Name: El seguimiento de deformaciones morfogenética del tejido en el embrión de pollo temprano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprenda a etiquetar y cultivar tejidos embrionarios de pollo para medir deformaciones morfogenéticas mediante microscopía de fluorescencia y tomografía de coherencia óptica. Estas técnicas permiten analizar dinámicas tisulares en 2D y 3D.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones R01 GM075200 y HL083393 R01 (LAT). Reconocemos el apoyo de becas para BAF de los NIH T90 DA022871 y el Instituto de Radiología Mallinckrodt, y VDV desde la concesión 09PRE2060795 de la Asociación Americana del Corazón.

1. Preparación Experimental generales <ol><li> Preparar el medio de cultivo de tejidos en la campana de flujo laminar. <ol><li> Diluir medio modificado de Dulbecco Eagle (DMEM) (1 botella de L con 4,5 g / l de glucosa, bicarbonato de sodio, y L-glutamina). Añadir 10 ml de penicilina / estreptomicina / antibióticos neomicina. </li><li> Tomar 100 ml de DMEM con una pipeta de transferencia estéril y reemplazar con 100 ml de suero de pollo. </li><li> Alícuota del DMEM/10% de pollo suero / 1% de los antibióticos en 15 viales estériles ml y congelar. </li></ol></li><li> Preparar tampón fosfato salino (PBS) suplementado con calcio y magnesio. Mezclar 100 ml de PBS 10X, 900 ml de agua desionizada, y 1 ml de una solución concentrada de calcio y magnesio (100 mg / mL de CaCl 2 • 2H 2 O, 100mg/ml de MgCl 2 • 6H 2 O). </li><li> Incubar los huevos en una orientación longitudinal a la etapa deseada según la definición de Hamburger y Hamilton 1 (es decir 23 a 25 horas para la etapa HH 5, o 42-48 Horas para las etapas HH 11-12). </li><li> Eliminar los embriones de los huevos con el método del papel soporte del filtro. <ol><li> Romper la parte inferior del huevo en el lado de la A150 mm placa de Petri. Separar la cáscara de la parte inferior y vaciar el contenido del huevo en el plato. </li><li> Retire la más gruesa, viscosa albúmina del huevo con unas pinzas romas. </li><li> Cortar círculos de Whatman # 2 el papel de filtro 2-3 cm. de diámetro. El uso de un solo taladro, agujeros en el centro del papel de filtro. Coloque uno de los anillos de papel de filtro en la yema de un modo que mantiene el embrión visible a través del agujero central en el ring. </li><li> Corte alrededor del diámetro exterior del papel de filtro con micro tijeras. Retire el papel de la yema de huevo con unas pinzas finas. </li><li> Enjuague suavemente el embrión en PBS para eliminar las partículas adheridas yema de huevo. (HH5 embriones puede necesitar para disfrutar el tiempo de 15-20 minutos para eliminar la yema residual). Retire el conjunto del filtro de papel del baño y se coloca con la parte ventral en un35 mm placa de cultivo. Coloque un segundo anillo de papel de filtro encima de la primera, intercalando el embrión entre los anillos. Poner un anillo de metal alrededor de la parte exterior del sándwich de papel de filtro (≈ 1,5 a 2 cm de diámetro) para obtener el embrión. </li><li> Sumerja el embrión en el medio de cultivo. Verificar la morfología adecuada y la etapa embrionaria con un microscopio de campo claro. </li></ol></li><li> Use un extractor de pipeta para preparar finas agujas de vidrio punta (1,5 mm de diámetro interior) (Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota FL) para las disecciones de tejidos posterior y el etiquetado. </li></ol> 2. DII Etiquetado de HH Etapa 5 embriones con partículas de hierro magnético <ol><li> Añadir unas gotas de DII saturadas en alcohol a una pequeña cantidad de polvo de hierro (hierro reducido, Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, Nueva Jersey) a temperatura ambiente y dejar secar. (Esto generalmente hace que las partículas de pastel juntos una vez que el alcohol se haya evaporado.) Use la punta de una micropipeta tiró para romper las partículas de hierro agrupada,transferirlos a un tubo de microcentrífuga, y enjuague varias veces y cubrir con agua desionizada. </li><li> Para etiquetar las células ectodérmicas en una etapa de HH 5 embrión, el embrión lugar cosechada (es decir, todo el conjunto de papel de filtro) dorso en una placa de cultivo de 35 mm cubierto con una capa generosa de medios de cultivo y poner el plato bajo un microscopio de disección. Use una aguja de vidrio para eliminar la membrana vitelina y exponer a las células ectodérmicas. (Tenga cuidado de no perforar embrión). </li><li> Dibuja una columna de partículas de hierro marcado (en agua desionizada) en una pipeta de Pasteur. Usando el microscopio de disección, sumergir la punta de la pipeta por debajo de la superficie del líquido y la posición justo por encima del embrión. Al girar la pipeta lentamente hacia adelante y hacia atrás entre las yemas de los dedos, se empujan las partículas fuera de la pipiette y espolvorear todo el embrión. </li><li> Una vez que el embrión está cubierto de partículas, que lo coloque en una incubadora a 37 ° C durante aproximadamente 10 minutos. Tome embrión de la incubadora unad uso de un potente imán para eliminar las partículas. </li><li> Utilizar un microscopio de fluorescencia con cámara de vídeo conectada y adecuada configuración de los filtros para adquirir el campo claro y las imágenes fluorescentes del embrión, como se muestra en la Figura 2, B. </li><li> Tenga en cuenta la densidad de la etiqueta. Si una distribución más