Name: Una PCR para la identificación de Allelotyping Salmonella enterica Serotipos Enteritidis, Hadar, Heidelberg, y Typhimurium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Aprende a identificar serotipos de Salmonella enterica mediante PCR múltiplex. Este método rápido detecta alelos específicos del antígeno O y flagelina para tipificar Enteritidis, Hadar, Heidelberg y Typhimurium en estudios epidemiológicos.

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Este trabajo ha sido subvencionado por el USDA 1999-35212-8680, 2005-01378, y 2010-04288-01, Fondos USDA Fórmula y el Estado de Beca de Investigación Veterinaria de Georgia Medicina Agrícola. El protocolo descrito en esta publicación se ha desarrollado para su uso por los estudiantes como parte de los cursos de investigación dirigido: MIBO 4900L, 4960H GENE, BCMB 4960L, y BIOL 4960H en la Universidad de Georgia y utilizados por los estudiantes en varios proyectos de investigación de epidemiología molecular en el Maurer laboratorio. Queremos agradecer a los muchos estudiantes de pregrado que se han realizado investigaciones en los laboratorios de Maurer y Lee, y nuestro jefe de departamento, John Glisson por apoyar nuestros esfuerzos para integrar la enseñanza de pregrado con la investigación.

<ol><li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 Forthcoming.</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg%2C+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. ofacre, Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. aurer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li>
<li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li>
<li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li>
<li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory%22">Molecular cloning: a laboratory</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).</li>
<li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La mayoría de los disponibles en el mercado pruebas PCR para la detección de los objetivos de Salmonella único en el género (por ejemplo, invA) genes. Sin embargo, no todos los serotipos son iguales en su capacidad para causar enfermedades en humanos o la prevalencia en las poblaciones animales. El reconocimiento temprano de las diferencias antigénicas de Salmonella LPS O-antígeno y antígenos H2 flagellinH1 y ha dado lugar a la diferenciación de Salmonella en más de 2.500 serotipos sobre la base de estas diferencias antigénicas. Hay 46 diferentes antígenos O y 86 antígenos distintos flagelina (H) identificados en el género Salmonella. Salmonella puede poseer uno (H1) o de dos diferentes (H1 y H2) flagellins. La combinación diferente de O, H1, H2 y cuenta antígenos de los serotipos de Salmonella 2.500 reconocido hoy en día. Un serotipo es asignado sobre la base de la fórmula antigénica derivada de la identificación de la persona antígenos O y H. La fórmula antigénica se escribe como O: H1: H2, y donde &quot;-&quot;, se refiere a la ausencia de flagelina H1 o H2 y &quot;NT&quot; (no tipificable) para Salmonella negativo para el antígeno-O. Por ejemplo, el serovar Typhimurium se asigna a una S. enterica aislada con la fórmula antigénica B: i: 1,2, mientras que Enteritidis se le da a un aislamiento con la fórmula D1: g, m: -. Esta variación antigénica en la población de Salmonella es la manifestación externa de las diferencias a nivel de nucleótidos que por lo tanto pueden ser fácilmente explotados por PCR. Hemos identificado las diferencias genéticas específicas asociadas con los alelos S y H para desarrollar un PCR para la identificación de S. allelotyping enterica serovar: Enteritidis, Hadar, Heidelberg, y Typhimurium (3). La correcta asignación y presentación de informes de Salmonella serovar requiere una prueba para todos los alelos asociados con O: H1: H2 fórmulas antigénicas para Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B : r: 1,2) y Typhimurium (B: i: 1,2). Sin el conocimiento del alelo S o antígeno, el hallazgo de la g H1, el alelo m por sí sola no se identifica necesariamente la Salmonella Enteritidis en aislar como otros serotipos de Salmonella: Agona, California, y Montevideo, también poseen este mismo alelo. Mientras que la PCR allelotyping fue originalmente diseñado para detectar un primer plano mencionado serotipos de Salmonella, esta prueba puede identificar otros 19 serotipos (tabla 3). Nuestra allelotyping PCR fue diseñada originalmente para detectar alelos S y H. En la práctica, se ha vuelto más práctico y rentable para que podamos identificar el antígeno-O por la prueba de aglutinación, utilizando antisueros específicos O, en lugar de realizar el PCR allelotyping O cuando se trabaja con cultivos de Salmonella aisladas. Sin embargo, se recomienda utilizar el O allelotyping PCR si el laboratorio utiliza el PCR como una pantalla (2) o para la clasificación presentada en los aislamientos de Salmonella tarjetas FTA (6), e incluyen una PCR específica de Salmonella con la primera pantalla de las muestras (4 ). Limitar la PCR allelotyping a sólo aquellas muestras que se identifican como Salmonella por PCR o pruebas bioquímicas / antigénica. El protocolo se describe en este artículo ha sido optimizado para su uso con el Rapidcycler Idaho Technology, un termociclador de aire caliente que permite a reducir los volúmenes de reacción y las condiciones de reacción se ejecuta en menos tiempo de lo que muchos termocicladores calefacción bloque. Para adaptar este protocolo para su uso con un termociclador un calentador pueden requerir la optimización de las condiciones de reacción empíricamente mediante la reducción / aumento de las temperaturas de recocido, el ajuste de concentración de los cebadores, o el ajuste de concentraciones de MgCl 2. Por ejemplo, hemos tenido que adaptar el protocolo para el MJ Research PTC-200 termociclador de la siguiente manera. Trabajar con los volúmenes misma reacción en la tabla 1, las acciones de trabajo concentrationof se diluyó el primer set i de 2,5 M, la temperatura de hibridación se redujo de 55 ° C a 45 ° C, y los tiempos de incubación en la desnaturalización, hibridación y extensión de las medidas se alargó a 20 s para el i / g, m