Name: Drosophila pupa inmunohistoquímica Abdomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprende inmunohistoquímica en pupas de Drosophila para estudiar el desarrollo del abdomen adulto. Este protocolo permite visualizar la expresión de proteínas en el epitelio abdominal mediante microscopía de inmunofluorescencia.

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Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencias.

1. Día 1 Antes de empezar: Una población sana de la mosca se debe mantener a través de protocolos estándar de cultivo: eliminar adultos a partir de botellas o frascos después de 3-4 días de huevo-laicos y permitir el desarrollo de proceder a una temperatura constante hasta que vagar 3 de larvas iniciar pupariation. La transición de larva / pupa se caracteriza por la formación de la prepupas (considera 0 horas después de la formación de pupa-APF). Pupas inmóviles se distinguen de los mayores pupas por su coloración blanca y de las larvas que aún no han comenzado pupariation por su alargada, forma redondeada y saliente de los espiráculos anteriores. Usted necesitará: <ul><li> Un pincel para recoger las pupas </li><li> Una cámara húmeda para pupas cultivo: una placa de Petri llenas de toalla de papel húmeda y cubierta con papel de filtro para el marcado varios momentos de la recogida, el genotipo o el sexo de las pupas </li><li> 1X fosfato (PBS) para el lavado de las pupas </li></ul> Recolección, el cultivo y la puesta en escena pupas <ol><li> Con un pincel mojado retire suavemente 0hr pupas APF de las botellas de la cultura / viales y colóquelos en la tapa de la cámara húmeda. </li><li> Utilizando el pincel y PBS 1X lavar suavemente las pupas para eliminar los restos de la caja pupa </li><li> Si es necesario ordenar las pupas por sexo. Los primordios de las gónadas de las pupas se pueden utilizar para ordenar los sexos. El macho primordios gonadales son un par de discos lateral translúcida fácilmente visible a través de la cutícula pupal aproximadamente 2 / 3 a lo largo del cuerpo 5. La hembra primordios gonadales son más pequeños y no se identifican con la misma facilidad. </li><li> Colocar las pupas en la posición estén debidamente etiquetados en la cámara húmeda y se vuelva a la temperatura constante. La cultura hasta el punto de tiempo de desarrollo apropiado. </li></ol> 2. Día 2: Disección, fijación e incubación del anticuerpo primario Antes de empezar: Usted necesitará: <ul><li> La disección estereoscópica </li><li> Fórceps quirúrgicos </li><li> Bisturí quirúrgico con el número 11 hojas </li><li> Dos de nueve y platos de cristal depresión (Corning # 7220-85) <ul><li> Llenar los pozos de una placa con PBS 1X: Este es el plato lavado para la limpieza de las pupas disecados </li><li> Llenar los pozos de segundo plato con el tampón de fijación </li></ul></li><li> Cámara húmeda para la incubación de anticuerpos. Utilizamos cajas de plástico herméticos sándwich cubierto con toallas de papel húmedas. </li><li> Tampón de fijación: 1x PBS, paraformaldehído al 4%, 0,2% de ácido desoxicólico (para la permeabilización) </li><li> Plataforma de disección: portaobjetos abierto con un trozo de cinta de doble cara adherido a un lado </li><li> 1X PBS </li><li> p100 o p200 pipeta </li></ul> Disección <ol><li> El uso de pinzas retire suavemente una pupa en un momento y lugar en la plataforma de disección con el extremo anterior de la pupa se enfrenta el amplio ancho de la cinta. Si pupas son excesivamente húmedo, primera mancha secar con una toalla de papel. </li><li> Antes de las pupas tienen completamente adherido a la cinta, utilice una brocha para la posición. </li><li> Permita que las pupas se sequen al aire y se adhieren a la cinta (5-10 minutos) </li><li> Con el bisturí quirúrgico diseccionar cada pupas bilateral. Esto se logra mejor con un solo corte rápido de la parte anterior del extremo posterior de la pupa. Si se hace correctamente, el corte será dividir en dos pares de espiráculos anteriores y posteriores. Diseccionar no más de 10 pupas en un momento como el lavado y limpieza de las muestras con rapidez es necesaria para evitar daños a los tejidos proteolíticas. </li><li> Usando un pincel, la transferencia de una pequeña cantidad de PBS 1X a cada pupas disecados para evitar que se peguen a la cinta. </li></ol> Limpieza, fijación y la incubación del anticuerpo primario <ol start="6"><li> Con un par de pinzas quirúrgicas captar un individuo medio pupa anterior e inmediatamente se sumergen en un pozo de la placa de enjuague. La plataforma de la disección debe ser sustituido por el plato de enjuague en la platina del microscopio. El caso