densa se desea, utilice partículas adicionales (como se describió anteriormente) para etiquetar el embrión una vez más y extender el tiempo de incubación en consecuencia. Si las etiquetas son demasiado densas, añadir una pequeña cantidad de partículas de hierro no-marcados con el tubo de microcentrífuga lleno de partículas ya etiquetados y mezclar el contenido del tubo. Repita el proceso de etiquetado con un nuevo embrión y una vez más en cuenta la densidad de la etiqueta. </li></ol> 3. Etiquetado de microesferas de poliestireno de tomografía de coherencia óptica (OCT) de imágenes de HH11-12 embriones <ol><li> Prepare una solución de negro de 10 micras de diámetro microesferas (Polysciences Inc., Warrington, PA) en PBS en una placa de Petri de 35 mm. (Cuentas debe ser lo suficientemente grande como para generar contraste para octubreimagen, pero lo suficientemente pequeño tal que el tamaño de grano es del orden de las células individuales. Valores específicos pueden variar dependiendo de la resolución de su sistema de octubre y los tejidos en estudio). Una gota de la solución madre (2,6% de sólidos de látex) por ml de PBS es suficiente. Tire de esta solución en una jeringa de 10 cc con una aguja de calibre 22. Vortex la solución durante 30 segundos para asegurar una distribución uniforme de cuentas. </li><li> Bisel las puntas de las agujas de vidrio tirado con un disco duro del ordenador 2. Diámetro de la punta debe ser lo suficientemente grande que las cuentas pueden tener acceso desde la apertura, pero al mismo tiempo, lo más pequeño posible para minimizar la herida de tejido durante la inyección. </li><li> Llene una aguja de cristal biselado con la solución de cuentas con la jeringa. Ligera película de la micropipeta para asegurarse de que la solución se ha llegado a la punta. </li><li> El uso de un micromanipulador, colocar la aguja de vidrio en el mismo campo de visión como el embrión. Cuentas debe ser que sale de la punta de la pipeta. <ol><li> Si no beads salir de la micropipeta, puede haber una obstrucción. En este caso, repita los pasos 3.2-3.4 con una aguja de vidrio nuevo. </li><li> Si demasiados collares nublar tu campo de visión, la punta de la pipeta puede ser demasiado amplio. Repita los pasos 3.2 a 3.4 con una pipeta nueva y un nuevo embrión. </li></ol></li><li> Inserte la punta de la pipeta en el lumen del tubo de cerebro. Asegúrese de no perforar el piso ventral del tejido. Usted verá una inflamación transitoria de los tejidos como los granos y líquidos entrar la luz. Esto indica una intubación exitosa, ahora, rápidamente saque la aguja de vidrio. </li><li> Verificar una densidad suficiente de cuentas en la luz interior del tubo del cerebro usando un microscopio de campo claro. Deje que las cuentas se conforme con 20 - 30 minutos antes de proceder a la secta. 4. </li></ol> 4. Adquisición de Datos * Los siguientes métodos son adecuados para la técnica de fluorescencia de etiquetado se ha descrito anteriormente. Sin embargo, con la técnica de etiquetado de las microesferas, las cuentas se pueden desprender cuando la transferencia de muestrasentre las incubadoras y sistemas de imágenes. En este caso lo mejor es continuar con el paso 4.2 (lo que evita el movimiento de la muestra / agitación en total). En ambos métodos, los embriones son cultivados mientras está sumergido en un medio de cultivo líquido. Si el embrión no está completamente sumergida (como es el caso de algunas de las técnicas de cultivo convencionales de tejidos), la geometría del tejido está muy alterado debido a la deformación altas cargas de tensión superficial y la distribución de la tensión se logran captar con precisión lo normal en 3-D morfogénesis 3, 4. Por otra parte, sumergiendo el tejido impide el contraste brillante observada en la interfase líquido-gas en octubre de imágenes de oscurecer la morfología embrionarias y las coordenadas del marcador. <ol><li> Embrión de Cultura (general) <ol><li> Después de la adquisición de su primera imagen (campo claro, fluorescencia, o PTU), poner un máximo de siete placas de 35 mm de la cultura (los embriones) en un 150 mm placa de Petri y el lugar todo el conjunto en una pequeña bolsa de plástico. Añadir un par de gotas de agua desionizada a la bolsa para la humidificacióny llenar la bolsa con un 95% O 2 / 5% mezcla de CO 2. Colocar los embriones en la incubadora a 37 ° C (cola Stabiletherm, Asheville, Carolina del Norte) durante el tiempo deseado hasta el siguiente punto de tiempo de imágenes. El uso de este método, los experimentos se pueden realizar en varios embriones en el mismo día. </li></ol></li><li> Time-lapse cultura (automatizada) <ol><li> Coloque los embriones etiquetados en un plato de Delta T (35 mm de diámetro exterior, 23 mm de abertura central con pared lateral cónica, de vidrio grueso 0.17mm; Bioptechs, Butler, PA) que contiene 1,2 ml de medio de cultivo. </li><li> Cubra el plato con una tapa de vidrio se mantuvo a 37 ° C con un Bioptechs Delta T4 controlador de placa de cultivo (para evitar la condensación). Superfuse el embrión con un 95% O 2 / 5% CO 2 mezcla de gas suministrado desde un dispositivo variable Mini-bomba (Fisher Scientific). Antes de alcanzar el embrión, calentar y humidificar el gas por burbujeo a través del agua desionizada en un ambiente cálido (&lt;100 ° C) plato caliente. Un esquema de este s experimentalet-up se muestra en la Figura 1. </li><li> Configurar