allelotyping PCR. Tener el control, positivas y negativas son esenciales en la puesta en marcha inicial y la optimización de los PCR, incluyendo los protocolos publicados. Recomendamos adquirir conocido serotipos de Salmonella, especialmente Anatum (E1: e, h: 1,6), Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B: r : 1,2), Montevideo (C1: g, m, s: 1,2,7) y Typhimurium (B: i: 1,2), y un laboratorio de Escherichia coli K12 (DH5a, LE393, JM109, etc ) como controles positivos y negativos, respectivamente, para las pruebas de PCR allelotyping descrito en este artículo. Varios de estos serotipos de Salmonella servirá como control positivo o negativo, dependiendo de qué alelo se pone a prueba. Ciertas precauciones y pautas se deben seguir al realizar esta y cualquier otro diagnóstico de PCR. En primer lugar, la separación físicade la preparación de la plantilla, PCR puesta en marcha, y la electroforesis en gel es fundamental en la prevención de posibles PCR traspaso de la contaminación y la información errónea de los falsos positivos. Además, la inclusión de los controles adecuados es necesario en cualquier rutina de PCR ya que estos controles identificar los problemas que puedan surgir y ayudar en la interpretación de los resultados (5). Lo más importante, la consistencia es esencial, especialmente en lo que respecta a las condiciones de electroforesis para la detección andestimation amplificación (PCR producto) de tamaño de amplificación. Para ilustrar este punto, a propósito de electroforesis suspendido antes de lo esperado en la figura 1A. Los patrones de peso molecular (calles 1 y 13) y el control positivo (carril 2), no están lo suficientemente separados para estimar con precisión los tamaños y observar la separación de fragmentos de ADN, donde hay pequeñas diferencias (~ 50 pb) en los tamaños. La adecuada separación de los fragmentos de ADN, especialmente los patrones de peso molecular, es fundamental la presentación de informes positivos depende de la estimación precisa del tamaño de amplificación y la distinción &quot;verdaderos positivos&quot; de no amplicones específicos que a veces se observan en el funcionamiento diario de cualquier PCR (5 ). Por ejemplo, hay una amplificación no específicos en la Figura 1B, carril 7 (~ 700 pb de tamaño). Electroforesis había sido descontinuado demasiado pronto, cuando el frente de colorante sólo en el punto a mitad de camino en el gel de agarosa, habría poca diferencia entre 500 pb y 700 pb fragmentos de ADN. Por lo tanto, muestra en la calle 7 que han sido erróneamente reportado como positivo para ambos i y g, m alelos. Finalmente, es necesario reconocer las limitaciones asociadas a cualquier prueba. Varios de los PCR H1/H2 allelotyping no tiene el poder discriminatorio para distinguir sutiles diferencias genéticas en los alelos que pertenecen a la H2 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 complejo antígeno, e, n, x / e , n, Z15 complejo antígeno y el complejo antígeno H1 G, que incluye la g, m alelo. Uno o dos cambios de aminoácidos en cuenta los diferentes epítopos presentes en estos antígenos flagelares. Por lo tanto, difícil para nosotros el diseño de cebadores que podría explotar estas diferencias de base en ocasiones de un solo par en la secuencia del gen de flagelina (3). Por ejemplo, Salmonella serovares Dublin (D1: g, p: -) y Berta (D1: f, g, t: -) también son positivas en la PCR con los g, mallelotyping primers. Los cebadores H2 allelotyping no puede distinguir Typhimurium (B: i: 1,2) de Lagos (B: i: 1,5), Heidelberg (B: r: 1,2) de Bradford (B: r: 1,5), Winneba (B: r: 1,6), o Remo (B: r: 1,7), o Hadar (C2: z10: e, n, x) de Glostrup (C2: z10: e, n, Z15). Mientras que la probabilidad de encontrar algunos de estos serotipos: Lagos, Bradford, Winneba, Remo o Glustrup es remota, es una posibilidad y requiere ya sea proporcionando aviso legal sobre la limitación de las pruebas o de otra prueba confirmatoria. En conclusión, este serotipo basado en la PCR identifica rápidamente S. enterica serovar Enteritidis, Hadar, Heidelberg y Typhimurium, y O, H1, H2 y los alelos asociados con 19 serotipos adicionales. Este ensayo es una rápida y rentable alternativa al enfoque tradicional microbiológicos de Salmonella serotipo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del Material </th><th> Tipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentario </th></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td></td><td> Pescador </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> Microfuga tubos </td><td> 1,5 ml de capacidad </td><td> Pescador </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Prueba 200 </td><td> Pescador </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> Grado de Biología Molecular </td><td> Sigma </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar, sólo PCR) </td></tr><tr><td> 10 x PCR Buffer: </td><td> 20 mM MgCl 2 </td><td> Idaho Tecnología </td><td></td><td> (Tampón viene con BSA, Ficoll y tartrazina) </td></tr><tr><td></td><td> 30 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR primers </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> Roche </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> Taq ADN polimerasa </td><td></td><td> Denville </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> Pipetas capilares </td><td> Un volumen de 10 l </td><td> Idaho Tecnología </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rápida termociclador </td><td></td><td> Idaho Tecnología </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> Baja EEO; Grado de Biología Molecular </td><td> BioRad </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> 50 X TAE buffer o tampón TBE 5X </td><td></td><td> Pescador </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> El bromuro de etidio </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> Horizontal, sumergible cámara de electroforesis en gel con molde de gel </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> Fuente de alimentación </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> Molecular Imager sistema Gel Doc </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Materiales

