar la quimiotaxis en células de Dictyostelium discoideum. Este método permite visualizar dinámicas espaciotemporales de eventos de señalización mediados por GPCR en tiempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo es apoyado por el fondo de intramuros del NIAID, NIH.

1. Preparación de células competentes quimiotáctica de Dictyostelium discoideum <ol><li> Para generar células D. discoideum que son quimiotácticas al campo quimiotáctica, las células de la cosecha que crece en D3-T de medios enriquecidos a partir de una cultura de agitación a 22 ° C. </li><li> Lavar las células dos veces en buffer no nutrientes en el desarrollo (DB buffer conteniendo 5 mM Na 2 HPO 4, 5 mM KH 2 PO 4, 2 mM de MgCl 2 y 0,1 mM CaCl 2). </li><li> Vuelva a suspender las células en un tampón de DB a una densidad de 2x10 7 células / ml. </li><li> Agitar 10 ml de células en un frasco de 250 ml a 100 rpm a 22 ° C durante una hora. </li><li> Entregar 100 l de 7,5 M de valores de AMPc a las 10 células ml cada seis minutos más de 6 horas para conseguir una concentración final de 75 nM de cAMP, un proceso designado como el tratamiento de cAMP pulso. Después de 5-6 horas de tratamiento AMPc pulso, D. células discoideum se quimiotáctica competentes hacia gradiente de cAMP. </li><li> Recoger las células por centrifugación a 200 g por 5 min y luego suspender las células con tampón DB contiene 2,5 mM de cafeína, y agitar a 200 rpm a 22 ° C durante 20 minutos para basolate celular a una situación quimiotácticos. </li></ol> 2. Imágenes chemotaxing células en un gradiente quimiotáctico visible y manipulable <ol><li> Relleno de una micropipeta con un recién preparada la solución de 30 l de AMPc M 1 y Alexa 594 en 0.1μg/μl en tampón DB. </li><li> Conecte el Femtotip al titular de la micropipeta y conectar el tubo a un aparato de presión de alimentación, sistema de Eppendorf FemtoJet. </li><li> Fije el conjunto de micropipeta a un micromanipulador (Eppendorf TransferMan NK2) motorizados micromanipulador para proporcionar una presión constante a fin de establecer un gradiente estable. </li><li> Montar una cámara de un bien Labtek lleno con 6 ml de tampón de DB en una lente de 40x de aceite en un microscopio confocal y el uso brillante campo de la óptica, el centro de la Femtotip en el campo de visión. </li><li> Abra el suministro de presión y establecer la compensación de presión (Pc) por 70 hPa para establecer un gradiente de la cAMP / Alexa 594 mezcla. </li><li> Visualizar gradiente de AMPc por el control de la mezcla de concentración deseada de AMPc y Alexa 594 fluorescencia utilizando la excitación con una línea de 543 nm láser. </li><li> El uso de auto-posicionamiento en función de la micropipeta micromanipulador para poner a las posiciones deseadas y los puso como la posición 1, posición 2, y 3 posiciones para manipular el gradiente de la celda que están expuestos. </li></ol> 3. Sistema inmóvil de células no polarizadas facilita eventos de imagen de señalización implicadas en la detección de gradiente de AMPc <ol><li> Después de tratamiento con cafeína, eliminar una parte alícuota de las células y se centrifuga a 500 g por 3 min. </li><li> Quitar buffer y diluir las células a 5x10 5 células / ml con tampón DB fresco que contiene 2,5 mM de cafeína. </li><li> Aplicar 1 ml de suspensión celular a una cámara de un solo bien o 0,4 ml a cada pocillo de una cámara de cuatro pozos. </li><li> Permiten que las células se adhieran durante 10 minutos, con cuidado de la pipeta tampón para eliminar las células sueltas y reemplazar con el mismo volumen. </li><li> Localizar las células deseadas bajo el microscopio y empezar de imágenes. </li><li> Para un experimento diseñado para controlar la dinámica de componentes de señalización en las células de la exposición a un gradiente estable, el tratamiento de las células con 5,0 M (concentración final) latrunculin B durante 10 minutos antes