el software para adquirir automáticamente las imágenes a intervalos de tiempo especificados por el usuario. Para nuestro microscopio de fluorescencia, se utiliza Openlab software (PerkinElmer, Waltham, MA), y para nuestro sistema de octubre, se utiliza barrido fuente Thorlabs software (Newton, NJ). Debido a que este método es en la actualidad sólo capaz de manejar un lapso de tiempo en el experimento un tiempo, a menudo es mejor permitir que este tipo de culturas que durante la noche. Se podría sortear esta limitación mediante la instalación de un escenario automatizado traducible compatible con el hardware y el software del sistema de imagen 5. </li></ol></li></ol> 5. Los resultados representativos: Las etiquetas se realiza un seguimiento de forma automática (mediante Volocity, PerkinElmer) o manualmente (con el plug-in Manual de seguimiento en ImageJ, NIH) en cada experimento. En la técnica de marcaje fluorescente, se utiliza la rutina de Matlab gridfit para adaptarse a las superficies de 2D a través de las coordenadas marcador, lo que permite cepas morfogenéticos superficie que se calcula 6, 7. Ecuaciones estándar se utilizan para transformar estos valores en un sistema de coordenadas embrionarias correspondientes. Por otra parte, en la técnica de octubre, las superficies se generan a partir de los volúmenes de la imagen segmentada (obtenido a través de software estándar, como Matlab o Caret 8) y las cepas se puede calcular en la dirección de curvatura máximo o mínimo de la muestra 9. Utilizamos nuestra técnica de partículas de hierro para marcar y seguir el movimiento de las células ectodérmicas durante la formación de la cabeza veces en el embrión de pollo temprano. Como se muestra en la Figura 2A, las células de la etiqueta fluorescente se distribuyeron en todo el embrión completo. Campo claro y las imágenes fluorescentes de los embriones fueron capturados en diferentes intervalos durante el cultivo in ovo ex. Los movimientos de las etiquetas de seguimiento (Fig. 2B, C) se utilizaron para calcular la distribución de la evolución de la tensión morfogenéticos durante la formación de cabeza doble (Fig. 2D-F). t "&gt; Del mismo modo, la técnica de microesferas de poliestireno se utiliza para rastrear los movimientos de los tejidos en la frontera a mediados de cerebro posterior del cerebro de pollo temprano. Como se muestra en la Figura 3 BD, movimientos de cuentas fueron rastreadas durante 6 horas y las tensiones que caracterizan la deformación del tejido en sentido longitudinal y direcciones circunferenciales se calcula a partir de las coordenadas del marcador. Tenga en cuenta que este método es capaz de manejar claramente en 3-D deformaciones como cuentas tienden a adherirse a todos los lados de la luz interna del cerebro (Fig. 3). <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Esquema de puesta a punto para el cultivo de tejidos de lapso de tiempo. <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig2.jpg" alt="Figura 2"> Figura 2. Cuantificación de 2-D deformaciones de tejido en el embrión de pollo temprano con un seguimiento etiquetas fluorescentes. (A) brillante combinados de campo / fluorescentes de imágenes de la etapa 5 HH de embriones después de la eliminación de partículas de hierro. DII-etiquetaed células ectodérmicas (rojo) se distribuyen en todo el embrión completo. (B, C) El movimiento de las células marcadas se siguió utilizando ImageJ. Desplazamientos etiqueta se calcularon las coordenadas de embriones (X, Y). Tenga en cuenta que A y B son la misma imagen. (DF) parcelas de contorno de la evolución de la distribución longitudinal tensión durante la formación de cabeza doble. Longitudinal cepas de Lagrange se calculan en relación con HH etapa 5 (es decir, A y B) después (D) 75 min, (E) 120 min, y (F) 165 minutos de incubación. Estas cepas caracterizan los cambios de longitud de los elementos de la línea originalmente orientado a lo largo del eje Y (en la etapa 5 del embrión). Más detalles sobre el uso de la etiqueta seguimiento de coordenadas para el cálculo de las cepas morfogenéticos se pueden encontrar en Filas et al. (2007) 6 y Varner et al. (2010) 7. Tenga en cuenta que C y F son la misma imagen. Barra de escala = 500 micras. <img src="/files/ftp_upload/3129/3129fig3.jpg" alt="Figura 3"> Figura 3. Cuantificación de 3-D del tejido deformations en el cerebro de pollo temprano. (A) microesferas de poliestireno que se adhieren a la (flecha negro) dorsal y ventral (flecha blanca) lados del tubo del cerebro son fácilmente discernibles de los tejidos circundantes de puntos de vista transversal cruz section.Ventral reconstrucciones de octubre muestran la ubicación de las microesferas cerca de la frontera a mediados de rombencéfalo en (B) HH12 y después (C) 6 horas de incubación (M: mesencéfalo, H: cerebro posterior). Varios grupos de cuentas se resumen para destacar la deformación total del tejido. (D) longitudinal (E zz) y circunferencial (E θθ) de las cepas de Lagrange se calcula a partir de estas deformaciones. Cepas positivas y negativas circunferencia longitudinal en el límite de mediados de los hindbrain reflejan un alargamiento axial y acortamiento circunferencial de la región durante el cultivo. Más detalles sobre el cálculo de las cepas morfogenética de superficies complejas durante la morfogénesis se puede encontrar en Filas et al. (2008) 9. Barra de escala = 200 micras.