una pcr para la identificación de allelotyping salmonella enterica serotipos enteritidis, hadar, heidelberg, y typhimurium

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Las pruebas actuales de terminación de proyecto comercial para la identificación de genes de Salmonella objetivo único de este género. Sin embargo, hay dos especies, subespecies y seis, y más de 2.500 serotipos de Salmonella diferentes, y no todos son iguales en su importancia para la salud pública. Por ejemplo, la búsqueda de S. enterica subespecie IIIa Arizona en una granja ponedora de huevos de mesa es insignificante en comparación con el aislamiento de S. enterica serovar Enteritidis subespecie I, la principal causa de salmonelosis asociados al consumo de huevos de mesa. Serotipos se identifican con base en las diferencias antigénicas de lipopolisacárido (LPS) (antígeno O) y flagelina (H1 y H2 antígenos). Estas diferencias antigénicas son la apariencia externa de la diversidad de los genes y alelos de genes asociados con este fenotipo. Hemos desarrollado un allelotyping, PCR multiplex que las claves en las diferencias genéticas entre los cuatro principales S. enterica serovar subespecie que se encuentra en las aves de corral y se asocia con la enfermedad humana significativa en los EE.UU.. Las parejas de cebadores de PCR fueron dirigidos a genes o secuencias clave única de un serovar de Salmonella específico y diseñado para producir una amplificación con un tamaño específico para que el gen o alelo. Salmonella serovar se asigna a un aislamiento basado en la combinación de resultados de las pruebas de PCR para LPS específicos y flagelina alelos del gen. La PCR multiplex descrito en este artículo son específicos para la detección de S. enterica serovar Enteritidis subespecie I, Hadar, Heidelberg, y Typhimurium. Aquí se demuestra cómo utilizar el multiplex PCR para identificar los serotipos de Salmonella para aislar.

