Análisis cuantitativo de Reposición Synaptic piscina vesículas en cultivos de neuronas granulares del cerebelo con tintes FM

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar la reposición y movilización de los grupos específicos de vesículas sinápticas en las terminales nerviosas centrales utilizando técnicas de imagen de fluorescencia en vivo. Esto se logra mediante el monitoreo de dos rondas de reciclaje de vesículas sinápticas, utilizando colorantes FM en las mismas terminales nerviosas para proporcionar controles internos válidos. Como segundo paso, el grupo fácilmente liberable y el grupo de reserva se agotan secuencialmente utilizando protocolos de descarga específicos, que permiten la cuantificación de los tamaños relativos del grupo.

A continuación, cambie las condiciones de carga o descarga para estudiar el efecto de la variación elegida en la vesícula sináptica, la reposición del grupo o la movilización. Los resultados muestran que la carga de FM d de diferentes grupos físicos sinápticos es reproducible a partir de la cuantificación y el análisis de la descarga de colorante evocado. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la familia fluida de reporteros genéticos, es que esta técnica rastrea la reposición de los grupos específicamente por las vesículas sinápticas, que han sufrido endocitosis.

También permite una cuantificación precisa. Ya que este protocolo se realiza dos veces en las mismas terminales nerviosas proporcionando un control interno. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la sináptica, la CLE, la endocitosis y la exocitosis, como por ejemplo cómo la manipulación en modos específicos de endocitosis puede afectar a la reposición tanto de la reserva de reciclaje total como de las reservas de CLE sináptico dentro de ella, como la piscina fácilmente reutilizable y la reserva de reserva.

La configuración experimental básica debe consistir en un microscopio de epifluorescencia invertida, una cámara CCD refrigerada, una fuente de luz fluorescente, un aparato de perfusión por gravedad, una cámara de imágenes con electrodos de platino paralelos y un estimulador eléctrico y una computadora. Realice los experimentos en la oscuridad o en condiciones de luz roja con una iluminación fluorescente mínima de la muestra para evitar el blanqueo del tinte FM. Comience este procedimiento utilizando crías de rata spra dolly de siete días de edad para preparar los cultivos primarios de neuronas granulosas cerebelosas.

Después de que se hayan preparado los cultivos, coloque las neuronas en el centro de un cubreobjetos de 25 milímetros recubierto de lisina poli D en una gota, que no exceda los siete milímetros de diámetro después de una hora, agregue dos mililitros de medio de cultivo a las neuronas después de siete días. Coloque un solo cubreobjetos en la solución salina a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la estabilización en el nuevo medio. Después de eso, retire el cubreobjetos, seque su parte inferior y el área que rodea las celdas adjuntas con un pequeño trozo de toalla de papel o papel absorbente.

A continuación, utilice la grasa de silicona para pegar el cubreobjetos al fondo de la cámara de imagen. Las celdas deben estar entre los dos cables paralelos. Use suficiente grasa de silicona para sellar completamente la cámara sin invadir el centro de la cámara de baño.

A continuación, llene suavemente la cámara de baño con una solución salina de unos 260 microlitros. A continuación, llene los tubos de entrada y salida con la misma solución. Selle la cámara pegando un cubreobjetos limpio con grasa de silicona en la parte superior.

Después de eso, elimine las burbujas de aire atrapadas en la cámara con los tubos de entrada y salida. A continuación, inmovilice la cámara de imágenes en una plataforma de acero inoxidable. Compruebe si hay fugas frotando suavemente la solución salina a través del tubo de entrada.

El siguiente paso es montar la cámara ensamblada en la platina de un microscopio invertido. Prepare la entrada del sistema de perfusión por gravedad con solución salina y conecte la cámara a la entrada. Luego conecte los cables de conexión de la cámara al estimulador eléctrico.

Perfunde las neuronas con 1,5 mililitros de colorante fm diluido. Posteriormente, estimule las neuronas usando el estimulador adjunto para evocar la absorción del tinte Después de la estimulación, perfunda las neuronas con solución salina fresca durante dos minutos para lavar el exceso de tinte FM. A continuación, mantenga las neuronas en la solución salina durante ocho minutos.

Mientras tanto, localice las redes axonales donde son visibles los terminales nerviosos individuales cargados de FM D. Uso de longitudes de onda de fluoresceína. Evite las áreas con grupos de celdas.

A continuación, vuelva a enfocar la imagen inmediatamente antes de la adquisición de la imagen, ya que es posible que se haya producido una ligera deriva durante el período de descanso. Comience la adquisición de imágenes de lapso de tiempo a una velocidad de un fotograma cada cuatro segundos. Después de adquirir de cinco a 10 imágenes de referencia, evoque la exocitosis de la piscina fácilmente liberable mediante la administración de una estimulación de 30 hercios durante dos segundos.

Después de adquirir otras 10 imágenes, evocar vesícula sináptica, exocitosis de la piscina de reserva utilizando tres estimulaciones de 40 hercios durante 10 segundos con un intervalo de 40 segundos entre estimulaciones, adquirir otras cinco a 10 imágenes. A continuación, pausa la adquisición de la imagen. Deje que las neuronas se recuperen durante al menos 20 minutos y repita este protocolo de una fase S nuevamente en la fase dos S para el experimento de control.

Para el análisis de datos, convierta las imágenes en una pila. Usando una función incorporada de imagen J, luego ajuste el brillo y el contraste de la pila para maximizar el rango dinámico si se ha producido una deriva horizontal significativa. Durante el experimento, ejecute los complementos stack reg y turbo reg en la imagen J para alinear la pila de imágenes.

A continuación, el complemento del analizador de series en tiempo de ejecución. A continuación, defina las regiones de interés en al menos 90 terminales nerviosas. Es útil alternar entre las imágenes antes y después de la descarga del troquel para revelar las terminales nerviosas activas.

Una región ideal de tamaño de interés es una que es ligeramente más grande que una terminal nerviosa típica. A continuación, obtenga la intensidad de fluorescencia total de cada región de interés a lo largo del tiempo. Después de eso, exporte a Microsoft Excel.

Aquí se muestra un diagrama de flujo de un experimento de control en el que las neuronas granulosas cerebelosas se cargaron con 10 micromolares FM 1 43 utilizando una estimulación de 80 hercios y 10 segundos. Aquí hay una imagen que muestra terminales nerviosas cargadas con FM 1 43. Aquí hay la misma imagen que muestra 90 regiones numeradas de interés seleccionadas para el análisis después de identificar las terminales nerviosas activas, y estas son las imágenes de las terminales nerviosas en puntos de tiempo seleccionados.

Estas imágenes se presentan en pseudo color para ilustrar los cambios en la fluorescencia a medida que se agotan los diferentes grupos de vesículas sinápticas. Finalmente, aquí se muestran las unidades fluorescentes normalizadas de estas 90 terminales nerviosas. En las fases S uno y S dos, la caída de fluorescencia de cada estimulación secuencial se puede medir y comparar entre las fases S uno y S dos.

En este experimento de control, tanto S uno como S dos dieron como resultado los mismos tamaños de los grupos fácilmente liberables y de reserva. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la reposición y movilización de grupos de vesículas sinápticas específicas en las terminales nerviosas centrales utilizando técnicas de imágenes de fluorescencia en vida. Al intentar este procedimiento, es importante recordar confirmar la viabilidad y la capacidad de respuesta de la célula realizando los experimentos de control S one antes de variar las condiciones experimentales S two.