Un análisis cuantitativo de la insulina que expresan la formación de colonias de progenitores

Este video demuestra un procedimiento para generar cultivos tridimensionales que permiten que los progenitores similares a los pancreáticos se diferencien en colonias que expresan insulina. Primero, las células diferenciadas derivadas de una línea de células madre embrionarias murinas con inserción génica de neurogenina tres EGFP se disocian y se clasifican según la expresión de EGFP para enriquecer los progenitores de tipo endocrino. Las células individuales clasificadas positivas para EGFP se siembran en un medio semisólido que contiene matrigel y factores de crecimiento.

Esto limita el movimiento de células progenitoras individuales, al tiempo que permite su supervivencia, proliferación y diferenciación in vitro. A continuación, se contabilizaron y puntuaron bajo microscopio el número de colonias resultantes con morfología distintiva para calcular la frecuencia de progenitores formadores de colonias en una población ordenada determinada. El análisis de colonias individuales mediante PCR en tiempo real y microscopía de inmunofluorescencia revela expresión de insulina en colonias derivadas de células positivas para ngn tres, pero no en aquellas derivadas de células negativas para NGN tres.

La principal ventaja de utilizar esta técnica frente a técnicas existentes, como los esferoides pancreáticos en cultivo en suspensión, es que permite examinar simultáneamente una mayor cantidad de células en un solo momento para evaluar su capacidad intrínseca de formar colonias progenitoras. Este método puede ayudar a responder preguntas relacionadas con la biología de las células madre y progenitoras pancreáticas, como qué marcadores expresan las células progenitoras y qué factores intrínsecos o extrínsecos son importantes para el mantenimiento de la autorrenovación y la diferenciación de estas células. Las implicaciones de esta técnica podrían extenderse hacia la terapia de la diabetes tipo uno, ya que si las células progenitoras pancreáticas pueden identificarse y diferenciarse hacia células similares a beta, entonces dichas células podrían utilizarse para reemplazar las células beta dañadas en pacientes con diabetes tipo uno en estadio terminal.

También puede aplicarse a otros sistemas, como el estudio de la colonia, las células progenitoras formadoras del páncreas posnatal y adulto, médula ósea, hígado y bazo. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque disociar las células en una suspensión de células individuales y manipular el Matrigel y la metilcelulosa durante la preparación para su dispensación puede resultar complicado. Tuve por primera vez la idea de este método cuando reconocí que no existía un ensayo clonogénico para abordar la relación de linaje entre las células progenitoras y sus progenias diferenciadas del páncreas.

Este tipo de ensayo de colonias ha sido fundamental para estudiar en el pasado las células madre hematopoyéticas y las células progenitoras. Reconozco la necesidad de un ensayo de este tipo para investigar la biología de las células madre pancreáticas. La demostración visual de este método es fundamental porque el componente de medio semisólido es viscoso por naturaleza, y los pasos de preparación y dispensación son difíciles de aprender.

Quienes demostrarán los procedimientos serán el señor Michael Winkler, estudiante de maestría, la señorita Nancy, técnica especializada, y el Dr. Lang Jing, investigador posdoctoral de un laboratorio, para generar medio acondicionado para el ensayo de colonias que se realizará posteriormente. Las células ES neuronales se diferencian en células similares a las pancreáticas in vitro. Inicie este procedimiento examinando cuerpos embrionarios de seis días de antigüedad bajo un microscopio óptico.

Al menos el 30 al 40 % de ellos deben tener un diámetro de al menos 150 micrones. El cuerpo embrionario más grande debe contener manchas oscuras que sugieran una diferenciación mejorada. Transfiera de 80 a 100 cuerpos embrionarios a cada pocillo de una placa de seis pocillos con fondo adherente y luego agite suavemente la placa para agrupar los cuerpos embrionarios en el centro de los pocillos, con el fin de aumentar los contactos entre célula y célula.

Estos contactos dan lugar a un mejor desarrollo de células similares a las pancreáticas a partir de cuerpos embrionarios. Coloque suavemente las placas de nuevo en el incubador a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono en cultivo. Un 13.

