Name: CD4 + T-linfocitos capturar usando un chip de microfluidos desechables para el VIH (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:03:52.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Aprenda a capturar linfocitos T CD4+ usando un dispositivo microfluídico de PDMS diseñado para entornos con recursos limitados. Este método permite cuantificar células T helper con alta precisión para investigación inmunológica.

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<ol><li> Prepare canal de microfluidos con anti-CD4 + biotinlayted superficie. </li><li> Inyectar 10 ml de muestra de sangre a 5 ml / min en el canal de microfluidos con bomba de jeringa. </li><li> Expulsar la sangre a 20 ml / min durante 20 minutos con PBS. </li><li> Inyectar la solución diluida FACS lisis (diluido al 10% de la solución madre con PBS) a 5ul/min durante 15 minutos. </li><li> Incubar durante 15 min. </li><li> Inyectar primaria CD3 + solución de anticuerpos (diluido al 10% de la solución madre con PBS) a 5 ml / min durante 20 min. </li><li> Incubar durante 2 horas. </li><li> Enjuague con canal PBS a 5 ml / min durante 15 min. </li><li> Inyectar 20% AF488 anticuerpos CD4 +, 0,2% de solución madre DAPI, y el 10% CD3 + secundaria de anticuerpos en 5 ml / min durante 20 minutos a la vez. </li><li> Incubar durante 20 min. </li><li> Limpiar los canales de PBS a 5 ml / min durante 15 min. </li><li> Recuento de células bajo microscopio de fluorescencia: <ol><li> Blanco (óptico) - Negro y blanco: la célula y el polvo </li><li> UV (DAPI) - Azul: células sólo </li><li> Azul (CD4 +) - Verde: los linfocitos T y monocitos </li><li> Verde (CD3 +) - Red: los linfocitos T sólo </li></ol></li></ol>

<table><tbody><tr><td>Microcanal de PDMS</td><td></td><td></td><td></td><td>Elaborado mediante molde de SU-8</td></tr><tr><td>Sangre</td><td></td><td></td><td></td><td>Sangre donada de un sujeto humano normal. Hospital General de Massachusetts, 10 X leucocitos de alta densidad o Hospital Brigham y Mujer&amp;rsquo;s.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Tampón</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td>Solución salina tamponada con fosfatos de Dulbecco&amp;rsquo;s 1x.</td></tr><tr><td>Solución lisadora FACS</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td>Diluida al 10 % a partir de la solución madre con PBS.</td></tr><tr><td>Ac biotinilado anti-CD4+</td><td></td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>IM0704</td><td>Superficie preparada con Ac biotinilado anti-CD4+, diluido al 10 % a partir de la solución madre con PBS/BSA tras mezclar 0,2 mg de la solución madre y 1 ml de agua desionizada.</td></tr><tr><td>anti-hCD3delta de cabra</td><td>pAB</td><td>Santa Cruz Biotecnología, Inc.</td><td>sc-1128</td><td>Diluido al 10 % a partir de la solución madre con PBS</td></tr><tr><td>IgG de cabra anti-conejo PE</td><td></td><td>Santa Cruz Biotecnología, Inc.</td><td>sc-3755</td><td>Ac secundario para Ac anti-CD3, diluido al 10 % a partir de la solución madre con PBS</td></tr><tr><td>anti-CD4+ humano</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>557695</td><td>Etiquetado con Alexa Fluor 488, diluido al 20 % a partir de la solución madre con PBS.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Solución de 4&amp;rsquo;,6-diamino-2-fenilindol dihidrocloruro, diluida al 0,2 % a partir de la solución madre con PBS.</td></tr></tbody></table>

cd4 + t-linfocitos capturar usando un chip de microfluidos desechables para el vih

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-linfocitos capturar usando un chip de microfluidos desechables para el VIH

