El seguimiento de deformaciones morfogenética del tejido en el embrión de pollo temprano

El objetivo general de las técnicas presentadas aquí es marcar y cultivar tejidos embrionarios para medir la deformación morfogenética durante el desarrollo temprano. Para el cultivo del embrión de pollo en estadios iniciales, comience por extraer el embrión del huevo utilizando un método con portador de papel filtro. Dependiendo de la aplicación experimental, marque el embrión extraído con colorantes lipofílicos fluorescentes administrados mediante partículas magnéticas de hierro o con microesferas de poliestireno. A continuación, siga los marcadores durante el cultivo mediante microscopía de fluorescencia o imágenes de tomografía de coherencia óptica.

Los mapas de deformación morfogenética resultantes del procesamiento de imágenes indican regiones de alargamiento, acortamiento y cizalladura del tejido tanto en dos como en tres dimensiones. Hola, me llamo Ben Philis y soy estudiante de posgrado en el laboratorio del Dr. Larry Tabor en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Washington en St. Louis. Antes de comenzar este tipo de experimentos, es importante considerar las técnicas relevantes de cultivo celular en su sistema modelo, las modalidades de imagen a las que podría tener acceso y también el tipo de datos que desea obtener de sus experimentos.

Por ejemplo, ¿le interesa analizar deformaciones del tejido en dos o tres dimensiones? Abordamos algunas de estas preguntas aquí hoy mostrando dos técnicas complementarias de marcado en el embrión temprano de pollo. Hola, mi nombre es Víctor Varner, y trabajo en el laboratorio del Dr. Larry Tabor en la Universidad de Washington en San Luis.

En ambas técnicas, marcamos rápida y simultáneamente cientos de células en el embrión temprano de pollo. Seguir el movimiento de estas marcas nos permite no solo determinar los tejidos en los que estas células finalmente se establecen, sino también cuantificar la deformación a nivel tisular que moldea al embrión temprano. Primero, incubar los huevos en orientación longitudinal hasta la fase deseada según la definición de Hamburger y Hamilton.

Rompa la base del huevo contra el borde de una placa de Petri de 150 milímetros. Separe la cáscara por la parte inferior, vierta el contenido del huevo en la placa y, utilizando pinzas romas, retire el albúmina viscosa más espesa del yema. Ahora haga perforaciones a través del centro de un papel de filtro circular.

Coloque uno de los anillos de papel de filtro sobre la yema de modo que el embrión sea visible a través del orificio central del anillo. Recorte alrededor del perímetro exterior del anillo de papel de filtro con tijeras microquirúrgicas. Luego, retire el papel con el embrión adherido de la yema usando pinzas finas y sumerja suavemente el embrión en un baño de PBS. Para eliminar partículas adheridas de yema, transfiera el conjunto de papel de filtro a una placa de cultivo de 35 milímetros.

Colocándolo con el lado ventral hacia arriba, coloque el embrión con un segundo anillo de papel filtro. Fíjelo con un anillo metálico y sumerja el embrión en medio de cultivo. Si el embrión no está completamente sumergido, la geometría del tejido y la morfogénesis subsiguiente pueden alterarse considerablemente debido a cargas anormalmente altas de tensión superficial.

Durante el cultivo, utilizando un microscopio de campo claro, verifique la morfología adecuada y la etapa embrionaria. Primero, tome una pequeña cantidad de polvo de hierro y agregue unas gotas de tinte saturado y alcohol, y seque al aire con la punta de una micropipeta estirada. Desagregue las partículas de hierro aglomeradas y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga.

Después de varios lavados cubiertos con agua ionizada, coloque el embrión recolectado con la cara dorsal hacia arriba en una placa de cultivo de 35 milímetros cubierta con una capa abundante de medio de cultivo. Bajo un microscopio estereoscópico, utilice la aguja de vidrio para eliminar la membrana vilina y exponer las células ectodérmicas. Ahora aspire una columna de partículas de hierro marcadas en una pipeta de vidrio.

Utilizando el microscopio estereoscópico, sumerja la pipeta y colóquela justo encima del embrión. Gire la pipeta lentamente hacia adelante y hacia atrás entre las yemas de los dedos para espolvorear partículas sobre el embrión. Tras una incubación de 10 minutos a 37 grados Celsius, retire las partículas utilizando un imán potente.