Sustituya el medio por medio de cultivo de adhesión fresco que contenga nicotinamida al 4 y factor recombinante humano activo en beta B para inducir la diferenciación de células endocrinas. A continuación, devuelva los cultivos al incubador en cultivo. En el día 16, recolecte el medio y filtre a través de una membrana de polietersulfato de 0,2 micrones para eliminar cualquier resto celular.

A partir de este momento, el medio recolectado se denominará medio acondicionado. Aliquotar los medios acondicionados en tubos cónicos de polipropileno de 15 mililitros y almacenarlos a menos 80 grados Celsius hasta justo antes de su uso. Neurogén en tres es un factor de transcripción expresado por precursores endocrinos pancreáticos durante el desarrollo. Los precursores endocrinos que expresan neurogén en tres finalmente se diferencian en células alfa, beta, delta, épsilon y en células que expresan polipéptido pancreático. Para facilitar la identificación de las células que expresan NGN tres, un alelo del locus NGN tres fue reemplazado por el gen reportero EGFP en una línea celular ES murina de tipo knockin. La línea celular resultante se denominó NGN tres EGFP. Para obtener células diferenciadas positivas para NGN tres EGFP y negativas para NGN tres EGFP.

Las células se separan primero de las placas de cultivo mediante tripsina el día 16 para obtener una suspensión de células individuales. Los agregados celulares se incuban con colagenasa B y DNAsa I y se pasan a través de una malla de 40 o 70 micrones. A continuación, se añade DPI y las células se clasifican en un citómetro de flujo para separar según la dispersión directa y la dispersión lateral, que indican el tamaño celular y la granularidad, respectivamente, y se representan gráficamente.

Luego se traza una compuerta para eliminar los restos no celulares. Se utiliza el DPI para discriminar las células muertas, que se tiñen positivas. Cuando se excitan a entre 405 y 413 nanómetros y la emisión se detecta con un filtro de 454/40 y compuerta de ancho de pulso, el ancho del pulso electrónico de dispersión directa revela dobletes, que deben eliminarse antes de pasar por la compuerta del clasificador celular activado por fluorescencia del canal EGFP FL1 frente a autofluorescencia.

Utilizando células del día 16 de una línea celular parental de control, como la TL mostrada en el panel izquierdo, se ilumina la fluorescencia real y, por lo tanto, la población de células positivas para NGN tres EEG FP puede visualizarse como se observa en el panel derecho. La puerta de ordenación por flujo para las células positivas de NGN tres EGFP se desplaza intencionadamente hacia la derecha, como indica la flecha, con el fin de limitar la contaminación por células negativas para NGN tres EEG FP durante la clasificación. Una vez establecidas las puertas, se clasifican y almacenan en hielo hasta su uso las células positivas para NGN tres EEG FP y las células negativas para NGN tres EGFP, previo a su siembra.

Coloque el matri gel sobre hielo a cuatro grados Celsius la noche anterior al experimento. El día del experimento, coloque los siguientes reactivos o soluciones sobre hielo: D-M-E-M-F 12, medio condicionado con metilcelulosa, FCS, nicotinamida, XTEND en cuatro, VEGF A y recombinante humano activo en beta B. Coloque una caja estéril de puntas de pipeta de 200 microlitros a menos 20 grados Celsius al menos media hora antes de su uso. Para la preparación de la siembra de las células ordenadas, primero se deben añadir los componentes del medio semisólido a un tubo de poliestireno de cinco mililitros. Primero, utilice una aguja de calibre 16 y medio para aspirar una pequeña cantidad de solución de metilcelulosa al 3,3 % en una jeringa.

Luego, empuje inmediatamente la solución hacia afuera para expulsar el aire. Esto llenará el espacio muerto de la jeringa con la solución y facilitará una medición correcta del volumen de la solución semisólida. A continuación, evitando la formación de burbujas de aire, aspire y dispense el volumen previsto de solución de metilcelulosa en un tubo de cinco mililitros.

Agregue el medio condicionado FCS nicotinamida que extiende cuatro activos en beta B, VEGF A y D-M-E-M-F 12. Luego, utilice puntas de pipeta frías para agregar el matrigel. Por último, agregue la cantidad deseada de células ordenadas al tubo de cinco mililitros.