de los experimentos. </li></ol> 4. Heterotrimeric simultánea de vigilancia y activación de la proteína G PIP 3 producción <ol><li> AMPc pulso del desarrollo de células co-expresando GαCFP y YFPGβ (células G) y las células que expresan PIP 3 indicador de PH-GFP (células PH) 7. </li><li> Mezclar estos dos tipos de células con una relación 1:1 y la placa de ellos en cámaras de un solo bien o 4 bien. </li><li> Crear y guardar las emisiones de huellas dactilares curva de referencia de la PPC, YFP y las buenas prácticas agrarias con la pila Lambda modo de adquisición en el rango espectral desde 464 hasta 624 nm con una anchura de 10 nm. </li><li> Al mismo tiempo la imagen G activación de la proteína en las células G y PIP 3 en células PH se utiliza con el modo de adquisición de Lambda misma pila en el rango espectral desde 464 hasta 544 nm con incrementos de 10 nm. </li><li> Aplicar la función desmezcla lineal de Zeiss con software 510META salvado CFPand YFP y las huellas digitales de emisión para calcular matemáticamente la contribución de cada fluoróforo en la pila de Lambda para separar la política pesquera común y la intensidad YFP en canales individuales de G. </li><li> Con la misma estrategia, aplicar la función desmezcla lineal utilizando GFP salvado y las huellas digitales de fondo de emisión para calcular matemáticamente la intensidad de GFP en las células PH. </li></ol> 5. Los resultados representativos: <ol><li> Un excelente sistema modelo de D. discoideum de quimiotaxis mediada por GPCR. Una ameba social, D. discoideum exhibe una quimiotaxis en huelga durante el ciclo de vida. Debido a sus ventajas genéticas y bioquímicas, D. D proporciona un potente sistema para estudiar la quimiotaxis. </li><li> Quimiotaxis de las células bajo un campo visible y manipulable chemoattract. Aquí, lo primero que muestran una metodología sencilla para obtener una relación lineal entre los campos de concentración y la intensidad de un tinte fluorescente Alexa 594 por una serie de dilución de AMPc M 2 con 10 mg / ml Alexa 594 (Fig. 2A). A continuación, ofrecemos una forma sencilla de visualizar la pendiente, por otra parte, para establecer una medida cuantitativa de la concentración de cAMP de un gradiente de la intensidad de Alexa 594 (Fig. fig. 2B). </li><li> Motilidad celular no se acopla con la polarización celular y la detección de dirección. Un inhibidor de la polimerización de la actina elimina preexistentes polaridad morfológica y también evita el movimiento de células, manteniendo la capacidad de las células de detección de dirección (Fig. 3A). El empleo de la estimulación AMPc visible y manipulable garantiza la entrada, por ejemplo, los estímulos aplicados de manera uniforme o un degradado. Este método permite un análisis cuantitativo de AMPc inducida por la redistribución de los componentes clave de señalización en el mecanismo de detección de gradiente. Mide la dinámica espacio-temporal de los componentes de señalización nos permite entender cómo la red de señalización logra la adaptación a los estímulos uniforme mientras que la generación polarizada respuestas bioquímicas de los gradientes (Fig. 3B). </li><li> Medidas sistémicas de la cinética de chemosensing red de señalización con la exposición a un gradiente estable. Es muy importante para medir la dinámica / cinética de la dirección de detección de componentes de señalización para entender cómo cada componente contribuye a la creación de la polarización intracelular cuando las células de la experiencia primer gradiente. Aplicación de imágenes de células vivas, con un tempo-espacial de alta resolución, lo primero que muestran una bifásica PIP3 producción de células que se expone a un gradiente de AMPc constante (Fig. 4A-C). La aplicación de imágenes de células vivas, hemos medido sistemáticamente la dinámica de la dirección de detección de la red de señalización específica de la estimulación