Hola, mi nombre es Richard Lin y soy investigador en el grupo de la profesora TI Mercy en la División de Ciencias e Ingeniería Médica de Harvard y MIT. El proyecto en el que estoy trabajando consiste en cuantificar y capturar linfocitos T positivos para CD4 y positivos para C3. En sangre de pacientes, esto se utilizará en entornos con recursos limitados.Justo delante de mí tenemos un dispositivo microfill compuesto de PDMS, que es polidimetilsiloxano. El dispositivo, el canal en sí, tiene una altura de 50 micrómetros y el volumen total en el dispositivo es de 10 microlitros. Así que este es un dispositivo extremadamente preciso que vamos a utilizar para capturar linfocitos T auxiliares.Básicamente, el estándar de referencia diagnóstico para pacientes con VIH. La superficie del dispositivo microfluídico ya ha sido preparada con proteína y anticuerpos positivos para CD4 en la jeringa. En este momento tenemos solo tampón biológico PBS a un pH de 7,4 y ahora lo haremos fluir a través del canal para eliminar el anticuerpo positivo para CD4 en exceso.En esta etapa, no es necesario controlar la velocidad porque solo intentamos eliminar el material sobrante, y realmente no importa cuál sea nuestra velocidad. Aquí es donde estarán las entradas del dispositivo, y aquí estarán las salidas, a mi izquierda y a su derecha. Ahora eliminaré la solución sobrante de anticuerpo; si observan la salida, verán que está saliendo fluido, una cantidad muy pequeña, pero si miran con atención pueden ver cómo el fluido sale del canal a través del tubo.Ahora que hemos eliminado la solución de anticuerpo sobrante, podemos prepararnos para inyectar la sangre. Así que ahora desconectaré el tubo de la entrada. A continuación, abriremos una nueva jeringa para la sangre, sangre humana, sangre completa.Entonces, no es una muestra de paciente, es una muestra de un sujeto sano, mientras nos preparamos para inyectar la sangre en el dispositivo microfluídico. Así que conectaremos la jeringa a la bomba de jeringa. Ahora la encenderemos y podrán ver los flujos de la jeringa; lo hemos configurado en cinco microlitros por minuto.Ahora básicamente nos prepararemos para inyectar en la sangre. Colocaremos el bombín de la jeringa verticalmente porque, como sabemos, las células sanguíneas se sedimentan y querremos que las células fluyan hacia el canal. Por lo tanto, es preferible que el sedimento celular se deposite en la parte inferior, justo cerca de nuestra tubería.Así que ahora todo está configurado y listo para comenzar. El volumen de mi dispositivo es de 10 microlitros por 10 microlitros. Y el volumen que deseamos hacer fluir hacia la pared del canal también es de 10 microlitros.Así puedo saber si he introducido suficiente sangre solo mirando el color del canal; si está completamente rojo y lleno, entonces sé que he introducido 10 microlitros y debo detener el émbolo de la jeringa. Ahora presionaré el botón de inicio y comenzará, aunque a veces tarda un rato antes de que la sangre realmente entre en el canal. Esto en gran medida se debe a la presión.Por ejemplo, cuando colocamos la jeringa, a veces, ya sabe, extraemos o inyectamos el líquido según sea necesario para ajustar la sangre en el tubo. Por lo tanto, puede llevar algo de tiempo, pero una vez que comienza a bombearse hacia un canal, el caudal se establece en ly por minuto, que es lo que deseamos. Así que debemos ser un poco pacientes aquí y esperar; a veces hay que esperar unos dos o tres minutos antes de que la sangre comience a fluir hacia el canal.En realidad, ahora mismo puede ver que la sangre está empezando a entrar en el canal. Por lo tanto, puede notar que el dispositivo ya está casi completamente lleno. Bien, ahora cambiaremos el tubo nuevamente a PBS para lavar la sangre que se encuentra en el canal.Y para hacerlo, repetiremos lo que ya hicimos para retirar el tubo. Dado que aún necesitamos controlar la velocidad del flujo del PBS, seguimos necesitando la bomba de jeringa. Sin embargo, como ya no estamos haciendo fluir sangre, no es necesario mantener la bomba de jeringa en posición vertical porque no hay células en el PBS.Ahora estamos listos y procederemos a eliminar la sangre del dispositivo; volveré a presionar el botón afilado justo aquí. Como pueden ver, el dispositivo está comenzando a limpiarse. En los bordes aún queda un poco de sangre, pero está desapareciendo lentamente.Entonces, una vez que toda la sangre haya desaparecido, aumentaremos la velocidad de cinco microlitros por minuto a 20 microlitros por minuto. La razón de este cambio es que en la sangre hay en realidad dos tipos celulares que poseen antígenos C cuatro positivos. Uno es el que estábamos buscando: los linfocitos T auxiliares.El otro es lo que llamamos los monocitos. Queremos asegurarnos de que nuestro dispositivo capture específicamente solo los linfocitos T auxiliares, y no tanto los linfocitos T auxiliares como los monocitos. Y el método que utilizamos para lograrlo consiste en aumentar la velocidad de flujo, porque sabemos que los monocitos son más grandes en tamaño que las células T auxiliares.Por lo