<ol><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+beveling+micropipettes+using+a+computer+hard+drive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dry beveling micropipettes using a computer hard drive.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).</li>
<li>Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+looping+in+experimental+conditions%3A+the+effects+of+extraembryonic+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces.</a> Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).</li>
<li>Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+as+a+regulator+of+cytoskeletal+contractility+and+nuclear+shape+in+embryonic+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia.</a> Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).</li>
<li>Kozel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+fiber+formation%3A+a+dynamic+view+of+extracellular+matrix+assembly+using+timer+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters.</a> J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).</li>
<li>Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+as+a+tool+for+measuring+morphogenetic+deformation+of+the+looping+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart.</a> Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).</li>
<li>Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+head+fold+formation%3A+investigating+tissue-level+forces+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development.</a> Development. 137, 3801-3811 (2010).</li>
<li>Van Essen, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+software+suite+for+surface-based+analyses+of+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Med.+Inform.+Assoc%22%5BJournal%5D)">An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex.</a> J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).</li>
<li>Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+measuring+deformation+of+folding+surfaces+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis.</a> J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).</li>
<li>Yuan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-registered+optical+coherence+tomography+and+fluorescence+molecular+imaging+for+simultaneous+morphological+and+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging.</a> Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).</li>
<li>Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+image-based+method+for+computational+tissue+fate+mapping+during+early+avian+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis.</a> Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).</li>
<li>Blanchard, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+tectonics%3A+morphogenetic+strain+rates%2C+cell+shape+change+and+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation.</a> Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Dos técnicas de etiquetado de los tejidos se presentan para el cultivo ex ovo de embriones de pollo temprano. El primero utiliza tintes fluorescentes lipofílicos entregado a través de partículas de hierro magnético para etiquetar simultáneamente cientos de células. Sin embargo, este método no es compatible con la tomografía de coherencia óptica, como los tintes fluorescentes en general, poco contraste de los tejidos circundantes con 10 de octubre. Por lo tanto, se muestra una técnica alternativa con ...