de las pupas se debe dejar en la muestra hasta que se complete el proceso y las muestras están listas para el montaje. </li><li> Aunque sin soltar la mitad pupa utilizar una pipeta para lavar suavemente el tejido interno del abdomen. El exceso de presión durante el lavado se puede llevar a la pérdida de las células epiteliales. </li><li> Inmediatamente la transferencia de la limpieza medio pupa para amortiguar la fijación a temperatura ambiente y el proceso de los restantes pupa mitades de manera similar. Con la práctica, la disección y el lavado de 20 mitades pupa debe tener menos de 5 minutos. </li><li> Permita que las pupas de incubación en tampón de fijación a temperatura ambiente durante 1 (una) hora. </li><li> Enjuague fija pupas 3x cinco minutos en PBS 1X </li><li> Las muestras pueden ser inmediatamente procesados ​​para inmunohistoquímica o se puede almacenar en el 100% de etanol a -20 ° C hasta por 3 meses sin pérdida de las células o reactividad epítopo. </li><li> Para almacenar las muestras, las muestras se equilibran a través de una diluciónserie de PBS: EtOH (3:1, 1:1, 1:3) a temperatura ambiente durante 20 minutos en cada dilución antes de transferirlos al EtOH al 100%. </li><li> Las muestras deben ser re-equilibrada en PBS a través de la serie antes de la transformación inversa para inmunohistoquímica. </li><li> Bloque de muestras en 1x PBS (complementado con bovinos 2% de albúmina sérica) a 1 (una) hora antes de la adición del anticuerpo primario. </li><li> Se incuba con el anticuerpo primario diluido a la concentración adecuada en 1X PBS durante la noche a 4 ° C, sin balanceo. </li></ol> 3. Día 3: incubación del anticuerpo secundario, el montaje y la imagen Antes de empezar: Usted necesitará: <ul><li> Dos pinzas quirúrgicas </li><li> Medios de montaje (glicerol, Vectashield [Vector Labs], o Slowfade Oro [Invitrogen]) </li><li> Diapositivas depresión microscopio y (0,8 mm) </li><li> Cubreobjetos (24 x 40 mm) </li></ul> Incubación del anticuerpo secundario y montaje: <ol><li> Lávese las muestras de 3x 10 minutos cada uno con PBS 1x </li><li> Bloque de muestras en 1x PBS (complementado con bovinos 2% de albúmina sérica) a 1 (una) hora antes de la adición del anticuerpo secundario. </li><li> Incubar con el anticuerpo secundario diluido a la concentración adecuada en 1X PBS a temperatura ambiente en la oscuridad sin balanceo de 3 (tres) horas. </li><li> Lávese las muestras de 3x 10 minutos cada uno con PBS 1x </li><li> En su caso, de contraste pupas (Ejemplo que mancha los núcleos con DAPI [4 ',6-diamidino-2-phenylindole] diluido en PBS durante 10 minutos). </li><li> Equilibrar las muestras (un mínimo de 30 minutos) en un medio adecuado antes de montar. </li><li> Prepare una diapositiva de muestra. La morfología de las pupas impide el montaje plano. Las muestras se montan en el pozo de la depresión de una diapositiva (slide drop) para obtener imágenes. Lugar de 75 100 ul de medio de montaje en la depresión también. Varias muestras pueden ser montados en una sola diapositiva. </li><li> El caso de pupa se debe quitar de las muestras antes de su montaje. Tome un individuo pupa caso anterior asegurándose de no comprender la membrana interna de pupa. </li><li> Con un segundo par de pinzas de agarre suave de la membrana interna de las pupas de la cabeza y sacarlo de la envoltura pupal. </li><li> Inmediatamente la transferencia de la muestra a la depresión, así y continuar el procesamiento de muestras adicionales. </li><li> Usando una posición de la sonda o con pinzas las muestras de manera uniforme en la depresión y con la superficie lateral hacia arriba. Burbujas de vez en cuando el aire puede ser removido con una sonda. </li><li> Baje suavemente el cubreobjetos sobre las muestras con cuidado de no introducir burbujas de aire </li></ol> 4. Los resultados representativos: Las muestras preparadas con este protocolo conservar la morfología general del abdomen adulto. Las pilas de la imagen puede ser proyectada para generar una imagen de dos dimensiones o de la prestación en 3-D puede ser aplicado para investigar la topología de abdomen. <img src="/files/ftp_upload/3139/3139fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Productos de la segmentación de genes en Drosophila pupas proteína sin alas y la expresión Engrailed (In-GAL4: UAS-GFP). Se visualizaron en 26 horas después de la formación pupario (APF) con el ratón anti-WG (4D4: Iowa hibridoma Banco) y anti-GFP. Un aumento de 10x, es anterior a la izquierda y dorsal está arriba. Núcleos se counterstained con DAPI. Las pilas de aproximadamente 50 imágenes (ΔZ entre rebanadas es 2.5μm) fueron proyectados.