de la producción de cAMP a PIP3 (Fig. 4D, E). </li><li> El monitoreo simultáneo heterotrimeric activación de la proteína G y PIP 3 producción a la estimulación AMPc aplicación uniforme. Förster resonancia de transferencia de energía (FRET abreviado) proporciona un método eficiente para controlar la activación de la proteína G heterotrimeric (disociación) a la estimulación del AMPc. En este sentido, se describe una práctica fácil de adoptar el sistema para la medición simultánea de la activación de proteínas G heterotrimeric y la producción de PIP 3 por el control de la FRET cambio y el desplazamiento de la membrana de la sonda PIP 3, PH-GFP en las células G y PH, respectivamente (Fig. 5 ). Una estimulación AMPc aplicación uniforme provoca una persistente activación de la proteína G, mientras que desencadena una PIP transitoria 3 de producción. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Un sistema excelente modelo de D. discoideum de quimiotaxis mediada por GPCR. A. Esquema muestra una vía de señalización breve de detección de dirección. B. gradiente de AMPc induce la quimiotaxis rápida de D. células discoideum. Células expresan PIP 3 de la sonda, PH-GFP (Green). Gradiente (rojo) se visualiza por Alexa 594. Barra de escala = 50 micras. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: La quimiotaxis de las células bajo un campo visible y manipulable chemoattract. A. El gráfico muestra una relación lineal entre los campos de concentración y la intensidad de un tinte fluorescente Alexa 594 por una serie de dilución de AMPc M 2 con 10 mg / mL Alexa 594. Medición B. cuantitativa de los campos de concentración de un gradiente de la relación lineal de los campos de concentración y la intensidad de fluorescencia tinte Alexa 594 en A. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: la motilidad celular no se acopla con la polarización celular y la detección de dirección. A. Imagen muestra que las células inmóviles por el tratamiento de inhibidor de la polimerización de la actina B latrunculin mantener la capacidad de detección de dirección. Células expresan PIP 3 de la sonda, PH-GFP (Green). Gradiente (rojo) se visualiza por Alexa 594. B. AMPc manipulables estimulación e inmóvil sistema celular permite hacer frente a cuestiones clave de la detección de dirección. Barra de escala = 10μm. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: Medidas sistémicas de la cinética de chemosensing red de señalización con la exposición a un gradiente estable. A. Montaje muestra un PIP bifásica producción de 3 (verde) de la célula que está expuesto a un gradiente de AMPc constante (rojo). B. La imagen muestra las regiones de interés (ROI) para la medición de la cinética de la producción de PIP 3 se presentan en C. C . cinética oPIP f 3 en la producción de las células expuestas a un gradiente estable. D. esquema muestra la red de señalización de los sensores de dirección de la estimulación del AMPc a la producción de PIP 3. Su cinética de la exposición a un gradiente constante se presenta en las líneas del mismo color sólido en E. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5: Simultánea de monitoreo multi-eventos de las redes de señalización de GPCR. A. Esquema muestra la medición simultánea de la activación de proteínas G heterotrimeric y la producción de PIP 3 por el control de la FRET cambio y el desplazamiento de la membrana de la sonda PIP3, PH-GFP en las células G y PH, respectivamente. B. Montaje de imágenes de arco iris de G y las células PH muestra que la estimulación AMPc aplicación uniforme provoca una persistente activación de la proteína G en el periférico de células, mientras que provoca un transitorio PIP3 producción. Los dos momentos son antes (0s) y después de la estimulación de 4.9s, y 10.2s 20.4s. C. Cinética de la activación de la proteína G y PIP3 de producción en una estimulación AMPc aplicación uniforme.