<table border="1"><table border="1"><tbody><tr><td> Material / Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DMEM - altos de glucosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina / Neomicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4083 </td><td></td></tr><tr><td> Suero de pollo </td><td> Invitrogen </td><td> 16110-082 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de Dulbecco solución salina tamponada </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1408 </td><td> 10 veces </td></tr><tr><td> Whatman # 2 Filtro de papel </td><td> Whatman </td><td> 1002 090 </td><td> 90 mm de diámetro </td></tr><tr><td> Micropipetas de vidrio </td><td> World PrecisionInstrumentos (IPM) </td><td> TW150-6 </td><td> Diámetro interior de 1,5 mm </td></tr><tr><td> Dii </td><td> Invitrogen </td><td> D-282 </td><td></td></tr><tr><td> Hierro reducido </td><td> Mallinckrodt Baker Inc. </td><td> 5320 </td><td></td></tr><tr><td> 10 micras de diámetro microesferas (negro) </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 24294 </td><td></td></tr><tr><td> Delta T plato (para la cultura de lapso de tiempo) </td><td> Bioptechs </td><td> 04200415B </td><td> Espeso, negro, 0,17 mm </td></tr><tr><td> Delta Cultura T4 controlador de plato </td><td> Bioptechs </td><td> 0420-4-03 </td><td></td></tr><tr><td> Mini-bomba de caudal variable de dispositivos </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el seguimiento de deformaciones morfogenética del tejido en el embrión de pollo temprano