<ol><li>Kopp, A., Duncan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anteroposterior+patterning+in+adult+abdominal+segments+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila.</a> Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).</li>
<li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li>
<li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+rearrangements%2C+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li>
<li>Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).</li>
<li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Growth+of+the+Gonads+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 16, 212-224 (1931).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Las técnicas presentadas en este video se puede utilizar para preparar Drosophila pupa de una variedad de puntos de tiempo de desarrollo. Pupas procesado durante el período de 24 horas a 32 horas APF APF son más propensos a la pérdida de células del epitelio. El uso de detergentes (como el Triton X-100 y Tween-20) durante las etapas de incubación prolongado aumenta la probabilidad de pérdida de células y por lo tanto no se recomienda. Por el contrario, ácido desoxicólico se utiliza como un detergente durante la etapa de fijación inicial. Todos los pasos posteriores se realizan en PBS 1X sin detergente. Además, meciéndose muestras durante las etapas de incubación prolongado aumenta la pérdida de células y se debe evitar. Las muestras pueden tomarse imágenes mediante técnicas de microscopía confocal. Sin embargo, Drosophila pupas procesaron como se describe también se pueden visualizar mediante un sistema de iluminación microscopía estructurado dando una calidad de imagen comparable a las técnicas de confocal.

<ul><li> La disección estereoscópica </li><li> Fórceps quirúrgicos </li><li> Bisturí quirúrgico con el número 11 hojas </li><li> Nueve y platos de cristal depresión (Corning producto # 7220-85) </li><li> Cámara húmeda para el cultivo de pupas </li><li> 1X fosfato (PBS) </li><li> # 11 bisturí quirúrgico </li><li> cinta de doble cara </li><li> Tampón de fijación: 1x PBS, paraformaldehído al 4%, 0,2% de ácido desoxicólico (para la permeabilización) </li><li> p100 o p200 pipeta </li><li> Diapositivas depresión microscopio y (0,8 mm) </li></ul>

drosophila pupa inmunohistoquímica abdomen

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

El abdomen de Drosophila pupa es un sistema modelo establecido para el estudio de la morfogénesis del epitelio y el desarrollo de morfologías sexualmente dimórficos 1-3. Durante la fase de pupa, que se extiende por aproximadamente 96 horas (a 25 ° C), las poblaciones de la proliferación de las células imaginales reemplazar la epidermis larval para generar los segmentos abdominales adulto. Estas células imaginal, nacido durante la embriogénesis, existen como pares de nidos histoblast lateral en cada segmento abdominal de las larvas. Cuatro pares de nidos histoblast dar lugar a la cutícula del adulto dorsal (nidos dorsal anterior y posterior), la cutícula ventral (nidos ventral) y los espiráculos asociados a cada segmento (nidos espiráculo) 4. Al puparation, estas células diploides (que se distingue por el tamaño de las larvas más grandes poliploides células epidérmicas-LEC) iniciar un proceso estereotipado de la proliferación, la migración y la sustitución de la LEC. Varias herramientas moleculares y genéticos pueden ser empleados para investigar la contribución de mecanismos genéticos implicados en la morfogénesis del abdomen adulto. Fenotipos última adultos suelen ser analizado después de la disección de los adultos cutículas abdominal. Sin embargo, la investigación de los procesos moleculares que subyacen requiere un análisis inmunohistoquímico del epitelio de pupa, que presentan desafíos únicos. Temporalmente la morfogénesis dinámica y las interacciones de dos poblaciones distintas epiteliales (las larvas y imaginal) generar un tejido frágiles propensas a la pérdida excesiva de células durante la disección y posterior procesamiento. Hemos desarrollado métodos de disección, fijación, montaje y la imagen del epitelio abdominem Drosophila pupa para estudios inmunohistoquímicos que generan consistentes muestras de alta calidad adecuada para la microscopía de fluorescencia confocal o estándar.

