Inducir la formación de coágulos de sangre en el cerebro del ratón utilizando un tinte fotosensible

Tomemos un ratón anestesiado que tiene una ventana craneal con una capa delgada de cráneo para permitir la visualización del cerebro con una mínima invasividad.

Bajo un microscopio, identifique una arteria según el flujo sanguíneo de los vasos más grandes a los más pequeños.

Inyecte un tinte fotosensible en la vena de la cola que llega al cerebro a través de la circulación.

Excite el tinte con luz para emitir fluorescencia, lo que permite monitorear el flujo sanguíneo.

Aumente la intensidad de la luz para inducir la formación de coágulos, lo que se conoce como fototrombosis.

El tinte absorbe luz de alta intensidad, reacciona con el oxígeno y genera especies reactivas de oxígeno, que dañan las células endoteliales.

Las células dañadas liberan mediadores que hacen que las plaquetas se adhieran, iniciando la formación de coágulos. La fibrina en la sangre ayuda a atrapar células sanguíneas adicionales, creando un coágulo.

El coágulo, detectado por la acumulación de tinte que lo precede, obstruye el flujo sanguíneo al cerebro.

Cierre la incisión, aplique antibióticos para prevenir infecciones y administre analgésicos para reducir el dolor y permitir la recuperación.

Después de configurar el ratón en el microscopio, prepare rosa fresca de Bengala en LCR artificial a 20 miligramos por mililitro. Filtrar, esterilizar la mezcla y desecharla después de completar el experimento. Siempre debe usarse fresco.

Ahora, mientras escanea la ventana craneal con un láser de 561 nanómetros, inyecte 0.1 de la mezcla a través de la vena de la cola. En 5 segundos, el tinte debería verse fácilmente en la vasculatura craneal. Después de inyectar suficiente colorante, seleccione un vaso de 40 a 80 micras para la trombosis. Las arterias se pueden diferenciar de las venas, según el flujo de vasos más grandes a más pequeños, y viceversa.

Ahora, prepárese para el láser del recipiente seleccionado. Aumente el tiempo de permanencia a lo que sea apropiado para el sistema en uso. Aumente la potencia del láser al 100% y establezca la colección de imágenes en un fotograma por segundo con la máxima velocidad de escaneo. Escanee el ratón hasta que se forme un coágulo de grapa. Por lo general, esto toma unos cinco minutos. Idealmente, solo se debe escanear un campo de visión para crear el coágulo. Elija el objetivo en consecuencia. Si no se forma coágulo, intente usar más tinte.

Una vez que se haya formado el coágulo, retire el ratón del área de imágenes y prepárese para completar la cirugía bajo el microscopio de disección. Primero, retire con cuidado el anillo mientras verifica si hay sangrado. Si se produce algún sangrado, el experimento debe terminarse.

A continuación, con una sutura 6-0, cierre la incisión. Luego, aplique un antibiótico en la línea de incisión. Para aliviar el dolor, proporcione inyecciones subcutáneas de buprenex durante tres días. Después de administrar la primera inyección de buprenex, coloque el ratón en una cámara de recuperación y vigílelo hasta que sea ambulatorio. Luego, devuélvalo a su jaula de origen, que debe limpiarse. Las imágenes longitudinales se detallan en el protocolo de texto.