<ol><li>Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+regulation+of+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial regulation of chemotaxis.</a> Dev Cell. 3, 469-469 (2002).</li>
<li>Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+leukocyte+chemoattractant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors.</a> Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).</li>
<li>Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-linked+signaling+pathways+control+the+developmental+program+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium.</a> Neuron. 12, 235-235 (1994).</li>
<li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%2C+chemokine+receptors+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-1 (2008).</li>
<li>Meier-Schellersheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+local+regulation+in+chemosensing+revealed+by+a+new+molecular+interaction-based+modeling+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method.</a> PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).</li>
<li>Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+mechanism+of+a+GPCR+and+a+heterotrimeric+G+protein+during+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Sci Signal. 3, 71-71 (2010).</li>
<li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+single+live+cells+reveals+spatiotemporal+dynamics+of+multistep+signaling+events+of+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).</li>
<li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+controlled+inhibitory+mechanisms+are+involved+in+eukaryotic+GPCR-mediated+chemosensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing.</a> J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).</li>
<li>Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+G+protein+betagamma+complex+in+living+cells+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis.</a> Science. 287, 1034-1034 (2000).</li>
<li>Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+activation+of+heterotrimeric+G-proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells.</a> Science. 291, 2408-2408 (2001).</li>
<li>Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phosphatidylinositol+3%27+kinase+and+a+downstream+pleckstrin+homology+domain-containing+protein+in+controlling+chemotaxis+in+dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium.</a> J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).</li>
<li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+PLC-beta2+and+-beta3+and+PI3Kgamma+in+chemoattractant-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction.</a> Science. 287, 1046-1046 (2000).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).</li>
<li>Meili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattractant-mediated+transient+activation+and+membrane+localization+of+Akt%2FPKB+is+required+for+efficient+chemotaxis+to+cAMP+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium.</a> EMBO J. 18, 2092-2092 Forthcoming.</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein+signaling+events+are+activated+at+the+leading+edge+of+chemotactic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells.</a> Cell. 95, 81-81 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+regulation+of+3-phosphoinositides+by+PI+3-kinase+and+PTEN+mediates+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis.</a> Cell. 109, 611-611 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PTEN+mediates+sensing+of+chemoattractant+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients.</a> Cell. 109, 599-599 (2002).</li>
<li>Haastert, P. J. V. an, Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%3A+signalling+the+way+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis: signalling the way forward.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El proceso de llegar a la etapa quimiotáctica de las células competentes De tipo salvaje D. células discoideum, se tarda unos 5 a 6 horas pulsando el desarrollo a temperatura ambiente para inducir a un estado competente bien quimiotácticas durante el cual las células presentan una morfología celular y la migración celular polarizada y rápida (Fig. 1). Varios factores, tales como los campos de concentración de pulso, temperatura, y diferentes fondos genéticos, pueden afectar el...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> D3-T medios de cultivo </td><td> KD Médico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cafeína </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Latrunculin B </td><td> Las sondas moleculares </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Alexa 594 </td><td> Las sondas moleculares </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AMPc </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ChronTrol XT temporizador programable </td><td> ChronTrol Corp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miniplus 3 bomba peristáltica </td><td> Gilbson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plataforma agitador rotatorio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet fuente de presión capilar se </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> De uno y cuatro bien Lab-Tek II cubreobjetos cámaras </td><td> Nalge Nunc Internacional </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 META microscopio de fluorescencia o equivalente </td><td> Zeiss </td><td></td><td> un 40X 60X o 1.3 NA 1.4 NA petróleo DIC Plan-Neofluar lente objetivo </td></tr><tr><td> Olympus X81 o equivalente </td><td> Olimpo </td><td></td><td> Requiere un 100X 1,47 NA TIRF lente del objetivo </td></tr></tbody></table>