Tinción de los anticuerpos<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupas pueden mejorar los análisis genéticos de los adultos la genética del desarrollo abdominal. Se presenta el protocolo para la tinción de la disección, la fijación de anticuerpos y de escena<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal abdomen.

Drosophila pupa inmunohistoquímica Abdomen

El abdomen de la pupa de Drosophila es un sistema modelo establecido para el estudio de la morfogénesis epitelial y el desarrollo de estructuras sexualmente dimórficas...

El objetivo general de este procedimiento es preparar el epitelio abdominal de drosophila puy para inmunohistoquímica. Esto se logra primero mediante la disección bilateral de la etapa de drosophila puy, y la eliminación de los órganos internos de manera que solo quede el epitelio abdominal compuesto por células imaginales en proliferación, sus osteoblastos y células epidérmicas larvales unidas a la membrana pupal.A continuación, el tejido se fija, se incuba con anticuerpos, se eliminan los anticuerpos del exterior del caso del pupilio y se visualiza mediante microscopía de inmunofluorescencia para mostrar la morfología general del epitelio abdominal y la expresión de las proteínas de interés. Hola, soy John Yoder. Mi laboratorio está en la Universidad de Alabama, en el Departamento de Ciencias Biológicas.Hola, soy We Won, un estudiante colaborador en el laboratorio Yoda. Hoy les mostraremos nuestro método para la disección de la mosca de la fruta, la cúpula, y la inmunohistoquímica del abdomen de la pupa de Drosophila.Este método puede utilizarse para investigar los procesos de morfogénesis epitelial y reorganización tisular. Utilizamos específicamente esta técnica para estudiar el desarrollo de la morfología sexualmente dimórfica del abdomen de Drosophila adulta. A partir de un vial de población a 25 grados Celsius sin adultos identificados, se consideran cero horas posteriores a la ecdysis (APF) los puy recientemente inmovilizados con cutículas que aún no han comenzado a oscurecerse. Usando un pincel humedecido, retire suavemente estos puy y colóquelos sobre la tapa de una cámara humidificada. Con el pincel y PBS, lave suavemente los restos de las cáscaras de los puy si es necesario.Clasifique los PUY por sexo en cero horas. Los primordios del macho PF son fácilmente visibles a través de la cutícula del pupario. Aproximadamente a dos tercios del camino hacia abajo del cuerpo, los primordios del goad hembra son más pequeños y no se identifican tan fácilmente.Ahora, coloque el pube sobre el papel de filtro humedecido en la cámara humidificada. Reemplace la tapa y devuélvalos a un ambiente de temperatura constante. Cuando los animales hayan alcanzado el punto temporal de desarrollo de interés, continúe con la disección.Téngase en cuenta que los ojos procesados entre 24 y 32 horas A PF son los más propensos a la pérdida de células epiteliales durante el procesamiento posterior. Prepárese para la disección colocando un trozo de cinta adhesiva de doble cara a lo largo de un lado de un portaobjetos transparente. Luego, utilice pinzas para agarrar suavemente cada pupila entre las esferas anteriores y colóquelas sobre la cinta con el lado dorsal hacia arriba.Coloque un máximo de 10 EPP de esta manera o correrá el riesgo de trabajar demasiado lentamente. En cinco a 10 minutos, los EPP estarán completamente adheridos, pero antes de que esto suceda, utilice un pincel para espaciarlos uniformemente y colocarlos en paralelo. El secado prolongado en esta etapa disminuirá su calidad.Así que actúe rápidamente. Ahora use un escalpelo quirúrgico para diseccionar bilateralmente cada pupa A. Realice un único corte rápido desde el extremo anterior hasta el extremo posterior de la pupa.Si se realiza correctamente, el corte dividirá por la mitad ambos pares esféricos anterior y posterior, produciendo mitades izquierda y derecha simétricas para soltar la pupa de la cinta. Utilice un pincel para aplicar una pequeña cantidad de PBS a cada pupa diseccionada usando fórceps quirúrgicos. Sujete una mitad de la pupa por su extremo anterior y sumérjala en un