Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
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Tome una retina fijada químicamente aislada del ojo de una rata.
El ojo presenta daños inducidos por el calor en el plexo vascular limbal, una red de vasos sanguíneos que rodean la córnea.
Este daño bloquea el drenaje de líquidos, aumentando la presión intraocular (PIO) y causando degeneración de las células ganglionares de la retina (RGC).
Tratar la retina con una solución de permeabilización para permeabilizar las membranas celulares y nucleares.
Aplicar una solución de bloqueo para evitar la unión de anticuerpos no específicos.
Eliminar la solución de bloqueo.
Introducir anticuerpos primarios que se dirigen a un factor de transcripción expresado predominantemente en RGC.
Wash para eliminar los anticuerpos no unidos.
Introducir anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos que se unan a los anticuerpos primarios.
Wash para eliminar los anticuerpos no unidos.
Contratiña los núcleos con un colorante de unión al ADN.
Lave la retina y móntela en un portaobjetos de vidrio con un medio de montaje adecuado.
Visualice la retina bajo un microscopio de epifluorescencia.
Una densidad celular reducida en el ojo dañado en comparación con el control confirma la degeneración de RGC debido al aumento de la PIO.
Después de aislar las retinas, transfiéralas a una placa de cultivo de 24 pocillos que contenga 1 mililitro de PBS, manteniendo la retina interna hacia arriba. Permeabilizar el tejido lavándolo con un tensioactivo no iónico al 0,5% diluido en PBS. A continuación, incubar el tejido en una solución bloqueadora durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave. Durante la incubación, prepare la solución de anticuerpos primarios BRM 3A y guárdela a 4 grados centígrados.
Después del bloqueo tisular, incube las retinas en 200 microlitros de solución de anticuerpos primarios a 4 grados centígrados durante 72 horas con agitación suave. A continuación, lave el pañuelo con PBS. Incube el tejido en 200 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios durante dos horas a temperatura ambiente, y luego con una solución de contratinción nuclear durante 10 minutos para la tinción de núcleos fluorescentes.
Después de tres lavados PBS, transfiera la retina a un portaobjetos de microscopio de vidrio con dos cepillos pequeños, manteniendo el lado vítreo hacia arriba. Coloque el cuadrante dorsal de la retina en el portaobjetos del microscopio. Finalmente, aplique 200 microlitros de medio de montaje antidecoloración en un cubreobjetos de vidrio y colóquelo en la retina montada plana para un análisis microscópico. Bajo un microscopio de epifluorescencia confocal con un objetivo de aumento de 40 veces, examine las monturas planas para estimar las células ganglionares de la retina.