Se describe una técnica de PCR múltiple para la detección rápida de Salmonella enterica serovar Enteritidis, Hadar, Heidelberg, y Typhimurium. Serotipos de Salmonella específicos se pueden identificar por objetivo una PCR múltiple para los genes y las secuencias únicas para el grupo O-antígeno de la biosíntesis y la flagelina de un serotipo determinado. Serovar se le asignó a un aislamiento de Salmonella basado en la apariencia de los amplicones específicos de tamaño, (producto de PCR), correspondiente al alelo objetivo.

Una PCR para la identificación de Allelotyping Salmonella enterica Serotipos Enteritidis, Hadar, Heidelberg, y Typhimurium

Las pruebas de PCR comerciales actuales para la identificación de Salmonella se dirigen a genes exclusivos de este género. Sin embargo, existen dos especies, seis subespecies y más de...

El objetivo general del siguiente experimento es identificar alelos específicos de antígenos de salmonela. Esto se logra dirigiendo una PCR para identificar diferencias de secuencia específicas asociadas con estos alelos. Se añade la plantilla de muestra a una mezcla de reacción de PCR que contiene cebadores específicos para alelos y la tipificación de alelos OH uno y H dos.Las PCR se realizan en el termociclador. A continuación, las muestras de PCR se separan por tamaño mediante electroforesis en gel para determinar el tamaño del amplicón, si está presente en cada muestra o aislado. Luego, el tamaño del amplicón se compara con el tamaño esperado para cada uno de los conjuntos de cebadores utilizados, y se obtienen resultados de PCR que muestran la identificación de antígenos específicos de salmonela.Los alelos mediante PCR, y la designación de SEROTIPO se dan luego en función de los resultados de los ensayos de PCR múltiple para OH uno y H dos. La principal ventaja del protocolo descrito en este video frente a SYP es que es más rápido, más fácil de interpretar y menos costoso. Este método puede ayudar a responder algunas preguntas clave en el campo de la epidemiología, como determinar la distribución y persistencia de las VARs de Salmonella dentro o entre granjas avícolas o lecheras.La implicación de esta técnica se extiende hacia el diagnóstico rápido de salmonosis atribuida a Salmonella, serovares, arius o urian. La demostración visual de este método es fundamental para comprender cómo utilizar este procedimiento basado en PCR para tipificar Salmonella hasta el nivel de serovar. Esta demostración estará a cargo de Adriana Pedroso y Yin Chang, científicas investigadoras en los Laboratorios Lee Mauer de la Universidad de Georgia, para preparar una plantilla de ADN de células completas destinada a la reacción subsecuente de PCR.Primero, inocule un mililitro de caldo LB con salmonela. Aísle a partir de una colonia individual. Incube el cultivo con agitación a 200-250 rotaciones por minuto y una temperatura de incubación de 37 grados Celsius.Al día siguiente, transfiera el cultivo de un mililitro a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y centrifugue la suspensión durante aproximadamente dos minutos a 4.500 ×g para formar un sedimento celular; luego aspire el sobrenadante y resuspenda el sedimento bacteriano en un mililitro de etanol al 100 %. Incube las células suspendidas en etanol a temperatura ambiente durante 10 minutos y luego centrifugue las células como antes. Resuspenda el sedimento en un mililitro de PBS. Tras la centrifugación, aspire el sobrenadante y resuspenda el sedimento en un mililitro de agua destilada estéril. Finalmente, diluya la suspensión celular.Uno en 20 con agua destilada y almacenar a menos 20 grados Celsius durante hasta un mes hasta que esté listo para realizar la preparación de la PCR. La dispensación de la mezcla de reacción de PCR debe realizarse en una sala físicamente separada y preferiblemente en una estación de trabajo dedicada para PCR equipada con luz UV. Primero, descontamine la superficie de trabajo con luz UV y limpiando con lejía al 10 %. A continuación, utilizando una pipeta designada exclusivamente para trabajo de PCR y equipada con puntas de pipeta con barrera.Prepare un stock maestro de cebadores diluyendo primero los cebadores a cinco veces 10 a la menos cuatro molar con agua destilada. Luego, diluya el stock una parte en 20 con agua destilada para obtener la concentración de trabajo de 25 micromolar. Retire los reactivos de PCR y la plantilla de células completas del congelador y descongele sobre hielo.Deje la ADN polimerasa tac en el congelador hasta que sea necesaria. Combine los reactivos de PCR según la tabla uno del protocolo escrito. A continuación, pipete nueve microlitros de la reacción de PCR.Mezcle en los pocillos de una placa estéril de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos con fondo redondo. Comience en la parte superior de la primera columna y descienda por la columna, luego continúe en la parte superior de la siguiente columna; agregue un microlitro de agua destilada al primer pocillo para usarlo como control negativo. A continuación, dispense 0,5 microlitros de las plantillas de control positivo en la mezcla de PCR en el segundo pocillo y un microlitro de E. coli K-12 DH5α en el tercero.Añada un microlitro de la plantilla de la tercera muestra a los pocillos restantes para la PCR de