recipiente de enjuague lleno de PBS sobre la platina del microscopio de disección; mientras sigue sosteniendo la pupa, use una pipeta para lavar suavemente los tejidos internos bombeando PBS dentro de la cavidad abdominal.Evite aplicar demasiada presión, ya que las células se perderán del epitelio. Sumerja inmediatamente el tejido limpio en 400 microlitros de tampón de fijación a temperatura ambiente y limpie todas las mitades de la pupa. De manera similar, con la práctica, la disección y el lavado de 20 mitades de PU deberían tomar menos de cinco minutos.Deje que el puy incube en el tampón de fijación a temperatura ambiente durante una hora, y luego enjuáguelos tres veces con 400 microlitros de PBS durante cinco minutos por cada lavado. Para almacenar las muestras primero, enjuáguelas dos veces con metanol al 100 %, luego transfiéralas a etanol al 100 % para su almacenamiento. Estas muestras pueden almacenarse en etanol al 100 % a menos 20 grados Celsius durante hasta tres meses sin pérdida de células ni reactividad de epítopos.Para procesar las muestras almacenadas, primero deben rehidratarse en PBS mediante una serie de etanol. Continúe con la inmunohistoquímica bloqueando las muestras en PBS con 2 %BSA durante una hora a temperatura ambiente y sin agitación. Agitar las muestras aumenta considerablemente la pérdida celular del epitelio abdominal.A continuación, sustituya la solución bloqueadora por el anticuerpo primario diluido a la concentración adecuada en PBS. Incube las muestras durante la noche a cuatro grados Celsius sin agitación y en una cámara cerrada y humedecida para prevenir la evaporación al día siguiente. Lave las muestras tres veces en PBS sin agitación y durante 10 minutos por cada lavado.Luego bloquee las muestras durante una hora sin agitación en PBS con 2% de BSA. Reemplace la solución de bloqueo por el anticuerpo secundario a temperatura ambiente en PBS. A continuación, incube las muestras a oscuras durante tres horas y sin agitación.Siga el anticuerpo secundario con tres lavados en PBS durante 10 minutos cada uno, si es apropiado. Contratiña la muestra, por ejemplo, los núcleos pueden teñirse con una incubación de 10 minutos en DAPI diluido en PBS. A continuación, iguale las muestras en medio de montaje durante un mínimo de 30 minutos.Para montar las muestras, sujete cada cápsula del pupilo por la parte anterior, evitando la membrana pupilar interna con un segundo par de pinzas. Sujete suavemente la membrana pupilar interna por la cabeza. Luego, retire con cuidado la muestra de la cápsula del pupilo.Transfiera la muestra de unca a una placa con cavidad con 75 a 100 microlitros de medio de montaje. Varias muestras pueden colocarse en una sola placa. Ahora use una sonda y pinzas para posicionar uniformemente las muestras en la cavidad.Gire los pocillos de modo que sus superficies laterales queden orientadas hacia arriba y elimine cualquier burbuja de aire con una sonda. Finalmente, baje suavemente la lámina de cubierta sobre las muestras sin introducir burbujas de aire para esta preparación. La microscopía de iluminación estructurada será comparable a las técnicas confocales.Esta es una proyección de 50 imágenes confocales con 2,5 micrómetros entre cortes. El tejido se encuentra a 26 horas post-fertilización, y la tinción muestra el patrón de expresión de la proteína wingless, GFP regulado por grail y los núcleos. La parte anterior está a la izquierda y las estructuras dorsales se ubican en la parte superior de la pantalla.Esta película demuestra cómo el procedimiento conserva la morfología macroscópica de las muestras, permitiendo así la reconstrucción tridimensional de pilas de imágenes. Se pueden disectar varias docenas de pupilas y colocar en tampón de fijación en menos de 30 minutos.Además, las muestras preparadas utilizando este protocolo son adecuadas para hibridación in situ, lo que convierte a este protocolo en una herramienta valiosa para estudios de expresión génica.

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Investigación

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Biología

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