receptor de imagen acoplados a proteína g (gpcr) mediada por eventos de señalización que la quimiotaxis de control de dictyostelium discoideum</em

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Muchas células eucariotas pueden detectar gradientes de señales químicas en sus entornos y en consecuencia la migración 1. Esta migración de las células guiadas se conoce como quimiotaxis, que es esencial para varias células para llevar a cabo sus funciones, como el tráfico de las células inmunes y los patrones de las células neuronales 2, 3. Una gran familia de receptores de la proteína G-acoplada (GPCR) detecta variable de péptidos pequeños, conocidos como quimiocinas, para dirigir la migración celular in vivo 4. El objetivo final de la quimiotaxis de investigación es entender cómo un GPCR sentidos maquinaria gradientes de quimioquinas y los controles de los eventos de señalización que conducen a la quimiotaxis. Para ello, utilizamos técnicas de imagen para controlar, en tiempo real, las concentraciones de espacio-temporal del movimiento quimiotácticos de células, en un gradiente de quimioatrayente, mediada por la activación de GPCR heterotrimeric G-proteína, y los eventos intracelulares de señalización implicadas en la quimiotaxis de las células eucariotas 5.8 . El organismo simple eucariotas, Dictyostelium discoideum, muestra comportamientos quimiotaxis que son similares a los de los leucocitos, y D. discoideum es un modelo de sistema clave para el estudio de la quimiotaxis de eucariotas. Como amebas de vida libre, D. las células se dividen discoideum en medio rico. Sobre el hambre, las células entran en un programa de desarrollo en el que agregada a través de AMPc mediada la quimiotaxis para formar estructuras multicullular. Muchos de los componentes involucrados en la quimiotaxis de los campamentos han sido identificados en el D. discoideum. La unión del AMPc a un GPCR (CAR1) induce la disociación de heterotrimeric proteínas G en Gγ y 7 subunidades Gβγ, 9, 10. Subunidades Gβγ activar Ras, que a su vez activa la PI3K, convirtiendo PIP PIP 2 en 3 en la membrana celular 11-13. PIP 3 sirven como sitios de unión para las proteínas con homología pleckstrin (PH) dominios, con lo que reclutar a estas proteínas de la membrana 14, 15. La activación de receptores CAR1 también controla las asociaciones de la membrana de PTEN, que desfosforila PIP PIP 3 a 2 16, 17. Los mecanismos moleculares que son conservadas evolutivamente en las quimiocinas GPCR mediada por quimiotaxis de las células humanas, como los neutrófilos 18. Se presentan los siguientes métodos para el estudio de la quimiotaxis de D. células discoideum. 1. Preparación de las células componentes quimiotácticos. 2. Imágenes de la quimiotaxis de las células en un gradiente de cAMP. 3. Vigilancia de la activación inducida por GPCR de heterotrimeric G-proteína en las células individuales en vivo. 4. Imágenes quimioatrayente activada por PIP dinámica 3 respuestas en una sola las células vivas en tiempo real. Nuestra desarrollado métodos de imagen se pueden aplicar para estudiar la quimiotaxis de los leucocitos humanos.

A continuación, describimos los métodos detallados en vivo de imágenes de células para la investigación de la quimiotaxis. Se presenta fluorescencia microscópica métodos para controlar la dinámica espacio-temporal de los eventos de señalización en las células que migran. La medición de la señalización de eventos nos permite entender mejor cómo una red de señalización de GPCR logra gradiente de detección de factores quimiotácticos y los controles de la migración direccional de las células eucariotas.

Receptor de imagen acoplados a proteína G (GPCR) mediada por eventos de señalización que la quimiotaxis de control de Dictyostelium discoideum</em

Muchas células eucariotas pueden detectar gradientes de señales químicas en sus entornos y migrar en consecuencia 1. Esta migración celular guiada se denomina...