Si es necesario, sujete el imán a un par de pinzas magnéticas finas y utilice las pinzas imantadas para retirar cuidadosamente cualquier partícula residual de hierro. Proceda a obtener imágenes de campo claro y fluorescentes del embrión. Con una aguja de calibre 22.

Extraiga una solución de microesferas negras de 10 micrómetros de diámetro en PBS hacia una jeringa de 10 cc. Luego, biselar las puntas de las agujas de vidrio estiradas utilizando un disco duro de computadora y llénelas con la solución de microesferas. Golpee suavemente la micropipeta para que la solución alcance la punta, utilizando un micromanipulador.

Coloque la aguja de vidrio en el mismo campo de visión que el embrión. Confirme el flujo de microesferas fuera de la punta de la pipeta. Ahora inserte la punta de la pipeta en la luz del tubo neural.

Teniendo cuidado de no perforar el suelo ventral del tejido. Observe la hinchazón transitoria del tejido a medida que las perlas y el líquido entran en la luz. Luego retire rápidamente la aguja de vidrio.

Finalmente, verifique una densidad suficiente de microesferas en la luz interna del tubo neural. Utilizando un microscopio de campo brillante, deje que las microesferas sedimenten durante 20 a 30 minutos antes de adquirir imágenes de campo brillante o un conjunto de datos de tomografía de coherencia óptica. Después de obtener las primeras imágenes, coloque hasta 7 placas de cultivo de 35 milímetros con muestras dentro de una placa de Petri de 150 milímetros y coloque todo el conjunto en una bolsa de plástico pequeña.

Agregue gotas de agua desionizada a la bolsa para humidificación, y luego llene la bolsa con una mezcla de 95% oxígeno y 5% dióxido de carbono. Coloque los embriones en una incubadora a 37 grados Celsius hasta el siguiente punto de tiempo de imagen; coloque los embriones etiquetados en un platillo delta T que contenga 1,2 mililitros de medio de cultivo y cubra el platillo con una tapa de vidrio mantenida a 37 grados Celsius. Suprafusione el embrión con una mezcla de gas 95%O₂ 5%CO₂ suministrada por un dispositivo de bomba miniatura con flujo variable. Ahora configure el software para adquirir automáticamente imágenes a intervalos de tiempo deseados.

A lo largo del experimento, las etiquetas pueden rastrearse de forma automática o manual, y se pueden calcular mapas de deformación morfogenética para las coordenadas de los marcadores. Aquí, se utilizó la técnica de partículas de hierro para etiquetar y rastrear el movimiento de células electrodérmicas durante la formación del pliegue cefálico. En el embrión de pollo temprano, las células marcadas con fluorescencia se distribuyeron a través de todo el embrión.

Se capturaron imágenes de campo brillante y fluorescentes del embrión a intervalos diferentes durante el cultivo ex ovo. Para monitorear los movimientos de las etiquetas del tracto. Los datos acumulativos permiten el cálculo de las distribuciones cambiantes de tensión morfogenética durante la formación del pliegue cefálico.

De manera similar, se utilizó la técnica de microesferas de poliestireno para rastrear los movimientos del tejido en el límite medio del rombencéfalo del cerebro embrionario de pollo. Téngase en cuenta que este método es capaz de manejar deformaciones claramente tridimensionales, ya que las microesferas tienden a adherirse a todos los lados del lumen interno del cerebro. Tras rastrear el movimiento de las microesferas durante seis horas, las coordenadas de los marcadores permiten calcular las deformaciones, caracterizando así la deformación del tejido en las direcciones longitudinal y circunferencial.

Después de ver este video, debería tener una buena idea de algunos de los pasos experimentales necesarios para implementar su propio cultivo de tejidos y marcado. Las técnicas de protocolo presentadas aquí son particularmente ventajosas porque son mínimamente invasivas para los tejidos nativos y también implican bajos costos y materiales fácilmente disponibles. Estos experimentos son particularmente útiles para estudios sobre la mecánica del desarrollo embrionario.

Dado que los campos de deformación calculados utilizando el movimiento rastreado de células marcadas pueden utilizarse tanto para probar como para construir modelos físicos de la morfogénesis.