CD4 + T-linfocitos capturar usando un chip de microfluidos desechables para el VIH

Hola, mi nombre es Richard Lin y soy investigador aquí en el grupo del profesor TI Mercy en la División de Ciencias de la Salud y Tecnología del MIT de Harvard. El proyecto en el que estoy trabajando es cuantificar y capturar linfocitos T CD cuatro positivos y C3 positivos. En el paciente, la sangre se debe utilizar en entornos de recursos limitados.

Así que justo delante de mí tenemos un dispositivo de microrelleno que está compuesto de PDMS, que es polimetilsloane. El dispositivo, el canal en sí, el alto es de 50 micrómetros de alto y el volumen total del dispositivo es de 10 microlitros. Así que este es un dispositivo extremadamente preciso que vamos a usar para capturar linfocitos T helper.

Básicamente, el punto de referencia para el diagnóstico de los pacientes con VIH. Por lo tanto, la superficie del dispositivo microfluídico ya se ha preparado con anticuerpos positivos para proteínas y CD cuatro en la jeringa. En este momento solo tenemos un tampón biológico PBS a un pH de 7.4 y ahora lo haremos fluir hacia el canal para eliminar el anticuerpo CD cuatro positivo adicional.

En esta etapa, la tasa no necesita ser controlada porque solo estamos tratando de eliminar las cosas adicionales y realmente no importa cuál sea nuestra tasa. Aquí, aquí es donde van a estar las entradas del dispositivo y estas van a ser las salidas a nuestras, a mi izquierda y a su derecha aquí. Así que ahora voy a enjuagar la solución de anticuerpos extra y si puedes notar que por la salida te sale el líquido, sabes que esta es una cantidad muy pequeña, pero si miras de cerca puedes ver que el líquido sale del canal a través del tubo.

Así que ahora que hemos eliminado la solución de anticuerpos extra, podemos prepararnos para fluir en la inyección de la sangre. Así que ahora voy a desenchufar el tubo de la entrada. Así que ahora vamos a abrir una nueva jeringa para la sangre, sangre humana, sangre entera.

Por lo tanto, no es una muestra de un paciente, es una muestra sana, una muestra de sujeto sano mientras nos preparamos para inyectar la sangre en el dispositivo microfluídico. Así que conectaremos la jeringa a la bomba de jeringa. Ahora lo encenderemos y podrá ver los caudales de la jeringa y lo hemos configurado para que sea de cinco microlitros por minuto.

Y ahora básicamente nos prepararemos para inyectar en la sangre. Colocaremos la bomba de la jeringa verticalmente porque, como sabemos, las células sanguíneas hacen sedimentos y querremos que las células fluyan hacia el canal. Por lo tanto, es mejor que la célula se sedimente hasta el fondo, que está justo cerca de nuestra tubería.

Así que ahora todo está configurado y listo para funcionar. El volumen de mi dispositivo es de 10 microlitros por 10 microlitros. Y el volumen que queremos que fluya hacia la pared del canal también es de 10 microlitros.

Así que puedo saber si fluyo suficiente sangre con solo mirar el color del canal, si está todo rojo y todo lleno, entonces sé que fluyo en 10 microlitros y debo detener el parachoques de la jeringa. Así que ahora presiono un botón de inicio y a veces, a veces pasa un tiempo antes de que la sangre realmente llegue a un canal. Y esto se debe en gran medida a la presión.

Por ejemplo, cuando colocamos la jeringa allí, a veces retirábamos o inyectábamos el líquido en consecuencia para ajustar la sangre en el tubo. Así que puede llevar algo, puede llevar un tiempo, pero una vez que comienza a bombear a un canal, el caudal se establece en ly por minuto, que es lo que queremos. Así que podríamos ser un poco pacientes aquí y esperar, a veces tienes que esperar como dos minutos, tres minutos antes de que la sangre comience a canalizarse.

De hecho, pueden ver en este momento que la sangre está empezando a entrar en el canal. Así que se puede decir ahora mismo que el dispositivo se llenó casi por completo. Bien, ahora volveremos a cambiar el tubo a PBS para eliminar la sangre que está en el canal.

Y para ello repetiremos lo que ya hicimos para retirar el tubo. Dado que todavía necesitamos controlar la velocidad del flujo del PBS, todavía necesitamos la bomba de jeringa. Sin embargo, debido a que ya no estamos fluyendo sangre, no necesitamos dejar la bomba de la jeringa en una posición vertical porque no hay células en el PBS.