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo 

Epitelios embrionarios sufren deformaciones complejas (por ejemplo, flexión, torsión, plegado y estiramientos) para formar los órganos primitiva del embrión temprano. Seguimiento de los marcadores de referencia en las superficies de estas hojas de celular es un método bien establecido para la estimación de cantidades morfogenéticos tales como el crecimiento, la contracción, y de corte. Sin embargo, no todas las técnicas de etiquetado de la superficie son fácilmente adaptables a las técnicas de imagen convencionales y poseen distintas ventajas y limitaciones. Aquí se describen dos métodos de etiquetado y de ilustrar la utilidad de cada técnica. En el primer método, cientos de etiquetas fluorescentes se aplican simultáneamente para el embrión utilizando partículas de hierro magnético. Estas etiquetas se utilizan para la cantidad de 2-D deformaciones de tejido durante la morfogénesis. En el segundo método, microesferas de poliestireno se utilizan como agentes de contraste no invasivo en la coherencia de tomografía óptica (OCT) para realizar un seguimiento de imágenes 3-D deformaciones de tejido. Estas técnicas han tenido éxitomente a cabo en nuestro laboratorio para studythe mecanismos físicos de veces la cabeza principios, el corazón y el desarrollo del cerebro, y debe ser adaptable a un amplio rango de procesos morfogenéticos.