H1I y gyp de Salmonella enterica. CVaR, TYM y Enteritis servirán como controles positivos para los alelos i y gm, respectivamente. Salmonella CVaR, Heidelberg y Haar son los controles positivos que se utilizarán en la segunda PCR de tipificación del alelo H1 para detectar los alelos r y z10, respectivamente. A continuación, coloque capilares de vidrio de capacidad de 10 microlitros en los soportes designados para Idaho Technology.Una vez asegurado el ciclador rápido en el soporte, cargue cada capilar de vidrio con la mezcla de reacción de PCR tocando los capilares en el fondo de los pocillos. Incline el soporte para permitir que el líquido se desplace hacia la parte inferior del tubo y deje espacio entre los extremos y la mezcla de PCR. Antes de sellar térmicamente los tubos de vidrio con una pistola de butano para sellar ambos extremos de los capilares, coloque los tubos capilares y el soporte en el ciclador rápido de Idaho Technology y utilice los programas del termociclador descritos en la tabla uno del protocolo escrito para los diferentes tipos de ELO en las PCR.Una vez finalizado el programa del termociclador, continúe con el paso de electroforesis en gel para un gel de 15 por 10 centímetros al 1,5 % de grado para biología molecular que contiene bromuro de etidio, según los procedimientos estándar. Una vez que el gel haya solidificado, transfiera el gel a una cámara horizontal sumergible para electroforesis que contenga tampón de electroforesis TAE 1×, mezclado previamente con 200 microlitros de 0,25 miligramos por mililitro.Los marcadores de peso molecular de ADN se cargan con 40 microlitros de tampón de carga de ADN seis veces, agregando 4,8 microlitros del marcador de peso molecular de ADN premezclado en los pozos central, primero y último. A continuación, retire un capilar de vidrio que contenga una reacción de muestra de PCR del soporte y raye ambos extremos del capilar con un cortador de vidrio. Luego, coloque el pulgar y el índice de ambas manos a ambos lados del capilar en los puntos marcados por el cortador de vidrio y quiebre el capilar. Coloque el dispensador de capilares en el extremo opuesto a la mezcla de reacción de PCR y gire lentamente el émbolo en sentido horario hasta que el líquido llegue al fondo del tubo.Coloque el capilar en el pocillo que se va a cargar y gire lentamente el émbolo en sentido horario para dispensar la muestra pesada en el gel. Tenga cuidado de no perforar el pocillo con el capilar ni introducir una burbuja de aire en el pocillo al continuar girando el émbolo después de que la última parte del líquido haya salido del capilar. Una vez cargadas todas las muestras y los patrones, ajuste el voltaje constante de la fuente de alimentación a 90 voltios.Tras finalizar la electroforesis, transfiera el gel a un transiluminador UV para visualizar los fragmentos de ADN y los patrones de peso molecular, y capture imágenes en un sistema gel dock XR. Finalmente, coloque los portacapilares en lejía al 10 % durante 15 a 30 minutos. Enjuáguelos tres veces con agua destilada y devuélvalos a la sala de preparación de PCR para que sequen al aire.Esta primera gelatina teñida con bromuro de etidio muestra los resultados de una PCR múltiple para el alelo O asociado con Salmonella enterica var. enteritis, Hadda Heidelberg. Antifa. Las canales uno y 13 contienen un marcador de ADN de 100 pares de bases.La banda dos contiene los controles de PCR múltiple para los alelos O B, C uno, C dos, D uno y E. Las bandas restantes, de la tres a la 12, contienen aislamientos de Salmonella. Se asigna un alelo a cada aislamiento de Salmonella según el amplicón que coincida en tamaño con el control de PCR y según lo predicho para los conjuntos de alelos prima utilizados de izquierda a derecha. Estos tamaños de amplicón son los siguientes: D 1 620 pares de bases, C dos 400 pares de bases, E 1 280 pares de bases, C uno 340 pares de bases y B 560 pares de bases.Este gel teñido con bromuro de iridio muestra los resultados de una PCR múltiple de alelos H uno para identificar el gel FLA en alelos ojo y gm. El gel se cargó en el mismo orden que se mostró anteriormente. Nuevamente, se asigna un alelo H uno a cada aislado según la presencia de un amplicón que coincida en tamaño con el control de PCR y según lo predicho para los cuatro conjuntos de cebadores de alelos H uno utilizados de izquierda a derecha.Los tamaños de los amplicones son GM 310 pares de bases e I 510 pares de bases. Esta gel de tinción con bromuro de etidio muestra los resultados de una PCR múltiple de alelo H uno para identificar los alelos de gellin r y z 10. Nuevamente, la gel se cargó de la misma manera que se mostró anteriormente, y se asigna un alelo H uno a cada aislado según la presencia de un amplicón cuyo tamaño coincide con el control de PCR y, según lo predicho para los cuatro conjuntos de cebadores de alelo H uno utilizados, los tamaños de los amplicones son R 170 pares de bases y Z diez trescientos sesenta pares de bases. Una vez dominado.Esta técnica puede realizarse en cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, recuerde separar físicamente la preparación de la plantilla, el montaje de la PCR y la electroforesis en gel entre sí, con el fin de minimizar el riesgo de contaminación cruzada por productos de PCR.