Agregue siempre las células al final para evitar la estimulación prematura de las mismas. Luego, tape firmemente el tubo y agite los tubos enérgica y completamente a mano. Dado que la agitación genera burbujas de aire, coloque los tubos en hielo durante cinco minutos o hasta que las pequeñas burbujas suban a la superficie.

Utilizando una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 18 y medio, aspire una pequeña cantidad de la mezcla celular de medio semisólido y expulse inmediatamente el aire presente en la jeringa. Luego, dispense lentamente 500 microlitros de la mezcla celular semisólida directamente en el centro de cada pocillo de una placa de 24 pocillos con baja adherencia. Cada muestra debe sembrarse en cuádruple réplica, utilizando únicamente las cuatro columnas internas de la placa de 24 pocillos orientada horizontalmente para el cultivo.

Llene los pozos restantes con agua estéril para ayudar a la humidificación del cultivo celular. Inmediatamente después de sembrar, observe las células bajo un microscopio óptico.

Las células individuales se distribuyen aleatoria y uniformemente en los pocillos. Incubar las células a 37 grados Celsius y en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono durante ocho a 12 días. Después de la incubación de ocho a 12 días, observar nuevamente las células bajo un microscopio.

Este es un buen ejemplo de matrigel distribuido uniformemente en cultivo. A continuación se muestra un ejemplo de matri gel distribuido de forma irregular, lo que resulta en el marco Apache. Las colonias no crecen donde el matri gel está ausente.

Este es un ejemplo del fondo del pocillo en el que no se agregó matri gel a la mezcla de medio semisólido. Para contar las colonias resultantes, coloque una cuadrícula debajo de la placa. Luego, utilizando un objetivo de 10 aumentos, observe y cuente las colonias; debido a la naturaleza tridimensional del medio, las colonias aparecerán en diferentes planos focales.

Por lo tanto, puede ser necesario un ajuste del enfoque para cada colonia durante la observación mediante microscopía óptica; aquí se muestran microfotografías representativas de colonias que expresan insulina en cultivo semisólido tras ocho a 12 días. Las colonias indicadas mediante flechas están distribuidas aleatoriamente y aparecen como pequeños cúmulos oscuros, no reflectantes de la luz, con un diámetro aproximado de 60 a 100 micrones. El análisis posterior mediante microfluídica y R-T-P-C-R de colonias seleccionadas individualmente a mano reveló la expresión de insulina dos y glucagón, consistente con nuestro informe previo. Estos resultados demuestran la capacidad de células individuales NGN tres EGFP positivas para diferenciarse en colonias que contienen simultáneamente dos hormonas de islote, semejantes a células endocrinas primitivas tipo primera ola. La expresión proteica de eptida, un marcador para la producción de insulina de novo, se confirmó mediante tinción fluorescente en montaje completo.

En resumen, cuando se realiza el ensayo de unidades formadoras de colonias que expresan insulina tal como se ilustra en este informe, el número de progenitores individuales que tienen la capacidad de formar colonias puede determinarse fácilmente, como se demuestra aquí y en nuestro informe anterior. Las unidades formadoras de colonias que expresan insulina pueden enriquecerse mediante clasificación con células NGN EGFP positivas, pero no con células ngn tres EEG FP negativas derivadas de células ES de rine in vitro. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una a tres horas. Tras la clasificación, al intentar este procedimiento, es importante recordar disociar completamente las células en una suspensión de células individuales y mantener todos los componentes del cultivo en hielo para evitar la solidificación de Matrigel, y añadir las células a los tubos al final para evitar la estimulación prematura de las células. Tras seguir este procedimiento, pueden realizarse otros métodos, como la manipulación de células individuales, para responder preguntas adicionales, como si una sola célula es suficiente para iniciar la formación de colonias tras su desarrollo.

Esta técnica allanará el camino para los investigadores en el campo de la biología de las células madre y progenitoras pancreáticas. Les permite explorar la capacidad de autorrenovación y el potencial de diferenciación hacia células similares a las beta. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el ensayo cuantitativo de colonias para progenitores formadores de colonias que expresan insulina.