En este artículo se describe el etiquetado y la superficie<em&gt; Ovo ex</em&gt; Cultivo de tejidos en el embrión de pollo temprano. Técnicas susceptibles de campo de lapso de tiempo brillante, fluorescencia e imágenes de tomografía de coherencia óptica se presentan. Seguimiento de las etiquetas de la superficie con una resolución espacio-temporal de alta permite cantidades cinemáticas tales como cepas morfogenética (deformaciones) que se calcula en dos y tres dimensiones.

El seguimiento de deformaciones morfogenética del tejido en el embrión de pollo temprano

Los epitelios embrionarios experimentan deformaciones complejas (p. ej., flexión, torsión, plegamiento y estiramiento) para formar los órganos primitivos del embrión temprano. ...

El objetivo general de las técnicas presentadas aquí es marcar y cultivar tejidos embrionarios para medir la deformación morfogenética durante el desarrollo temprano. Para el cultivo del embrión de pollo en estadios iniciales, comience por extraer el embrión del huevo utilizando un método con portador de papel filtro. Dependiendo de la aplicación experimental, marque el embrión extraído con colorantes lipofílicos fluorescentes administrados mediante partículas magnéticas de hierro o con microesferas de poliestireno. A continuación, siga los marcadores durante el cultivo mediante microscopía de fluorescencia o imágenes de tomografía de coherencia óptica.Los mapas de deformación morfogenética resultantes del procesamiento de imágenes indican regiones de alargamiento, acortamiento y cizalladura del tejido tanto en dos como en tres dimensiones. Hola, me llamo Ben Philis y soy estudiante de posgrado en el laboratorio del Dr. Larry Tabor en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Washington en St. Louis. Antes de comenzar este tipo de experimentos, es importante considerar las técnicas relevantes de cultivo celular en su sistema modelo, las modalidades de imagen a las que podría tener acceso y también el tipo de datos que desea obtener de sus experimentos.Por ejemplo, ¿le interesa analizar deformaciones del tejido en dos o tres dimensiones? Abordamos algunas de estas preguntas aquí hoy mostrando dos técnicas complementarias de marcado en el embrión temprano de pollo. Hola, mi nombre es Víctor Varner, y trabajo en el laboratorio del Dr. Larry Tabor en la Universidad de Washington en San Luis.En ambas técnicas, marcamos rápida y simultáneamente cientos de células en el embrión temprano de pollo. Seguir el movimiento de estas marcas nos permite no solo determinar los tejidos en los que estas células finalmente se establecen, sino también cuantificar la deformación a nivel tisular que moldea al embrión temprano. Primero, incubar los huevos en orientación longitudinal hasta la fase deseada según la definición de Hamburger y Hamilton.Rompa la base del huevo contra el borde de una placa de Petri de 150 milímetros. Separe la cáscara por la parte inferior, vierta el contenido del huevo en la placa y, utilizando pinzas romas, retire el albúmina viscosa más espesa del yema. Ahora haga perforaciones a través del centro de un papel de filtro circular.Coloque uno de los anillos de papel de filtro sobre la yema de modo que el embrión sea visible a través del orificio central del anillo. Recorte alrededor del perímetro exterior del anillo de papel de filtro con tijeras microquirúrgicas. Luego, retire el papel con el embrión adherido de la yema usando pinzas finas y sumerja suavemente el embrión en un baño de PBS. Para eliminar partículas adheridas de yema, transfiera el conjunto de papel de filtro a una placa de cultivo de 35 milímetros.Colocándolo con el lado ventral hacia arriba, coloque el embrión con un segundo anillo de papel filtro. Fíjelo con un anillo metálico y sumerja el embrión en medio de cultivo. Si el embrión no está completamente sumergido, la geometría del tejido y la morfogénesis subsiguiente pueden alterarse considerablemente debido a cargas anormalmente altas de tensión superficial.Durante el cultivo, utilizando un microscopio de campo claro, verifique la morfología adecuada y la etapa embrionaria. Primero, tome una pequeña cantidad de polvo de hierro y agregue unas gotas de tinte saturado y alcohol, y seque al aire con la punta de una micropipeta estirada. Desagregue las partículas de hierro aglomeradas y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga.Después de varios lavados cubiertos con agua ionizada, coloque el embrión recolectado con la cara dorsal hacia arriba en una placa de cultivo de 35 milímetros cubierta con una capa abundante de medio de cultivo. Bajo un microscopio estereoscópico, utilice la aguja de vidrio para eliminar la membrana vilina y exponer las células ectodérmicas. Ahora aspire una columna de partículas de hierro marcadas en una pipeta de vidrio.Utilizando el microscopio estereoscópico, sumerja la pipeta y colóquela justo encima del embrión. Gire la pipeta lentamente hacia adelante y hacia atrás entre las yemas de los dedos para espolvorear partículas sobre el embrión. Tras una incubación de 10 minutos a 37 grados Celsius, retire las partículas utilizando un imán potente.Si es necesario, sujete el imán a un par de pinzas magnéticas finas y utilice las pinzas imantadas para retirar cuidadosamente cualquier partícula residual de hierro. Proceda a obtener imágenes de campo claro y fluorescentes del embrión. Con una aguja de calibre 22.Extraiga una solución de microesferas negras de 10 micrómetros de diámetro en PBS hacia una jeringa de 10 cc. Luego, biselar las puntas de las agujas de vidrio estiradas utilizando un disco duro de computadora y llénelas con la solución de microesferas. Golpee suavemente la micropipeta para que la solución alcance la punta, utilizando un micromanipulador.Coloque la aguja de vidrio en el mismo campo de visión que el embrión. Confirme el flujo de microesferas fuera de la punta de la pipeta. Ahora inserte la punta de la pipeta en la luz del tubo neural.Teniendo cuidado de no perforar el suelo ventral del tejido. Observe la hinchazón transitoria del tejido a medida que las perlas y el líquido entran en la luz. Luego retire rápidamente la aguja de vidrio.Finalmente, verifique una densidad suficiente de microesferas en la luz interna del tubo neural. Utilizando un microscopio de campo brillante, deje que las microesferas sedimenten durante 20 a 30 minutos antes de adquirir imágenes de campo brillante o un conjunto de datos de tomografía de coherencia óptica. Después de obtener las primeras imágenes, coloque hasta 7 placas de cultivo de 35 milímetros con muestras dentro de una placa de Petri de 150 milímetros y coloque todo el conjunto en una bolsa de plástico pequeña.Agregue gotas de agua desionizada a la bolsa para humidificación, y luego llene la bolsa con una mezcla de 95% oxígeno y 5% dióxido de carbono. Coloque los embriones en una incubadora a 37 grados Celsius hasta el siguiente punto de tiempo de imagen; coloque los embriones etiquetados en un platillo delta T que contenga 1,2 mililitros de medio de cultivo y cubra el platillo con una tapa de vidrio mantenida a 37 grados Celsius. Suprafusione el embrión con una mezcla de gas 95%O₂ 5%CO₂ suministrada por un dispositivo de bomba miniatura con flujo variable. Ahora configure el software para adquirir automáticamente imágenes a intervalos de tiempo deseados.A lo largo del experimento, las etiquetas pueden rastrearse de forma automática o manual, y se pueden calcular mapas de deformación morfogenética para las coordenadas de los marcadores. Aquí, se utilizó la técnica de partículas de hierro para etiquetar y rastrear el movimiento de células electrodérmicas durante la formación del pliegue cefálico. En el embrión de pollo temprano, las células marcadas con fluorescencia se distribuyeron a través de todo el embrión.Se capturaron imágenes de campo brillante y fluorescentes del embrión a intervalos diferentes durante el cultivo ex ovo. Para monitorear los movimientos de las etiquetas del tracto. Los datos acumulativos permiten el cálculo de las distribuciones cambiantes de tensión morfogenética durante la formación del pliegue cefálico.De manera similar, se utilizó la técnica de microesferas de poliestireno para rastrear los movimientos del tejido en el límite medio del rombencéfalo del cerebro embrionario de pollo. Téngase en cuenta que este método es capaz de manejar deformaciones claramente tridimensionales, ya que las microesferas tienden a adherirse a todos los lados del lumen interno del cerebro. Tras rastrear el movimiento de las microesferas durante seis horas, las coordenadas de los marcadores permiten calcular las deformaciones, caracterizando así la deformación del tejido en las direcciones longitudinal y circunferencial.Después de ver este video, debería tener una buena idea de algunos de los pasos experimentales necesarios para implementar su propio cultivo de tejidos y marcado. Las técnicas de protocolo presentadas aquí son particularmente ventajosas porque son mínimamente invasivas para los tejidos nativos y también implican bajos costos y materiales fácilmente disponibles. Estos experimentos son particularmente útiles para estudios sobre la mecánica del desarrollo embrionario.Dado que los campos de deformación calculados utilizando el movimiento rastreado de células marcadas pueden utilizarse tanto para probar como para construir modelos físicos de la morfogénesis.

