Estimulación de las neuronas sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal mediante un agonista del receptor de neuropéptidos

Tome una placa de pocillos múltiples que contenga neuronas sensoriales ganglionares de la raíz dorsal de rata transfectadas.

Las neuronas del pozo de prueba exhiben una expresión reducida del receptor de neuropéptidos, mientras que las neuronas del pozo de control exhiben niveles fisiológicos de expresión del receptor de neuropéptidos.

Reemplace el medio con medios sin suero para proporcionar un entorno controlado para una respuesta de estimulación precisa.

Agregue un agonista del receptor neuropeptídico a los pocillos y mezcle. Incuba el plato.

En el pozo de control, el agonista del receptor neuropeptídico se une a los receptores diana, desencadenando una cascada de señalización intracelular que libera neurotransmisores.

Sin embargo, en los pocillos de prueba, la expresión reducida del receptor de neuropéptidos limita la unión de agonistas, lo que lleva a una disminución de la liberación de neurotransmisores en comparación con el control.

Después de la incubación, recoja los medios de los pocillos y centrifugue.

Transfiera el sobrenadante a tubos y use un inmunoensayo adecuado para medir los niveles de neurotransmisores. La muestra de control exhibe una mayor liberación de neurotransmisores que la muestra de prueba después de la estimulación con agonistas de neurorreceptores.

El día 6, después de la siembra y 72 horas después de la transfección de ARNip, cambie el medio de cultivo a 200 microlitros de medio sin suero. Después de una incubación de 30 minutos, agregue 1 microlitro del químico de estimulación y mezcle suavemente mediante pipeteo. Después de incubar durante el período requerido, recoja el medio de cultivo de la placa de cultivo y centrifugue a 5.000 veces g durante 5 minutos a 4 grados centígrados para eliminar las impurezas en suspensión. Recoja el sobrenadante de la centrifugación y diluya con solución salina tamponada con fosfato según sea necesario.