El objetivo general de este procedimiento es aplicar microscopía confocal de fluorescencia avanzada para monitorear la dinámica espacio-temporal de los eventos de señalización durante la quimiosensación en células de Dictyostelium discoideum. Primero, se preparan células de Dictyostelium discoideum quimiotácticamente competentes. A continuación, se genera un gradiente controlado de quimioatractivo y se imagina para establecer una relación lineal entre la concentración de quimioatractivo y la intensidad fluorescente del quimioatractivo. El tercer paso consiste en obtener un sistema de células inmóviles para imaginar los eventos de señalización implicados en la detección del gradiente de AMP cíclico.El paso final consiste en monitorear simultáneamente dos eventos de señalización controlados por receptores acoplados a proteínas G en células vivas: la activación de la proteína G heterotrimérica y la producción de PIP tres. Finalmente, cambios espacio-temporales en las intensidades de fluorescencia en células individuales que son estimuladas con un quimioatractivo. El AMP cíclico puede visualizarse mediante imágenes de células vivas utilizando microscopía confocal avanzada.La principal ventaja de esta técnica consiste en permitirnos obtener información espaciotemporal sobre eventos de señalización en células vivas. Estas mediciones en células vivas permiten una mejor comprensión de cómo la red de señalización de A-G-P-C-R puede detectar un componente quimiotáctico y generar respuestas adecuadas. El procedimiento será demostrado por el Dr. Shu, experto en métodos de imagen en células vivas, para generar células de dsco dium que sean quimiotácticas hacia el quimioatractante ciclico A MP. Recolecte células en crecimiento en medio D tres trich a partir de un cultivo agitado a 22 grados Celsius.Lave las células dos veces en tampón de desarrollo sin nutrientes mediante centrifugación a 400 G durante cinco minutos. A temperatura ambiente, resuspenda las células en el tampón DB a una densidad de dos veces 10 a la séptima células por mililitro. Transfiera 20 millones de células en 10 mililitros de tampón de desarrollo a un matraz de 250 mililitros, y luego agite las células a 100 RPM a 22 grados Celsius durante una hora.Luego, administre 100 microlitros de una solución stock de AMP cíclico de 7,5 micromolar a los 10 mililitros de células cada seis minutos durante las próximas seis horas para alcanzar una concentración final de 75 amolares de AMP cíclico. Ahora, recoja las células competentes quimioatractivas con AMP cíclico mediante centrifugación, esta vez a 200 G, y luego re suspenda las células con tampón DB que contenga cafeína al 2,5 milimolar. Agite nuevamente las células a 22 grados Celsius durante 20 minutos, esta vez a 200 RPM, para aclimatar las células para quimiotaxis.Primero, rellene una micropipeta con una solución recién preparada de 30 mililitros de AMP cíclico de un micromolar y Alexa 594 a 0,1 microgramos por microlitro en tampón DB. Luego, sujete una punta Femto a un porta-micropipetas y conecte el tubo a un aparato de suministro de presión. Para establecer un gradiente estable, fije el conjunto de la micropipeta a un micromanipulador motorizado.Llene una cámara de laboratorio de una cavidad con seis mililitros de tampón DB y luego monte la cámara sobre un objetivo de inmersión en aceite de 40x en un microscopio confocal utilizando óptica de campo brillante, colocando la punta Femto en el campo de visión. A continuación, encienda la fuente de presión y ajuste la presión de compensación a 70 hectopascales para establecer un gradiente de la mezcla de AMP cíclico y Alexa 594. Visualice el gradiente de AMP cíclico monitoreando la mezcla de la concentración deseada de AMP cíclico y la fluorescencia de Alexa 594 utilizando una excitación con una línea láser de 543 nanómetros.Finalmente, utilice la función de posicionamiento automático del micromanipulador para colocar la micropipeta en las posiciones deseadas y establezca la posición uno, la posición dos y la posición tres, con el fin de manipular el gradiente al que se exponen las células. Tras el tratamiento con cafeína, retire una alícuota de células y centrifugue las células a 500 G durante tres minutos. A temperatura ambiente, elimine el tampón y diluya las células hasta cinco veces 10 a la quinta células por mililitro.Con tampón DB fresco que contiene cafeína 2,5 milimolar. A continuación, aplique un mililitro de la suspensión celular a una cámara de un solo pozo. Después de permitir que las células se adhieran durante 10 minutos, retire cuidadosamente el tampón mediante pipeta para eliminar las células