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

En este artículo se describe una técnica de trasplante de tejido que se diseñó para probar la señalización y las propiedades de los patrones de la superficie del ectodermo cefálico durante el desarrollo craneofacial.

La evaluación de las propiedades de señalización de ectodérmica epitelio durante el desarrollo craneofacial

Ver y acceder al embrión de pollo durante el desarrollo puede ser un desafío. Hemos desarrollado un método ex ovo que es simple, rentable y se puede usar fácilmente en un aula o en un entorno de investigación. Este método proporciona acceso al embrión en etapas tardías del desarrollo embrionario (HH 40).

Optimizado Ex-ovo El cultivo de embriones del polluelo a etapas avanzadas de desarrollo

Mediante el injerto de perlas empapadas en factores de crecimiento o inhibidores específicos de las vías de señalización en embriones en desarrollo, es posible probar directamente sus efectos in vivo. En este protocolo, las perlas se injertan en la yema de la extremidad para determinar los efectos de estas moléculas en la expresión génica y la transducción de señales.

Injerto de Cuentas en desarrollo Miembros de embrión de pollo para identificar señales de transducción Pathways afectan la Expresión Génica

Se describen los protocolos que utilizan barreras impermeables para bloquear los eventos de inducción entre los tejidos del eje principal del cuerpo y el flanco en el embrión de pollo necesarios para la formación de las extremidades. Las perlas empapadas en señales inductivas candidatas se utilizan para superar el efecto de la colocación de barreras y el análisis de la expresión génica lo confirma.

La aplicación de barreras impermeables combinadas con empapó las bolas Factor Candidato para el Estudio de señales inductivas en el polluelo

Aquí, presentamos un protocolo de introducción de un conjunto de nuevos experimentos ex ovo y enfoques de modelado físico para el estudio de la mecánica de la morfogénesis durante temprano chick cerebro embrionario la torsión.

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Este protocolo está diseñado para la toma de imágenes y el análisis de la dinámica de la orientación celular y el crecimiento del tejido en la drosophila epitelia abdominal a medida que la mosca de la fruta sufre metamorfosis. La metodología descrita aquí se puede aplicar al estudio de diferentes etapas del desarrollo, tejidos y estructuras subcelulares en Drosophila u otros organismos modelo.

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El ensayo de perla empapada implica la entrega dirigida de reactivo de prueba en cualquier punto de tiempo de desarrollo para estudiar la regulación de la diferenciación celular y la morfogénesis. Se presenta un protocolo detallado, aplicable a cualquier modelo animal experimental, para preparar tres tipos diferentes de perlas remojadas e implantarlas en el interdigito de un embrión de pollo.

Análisis de la diferenciación celular, la morfogénesis y el patrón durante la embriogénesis del pollo utilizando el ensayo de cuentas empapadas

Aquí describimos los protocolos para tres tipos de cultivos de explantes de piel embrionaria aviar que se pueden utilizar para examinar las interacciones de los tejidos, la película de lapso de tiempo de imágenes 4D (3D más tiempo), la perturbación global o local de la función molecular y la caracterización de la biología de sistemas.

Uso de explantes de piel de ave para estudiar el patrón de tejidos y la organogénesis

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Monitorización de la evolución mecánica del tejido durante el cierre del tubo neural de un embrión de pollo

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