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Este enfoque molecular para determinar la aptitud bacteriana facilita la detección precisa y precisa de microorganismos utilizando códigos de barras de ADN genómicos únicos que se cuantifican a través de PCR digital. El protocolo describe el cálculo del índice competitivo para las cepas de Salmonella;  sin embargo, la tecnología es fácilmente adaptable a los protocolos que requieren la cuantificación absoluta de cualquier organismo genéticamente maleable.

Indice competitivo basado en PCR digital para el análisis de alta producción de la aptitud en Salmonella

La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es una prueba de amplificación de ácido nucleico isotérmico (iNAAT) que ha atraído un amplio interés en el campo de detección de patógenos. Aquí, presentamos un protocolo Salmonella LAMP validado multi-laboratorio como un método rápido, confiable y robusto para la detección de Salmonella en alimentos animales y la confirmación de la presunta Salmonella del aislamiento cultural.

Amplificación isotérmica mediada por bucle para la detección de salmonela en alimentos para animales y la confirmación de salmonela del aislamiento cultural

Este artículo presenta una serie de métodos consecutivos para la expresión y purificación de Salmonella typhimurium triptófano sintasa comp este protocolo un sistema rápido para purificar el complejo proteico en un día. Los métodos cubiertos son la mutagénesis dirigida al sitio, la expresión de proteínas en Escherichia coli,la cromatografía de afinidad, la cromatografía de filtración en gel y la cristalización.

Mutagénesis por PCR, clonación, expresión, protocolos rápidos de purificación de proteínas y cristalización del tipo salvaje y formas mutantes de triptófano sintasa

La viabilidad de las estrategias de secuenciación del genoma completo (WGS) utilizando instrumentos de sobremesa ha simplificado la interrogación del genoma de cada microbio de relevancia para la salud pública en un entorno de laboratorio. Se describe una adaptación metodológica del flujo de trabajo para WGS bacteriano y también se presenta una tubería bioinformática para el análisis.

Caracterización de una cepa patógena de Escherichia coli derivada de granjas de Oreochromis spp.

Aprende a identificar serotipos de Salmonella enterica mediante PCR múltiplex. Este método rápido detecta alelos específicos del antígeno O y flagelina para tipificar Enteritidis, Hadar, Heidelberg y Typhimurium en estudios epidemiológicos.

Una PCR para la identificación de Allelotyping Salmonella enterica Serotipos Enteritidis, Hadar, Heidelberg, y Typhimurium

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