no adheridas y luego reemplace con el mismo volumen de tampón DB fresco con cafeína para comenzar la adquisición de imágenes, localice las células deseadas bajo el microscopio.Luego, para monitorear la dinámica de los componentes de señalización en células expuestas a un gradiente constante. Trate las células con cinco micromoles por litro de LA truculent B durante 10 minutos antes de cualquier experimento. Este esquema muestra una breve vía de señalización de detección direccional en esta película.Puede observarse cómo un gradiente cíclico de AMP induce una quimiotaxis rápida de las células de D. discost, células que expresan la sonda para PIP tres. P-H-G-F-P aparece en verde. El gradiente, tal como se visualiza mediante Alexa 594, aparece en rojo. Aquí.Un método sencillo para obtener una relación lineal entre la concentración de AMP cíclico y la intensidad de un colorante fluorescente. Se muestra una serie de diluciones de dos micromoles de AMP cíclico mezclados con 10 microgramos por mililitro de Alexa 594.A continuación, se demuestra gráficamente una forma sencilla de establecer una medición cuantitativa de la concentración cíclica de AMP en un gradiente mediante la intensidad de Alexa 594. Esta figura muestra cómo las células cuya motilidad ha sido suprimida por latrunculina B, un inhibidor de la polimerización de actina, aún mantienen su capacidad de detección direccional. Las células expresan la sonda para PIP3, P-H-G-F-P, y aparecen verdes, mientras que el gradiente en rojo se visualiza mediante Alexa 594.En este video, se puede observar cómo el uso de un sistema celular simplificado no polarizado y la estimulación cíclica manipulable de AMP puede abordar preguntas fundamentales sobre la detección direccional. Para demostrar la aplicación del microscopio de células vivas con una resolución espacial de alta velocidad, aquí se muestra una célula en verde que exhibe una expresión bifásica de PIP tres, en respuesta a la exposición a un gradiente estable de AMP cíclico en rojo.Esta imagen muestra las regiones de interés para la medición de la cinética de producción de PIP tres. Aquí se presenta la cinética de producción de PIP tres en la parte delantera y trasera de las células tras la exposición a un gradiente constante, con la producción de PIP tres en la parte delantera y trasera representada en negro y gris, respectivamente. Aplicando imágenes de células vivas, hemos medido sistemáticamente la dinámica de una red de señalización específica para la detección direccional, desde la estimulación de AMP cíclico hasta la producción de PIP tres.Este esquema muestra la red de señalización del sentido direccional desde la estimulación de AMP cíclico hasta la producción de PIP tres. La cinética de cada componente se presenta con una línea del mismo color. En esta primera figura, cómo una estimulación de AMP cíclico aplicada de manera uniforme desencadena una activación persistente de la proteína G, lo que a su vez provoca una producción transitoria de PIP tres, se representa en esta película.Una gama de imágenes de células G y pH muestra que una estimulación cíclica uniforme de AMP desencadena una activación persistente de las proteínas G en la periferia celular, lo que simultáneamente provoca una producción transitoria de PIP tres. Aquí se muestran la cinética de la activación de la proteína G y la producción de PIP tres tras una estimulación cíclica de AMP aplicada uniformemente. Al realizar estos experimentos, es importante tener en cuenta que el factor clave es obtener células reactivas, considerando diferentes antecedentes genéticos de las células y condiciones ambientales.Las condiciones de adquisición de imágenes alteran toda la fisiología celular y pueden hacer que la célula sea menos receptiva. Tras seguir este procedimiento, se puede aplicar modelado computacional para responder preguntas adicionales, como cómo las interacciones dinámicas dentro de una red de señalización dan lugar a un comportamiento celular. Estos métodos allanan el camino para investigadores en el campo de la quimiotaxis eucariota.Podemos desarrollar un modelo computacional de detección de quimioatractantes. Este modelo puede utilizarse para simular la dinámica de un evento de señalización. La interacción entre la refinación del modelo y la medición del estilo de vida puede conducir a una comprensión más profunda de las quimiotaxis.Después de ver este video, esperamos que tenga una mejor comprensión de cómo aplicar la microscopía confocal de fluorescencia avanzada para monitorear eventos de señalización en células vivas. Esperamos que pueda aplicar este método a su estudio.

