Inmunotinción de neuronas en cortes de cerebro de ratón después de la hibridación fluorescente in situ

Tome cortes de cerebro de ratón fijos y permeabilizados que contengan neuronas, incluidas las neuronas colinérgicas que expresan colina acetiltransferasa.

Los cortes se someten a hibridación fluorescente in situ para detectar ARNm diana localizados en axones colinérgicos, lo que da como resultado señales amplificadas utilizando sondas fluorescentes, que se detectan con microscopía de fluorescencia.

Agregue una solución de bloqueo que contenga proteínas y un agente de enfriamiento. Las proteínas evitan la unión inespecífica y el agente de enfriamiento neutraliza los fijadores residuales.

Incubar con anticuerpos primarios que se dirigen a la colina acetiltransferasa neuronal.

Lavar con tampón para eliminar los anticuerpos no unidos.

Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos que se unen a los anticuerpos primarios unidos a la colina acetiltransferasa.

Lavar con tampón para eliminar el exceso de anticuerpos, luego enjuagar con agua destilada para eliminar los residuos del tampón.

Monte las rodajas con un medio de montaje que contenga una tinción nuclear para etiquetar los núcleos.

Usando microscopía de fluorescencia, obtenga imágenes de los cortes para visualizar las señales de ARNm objetivo y los axones colinérgicos teñidos con anticuerpos específicos.

Cubra cada rebanada con 100 a 200 microlitros de solución de bloqueo, que contiene tres miligramos por mililitro de BSA, 100 milimolar de glicina y 0.25% de Triton X-100 en PBS. Cubra cada portaobjetos con parafilm e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Después de la incubación, a 100 a 200 microlitros de anticuerpo diluido en solución bloqueadora en los portaobjetos, se usa un anticuerpo anti-colina acetiltransferasa. Después de cubrir, los portaobjetos con parafilm, se incuban durante dos días a cuatro grados centígrados. Asegúrate de que las rodajas de cerebro no se sequen. Si es necesario, vuelva a aplicar la solución de anticuerpos anti-chAT en los cortes de cerebro 24 horas después de la incubación.

Después de lavar los portaobjetos tres veces en 1X PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente, agregue de 100 a 200 microlitros del anticuerpo secundario conjugado Alexa apropiado a los portaobjetos. Cubrir con parafilm e incubar durante una hora a temperatura ambiente mientras se protege de la luz.

Una vez transcurrida la hora, lave los portaobjetos tres veces en 1X PBS durante cinco minutos cada uno como antes, y luego lávelos una vez con agua destilada. Monte las guías con un medio de montaje que contenga DAPI. Y luego visualice los cortes de cerebro bajo el microscopio de fluorescencia.