Análisis cuantitativo de Reposición Synaptic piscina vesículas en cultivos de neuronas granulares del cerebelo con tintes FM

El objetivo general del siguiente experimento consiste en cuantificar la recarga y movilización de los grupos específicos de vesículas sinápticas en terminales nerviosos centrales mediante técnicas de imagen de fluorescencia en tiempo real. Esto se logra monitoreando dos ciclos de reciclaje de vesículas sinápticas, utilizando colorantes FM en los mismos terminales nerviosos para proporcionar controles internos válidos. Como segundo paso, el grupo de liberación inmediata y el grupo de reserva se agotan secuencialmente mediante protocolos específicos de descarga, lo que permite cuantificar los tamaños relativos de los grupos.

A continuación, cambie las condiciones de carga o descarga para estudiar el efecto de la variación elegida sobre la vesícula sináptica, el reposicionamiento del grupo o su movilización. Los resultados muestran que la carga con FM d de diferentes grupos físicos sinápticos es reproducible según la cuantificación y análisis de la descarga inducida del colorante. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la familia de reporteros genéticos fluorescentes, es que esta técnica rastrea específicamente el reposicionamiento de grupos mediante vesículas sinápticas que han experimentado endocitosis.

También permite una cuantificación precisa. Dado que este protocolo se realiza dos veces en los mismos terminales nerviosos, proporcionando un control interno. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la sinapsis, el CLE, la endocitosis y la exocitosis, como cómo la manipulación de modos específicos de endocitosis puede afectar el reabastecimiento tanto del pool total de reciclaje como de los pools sinápticos de CLE dentro de este, tales como el pool fácilmente reutilizable y el pool de reserva.

El montaje experimental básico debe constar de un microscopio invertido con epifluorescencia, una cámara CCD refrigerada, una fuente de luz fluorescente, un aparato de perfusión por gravedad, una cámara de imagen con electrodos de platino paralelos y un estimulador eléctrico, y un ordenador. Realice los experimentos en la oscuridad o bajo luz roja y con la mínima iluminación fluorescente posible de la muestra para evitar el blanqueo del colorante FM. Comience este procedimiento utilizando crías de rata spra dolly de siete días de edad para preparar los cultivos primarios de neuronas granulares del cerebelo.

Después de preparar los cultivos, siembre las neuronas en el centro de un cubreobjetos de 25 milímetros recubierto con poli-D-lisina en una gota, que no exceda los siete milímetros de diámetro. Transcurrida una hora, agregue dos mililitros de medio de cultivo a las neuronas después de siete días. Coloque un solo cubreobjetos en solución salina a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la estabilización en el nuevo medio. Posteriormente, retire el cubreobjetos, seque su cara inferior y la zona alrededor de las células adheridas con un pequeño trozo de toalla de papel o papel absorbente.

Posteriormente, utilice la grasa de silicona para pegar el cubreobjetos a la base de la cámara de imagen. Las células deben estar entre los dos alambres paralelos. Utilice suficiente grasa de silicona para sellar completamente la cámara sin invadir el centro de la cámara de baño.

A continuación, llene suavemente la cámara del baño con aproximadamente 260 microlitros de solución salina. Luego, llene los tubos de entrada y salida con la misma solución. Selle la cámara pegando un cubreobjetos limpio con grasa de silicona en la parte superior.

Después de eso, retire cualquier burbuja de aire atrapada en la cámara con los tubos de entrada y salida. Luego inmovilice la cámara de imagen en una plataforma de acero inoxidable. Verifique fugas mediante la perfusión suave de solución salina a través del tubo de entrada.

El siguiente paso consiste en montar la cámara ensamblada sobre la platina de un microscopio invertido. Cebre la entrada del sistema de perfusión por gravedad con solución salina y conecte la cámara a la entrada. A continuación, conecte los cables de la cámara al estimulador eléctrico.

Perfunda los neuronas con 1,5 mililitros de colorante fm diluido. Posteriormente, estimule las neuronas utilizando el estimulador adjunto para inducir la captación del colorante. Tras la estimulación, perfunda las neuronas con solución salina fresca durante dos minutos para eliminar el exceso de colorante fm. A continuación, mantenga las neuronas en la solución salina durante ocho minutos.

Mientras tanto, localice las redes axónicas donde sean visibles las terminales nerviosas individuales cargadas con FM D. Utilice longitudes de onda de fluoresceína. Evite las áreas con agrupaciones de células.

Luego, vuelva a enfocar la imagen inmediatamente antes de la adquisición, ya que podría haber ocurrido una ligera deriva durante el período de reposo. Inicie la adquisición de imágenes de lapso de tiempo a una velocidad de un cuadro cada cuatro segundos. Después de adquirir entre cinco y diez imágenes de línea base, induzca la exocitosis del grupo de liberación inmediata mediante una estimulación de 30 hercios durante dos segundos.

Después de adquirir otras 10 imágenes, induzca la exocitosis de vesículas sinápticas del grupo de reserva mediante tres estimulaciones de 40 hertz durante 10 segundos con un intervalo de 40 segundos entre cada estimulación, y adquiera otras cinco a 10 imágenes. Luego detenga la adquisición de imágenes. Permita que las neuronas se recuperen durante al menos 20 minutos y repita nuevamente este protocolo de fase S uno en la fase S dos para el experimento control.

Para el análisis de datos, convierta las imágenes en una pila. Utilizando una función integrada de ImageJ, ajuste luego el brillo y el contraste de la pila para maximizar el rango dinámico si ha ocurrido una deriva horizontal significativa. Durante el experimento, ejecute los complementos StackReg y TurboReg en ImageJ para alinear la pila de imágenes.

Luego, el complemento analizador de series temporales. A continuación, definir las regiones de interés en al menos 90 terminales nerviosos. Es útil alternar entre las imágenes antes y después de la descarga del tinte para revelar los terminales nerviosos activos.

Un tamaño ideal de la región de interés es uno ligeramente mayor que un terminal nervioso típico. A continuación, obtenga la intensidad total de fluorescencia de cada región de interés a lo largo del tiempo. Después, exporte a Microsoft Excel.

Se muestra aquí un diagrama de flujo de un experimento control en el que neuronas granulares cerebelosas fueron cargadas con FM 1-43 de 10 micromolares mediante una estimulación de 80 hercios durante 10 segundos. Aquí hay una imagen que muestra terminales nerviosos cargados con FM 1-43. Aquí está la misma imagen mostrando 90 regiones de interés numeradas seleccionadas para análisis tras identificar los terminales nerviosos activos, y estas son las imágenes de los terminales nerviosos en puntos de tiempo seleccionados.

Estas imágenes se presentan en pseudocolor para ilustrar los cambios en la fluorescencia a medida que se agotaron los diferentes grupos de vesículas sinápticas. Finalmente, aquí se muestran las unidades de fluorescencia normalizadas de estos 90 terminales nerviosos. En las fases S uno y S dos, puede medirse la disminución de fluorescencia de cada estimulación secuencial y compararse entre las fases S uno y S dos.

En este experimento control, tanto S uno como S dos produjeron tamaños idénticos de los grupos de vesículas fácilmente liberables y de reserva. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar la reposición y movilización de grupos específicos de vesículas sinápticas en terminales nerviosos centrales utilizando técnicas de imagen de fluorescencia en vivo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar confirmar la viabilidad y la respuesta celular mediante la realización de los experimentos control S uno antes de variar las condiciones experimentales S dos.