imaging-g-protein-coupled-receptor-gpcr-mediated-signaling-events

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El sistema de ECIS / taxis es un sistema automatizado en tiempo real, análisis que mide la quimiotaxis celular. En este ensayo, las células se mueven por debajo de una capa de agarosa para llegar a un electrodo de destino. Movimiento celular se mide por la aparición de resistencia a 0 corriente alterna.

La medición de la quimiotaxis celular con ECIS / taxis

Un método para evaluar cuantitativamente la respuesta quimiotáctica de...

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

El ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia que aquí se describe es un sistema de cribado de la farmacología inversa medio de rendimiento para la identificación de ligando funcionalmente la activación (s) de G receptores acoplados a proteínas huérfanas (GPCRs).

Caracterización de G receptores acoplados a proteína por un ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia

ensayos de quimiotaxis visuales son esenciales para una mejor comprensión de cómo las células eucariotas controlar la migración de células direccional quimioatrayente mediada. A continuación, se describen los métodos detallados para: 1) en tiempo real, monitoreo de alta resolución de múltiples ensayos de quimiotaxis, y 2) visualizar simultáneamente el gradiente quimioatrayente y la dinámica espacio-temporal de los acontecimientos en las células HL60 neutrófilos como señalización.

Imaging G acoplados a proteínas mediada por el receptor de quimiotaxis y sus eventos de señalización en células HL60 neutrófilos como

El uso de un chip olfativo de"adaptado" para la proyección de imagen del calcio eficiente de los machos de C. elegans se describe aquí. También se muestran estudios de exposición masculina a glicerol y una feromona.

Usando un Chip de microfluidos adaptado olfativo para la proyección de imagen de la actividad Neuronal en respuesta a las feromonas en las neuronas de cabeza de macho de C. Elegans

Aquí describimos los métodos para evaluar la respuesta celular al estímulo mecánico agudo. En el análisis de microscopía, examinamos localización de biosensores marcada con fluorescencia Tras estimulación breve con esquileo del flujo. También probamos la activación de diversas proteínas de interés en respuesta a la estimulación mecánica aguda bioquímicamente.

Evaluación de Dictyostelium discoideum respuesta a estimulación mecánica aguda

El ensayo celular se describe está diseñado para la identificación del receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4)-agentes interactuantes que inhiben o estimulan, ya sea competitivo o allosterically, la intracelular Ca2 + liberación iniciada por activación de CXCR4.

Un ensayo de cinética basada en fluorescencia Ca2 + movilización para identificar G proteína-juntó el Receptor agonistas, antagonistas y moduladores alostéricos

S1P ejerce sus diversos efectos fisiológicos a través de la subfamilia de receptores S1P (S1PRs). Aquí, se describe una tubería para exponer las estructuras y la función de los S1PR.

Una tubería para investigar las estructuras y vías de señalización de los receptores de esfingosina 1-fosfato

En este trabajo, se describe un ensayo de fluorescencia de calcio intracelular de alto rendimiento para placas de 384 pocillos para examinar bibliotecas de moléculas pequeñas en receptores acoplados a proteínas G recombinantes (GPCR). El objetivo, el receptor de cinina de la garrapata de la fiebre del ganado, Rhipicephalus microplus, se expresa en las células CHO-K1. Este ensayo identifica agonistas y antagonistas utilizando las mismas células en un ensayo de "doble adición".

Un ensayo de fluorescencia de calcio de "doble adición" para el cribado de alto rendimiento de receptores acoplados a proteínas G recombinantes

Mediante el empleo de un espectro resuelto de dos fotones sistema de imágenes de microscopía, a nivel de píxel de mapas de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) se obtienen eficiencias de las células que expresan receptores de membrana, la hipótesis de que forma oligomérica homo-complejos. Mapas de la FRET eficiencia, son capaces de estimar la información sobre el complejo estequiométrico oligómero en estudio.

En la cuantificación in vivo de interacciones de proteínas G del receptor acoplado con espectralmente resuelve de dos fotones de Microscopía

Aprende a aplicar microscopía confocal de fluorescencia avanzada para estudiar la quimiotaxis en células de Dictyostelium discoideum. Este método permite visualizar dinámicas espaciotemporales de eventos de señalización mediados por GPCR en tiempo real.

Receptor de imagen acoplados a proteína G (GPCR) mediada por eventos de señalización que la quimiotaxis de control de Dictyostelium discoideum /em (Video) | JoVE Journal

Receptor de imagen acoplados a proteína G (GPCR) mediada por eventos de señalización que la quimiotaxis de control de Dictyostelium discoideum

Explorar más videos