tanto, al aumentar las tasas de flujo, los monocitos más grandes experimentarán una mayor presión para abandonar la superficie que las células T auxiliares CD4 positivas. Ahora está en aproximadamente 20 minutos. En este momento, en mi mano, tengo una solución.Se llama solución de licencia de fax. El propósito de esta solución es lisar los glóbulos rojos. De modo que en cualquier lugar donde queden glóbulos rojos en el canal, esta solución los lisará.Esto se diluye 10 veces, 10 veces a partir de la solución madre. Ahora lo que vamos a hacer es detener la bomba de jeringa, retirar el tubo y, básicamente, reemplazar la solución con la de esta jeringa. Así que ahora detengo la máquina, retiro el tubo, quito esto, lo tomo con esta jeringa y lo reemplazo con una nueva.Vale, ahora que tengo todo configurado, reduciremos la velocidad nuevamente a cinco microlitros por minuto. Así que haremos clic en la velocidad desde 20 y la reduciremos a cinco, y ahora haremos fluir la solución de licencia fax durante 20 minutos. Y ahora presionaremos inicio.Así que frente a nosotros, en este momento, hay una imagen óptica del dispositivo tomada con una ampliación de 10x. Pueden ver todos estos puntos blancos aquí. Entonces, ¿cómo podemos asegurarnos de que estas células sean las que estamos buscando?Así que utilizamos varias tinciones diferentes para asegurarnos. La primera tinción que usamos es lo que llamamos dpi, todo, tiñe en dpi y tiñe el núcleo. Básicamente, cualquier célula con núcleo, como los glóbulos blancos, se tiñe por completo, mientras que, por ejemplo, los glóbulos rojos, que no tienen núcleo, no se tiñen. Y se puede observar que está distribuido por toda la imagen. Hay muchos puntos azules y cada uno de ellos es azul.es una célula. Así que ahora el siguiente paso consiste en verificar si las células tienen lo que llamamos el antígeno C cuatro positivo. Esto es extremadamente importante porque todo el propósito de nuestro dispositivo es capturar células C cuatro positivas.Entonces, el siguiente, el anticuerpo fluorescente que utilizamos, por supuesto, es específico para C cuatro. Pase a la siguiente diapositiva. En esta imagen, las células se ven mucho más tenues porque el anticuerpo fluorescente que utilizamos normalmente es para hechos.Por lo tanto, la dilución es mucho mayor. Pero si se observa con bastante atención, aún se puede distinguir que hay puntos dispersos en este campo de visión. Son bastante tenues.Pero al examinarlos más de cerca, podemos determinar que estas células son positivas para CD, lo cual es bueno porque eso es exactamente lo que deseamos. Y la siguiente prueba consiste en, como mencioné anteriormente, distinguir entre dos tipos diferentes de células positivas para C4: unas son las células T auxiliares que queremos, y las otras son lo que llamamos monocitos.Por lo tanto, nuevamente necesitamos otro anticuerpo fluorescente para diferenciar entre las dos células. Sabemos que los linfocitos T auxiliares presentan lo que denominamos antígenos positivos para CD3, mientras que los monocitos no los tienen.Entonces, el siguiente anticuerpo que utilizamos es específico para CD tres, que veremos en esta imagen. Así que, nuevamente, puede observarse que los puntos están dispersos alrededor del dispositivo; los puntos parecen más grandes porque, a veces, algunas células brillan más intensamente, mientras que otras no lo hacen tanto. Es decir, en este caso, muchos factores dependen del azar, pero en la mayoría de los casos, estos puntos, especialmente los de color rojo brillante, son todas células.Entonces, nuevamente, lo que queremos es, en primer lugar, asegurarnos de que nuestras células sean positivas para CD4 y positivas para CD3. En este caso, se puede observar que muchas de nuestras células son positivas para CD3, lo cual es bueno, ya que nos brinda especificidad en nuestra captura.Las grandes dosis, podrían ser basura, pero muchas veces lo que sucede es que a veces una célula simplemente reúne más acumulaciones de CD3, es decir, CD3 sobre sí misma. Entonces, en esta imagen, este es uno de los conjuntos de datos que hemos recopilado para este dispositivo microfluídico y es básicamente un perfil de captura celular. En la anterior, ya saben, diapositivas, entre otros, se puede apreciar que había muchas, ya saben, imágenes con células sobre ellas.Pero ¿qué es lo que realmente acumulan? Bueno, acumulan un perfil de captura celular, en cuyo caso podemos graficar en el eje X la distancia desde la entrada y en el eje Y el disco de captura celular. Y se puede observar que a lo largo del dispositivo, la densidad inicialmente es extremadamente alta y luego disminuye lentamente, lo cual es lo que esperaríamos, ya que estamos capturando células C4 positivas y C3 positivas provenientes del torrente sanguíneo, y habrá una concentración decreciente de esas células en la muestra de sangre.Y así es básicamente como nuestros datos suelen presentarse.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Captura de células utilizando un dispositivo de microfluidos

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