Así que ahora estamos listos y vamos a eliminar la sangre del dispositivo y voy a presionar el botón agudo de nuevo aquí mismo. Entonces, como puede ver, el dispositivo está comenzando a borrarse. Los bordes todavía son un poco de sangre, pero está desapareciendo lentamente.

Entonces, una vez que toda la sangre se haya ido, aumentaremos la tasa de cinco microlitros por minuto a 20 microlitros por minuto. Y la razón de este cambio es porque en la sangre hay en realidad dos tipos de células que tienen cuatro antígenos C positivos. Uno es lo que buscábamos, los linfocitos T helper.

El otro es lo que llamamos los monocitos. Queremos asegurarnos de que nuestro dispositivo capture específicamente solo los linfocitos T auxiliares en lugar de los linfocitos T auxiliares y los monocitos. Y el método que hacemos es aumentar la tasa de flujo porque sabemos que los monocitos son más grandes en tamaño que las células T auxiliares.

Por lo tanto, al aumentar las tasas de flujo, los monocitos más grandes experimentarán más presión para salir de la superficie que las células T auxiliares CD cuatro positivas. Así que ahora está en aproximadamente 20 minutos. Así que en mi mano en este momento está, es una solución.

Se llama solución de licencias de fax. El propósito de esto es obtener glóbulos rojos. Por lo tanto, dondequiera que los glóbulos rojos permanezcan en el canal, esta solución lo hará.

Esto se diluye 10, 10 veces de la solución madre. Así que ahora lo que vamos a hacer es detener la bomba de la jeringa, quitar el tubo y, básicamente, reemplazar la solución con la de esta jeringa. Así que ahora estoy deteniendo la máquina, quitando el tubo, quítalo de esto, tómalo con esta jeringa, reemplázalo por uno nuevo.

Bien, ahora que tengo todo configurado, disminuiremos la tasa a cinco microlitros por minuto. Así que haremos clic en la tasa de 20, la disminuiremos a cinco y ahora fluiremos en la solución de licencia de fax durante 20 minutos. Y ahora presionaremos inicio.

Así que frente a nosotros en este momento hay una imagen óptica del dispositivo tomada con un aumento de 10x. Así que puedes distinguir todos estos puntos blancos aquí nosotros mismos. Entonces, ¿cómo podemos asegurarnos de que estas células son las que estamos buscando?

Así que usamos un par de tintes diferentes para asegurarnos de que el primer tinte que usamos es lo que llamamos dpi, todo, se mancha en manchas DPI en el núcleo. Así que, básicamente, cualquier célula con un núcleo, como los glóbulos blancos, se tiñe todo, mientras que los glóbulos rojos que no tienen núcleo no se tiñen y se puede decir que está en toda la imagen. Son todos estos puntos azules y cada uno de ellos con azul.

es una célula. Así que ahora el siguiente paso es comprobar si las células tienen lo que llamamos el antígeno C cuatro positivo. Esto es extremadamente importante porque todo el propósito de nuestro dispositivo es capturar células C cuatro positivas.

Así que el siguiente, el anticuerpo fluorescente que usamos, por supuesto, es específico de C cuatro. Y ve a la siguiente diapositiva. Así que en esta imagen, las células se apagan mucho más tenues porque el anticuerpo fluorescente que usamos suele ser para los hechos.

Por lo tanto, la dilución es mucho mayor. Pero si miras más de cerca, todavía puedes decir que todavía hay puntos que ensucian esta vista de campo. Son bastante tenues.

Pero tras un examen más detallado, podemos decir que estas células están en DC para ser positivas, lo cual es bueno porque eso es exactamente lo que queremos. Y la siguiente prueba es, como mencioné antes, que hay dos tipos diferentes de células C cuatro positivas. Una son las que queremos las células T auxiliares y la otra son las que llamamos los monocitos.

Así que de nuevo necesitamos otro anticuerpo fluorescente para diferenciar entre las dos células. Así que sabemos que en los linfocitos T helper tienen lo que llamamos antígenos CD tres positivos. Mientras que para los monocitos no.

Así que el siguiente anticuerpo que usamos es específico de CD tres, que veremos en esta imagen. Así que, de nuevo, se puede decir que sus puntos se esparcen por el dispositivo, los puntos parecen más grandes porque a veces algunas células simplemente brillan más, otras no tan bien. Quiero decir esto, muchas cosas dependen del azar en este caso, pero en la mayoría de los casos, estos puntos en puntos rojos brillantes son todas celdas.

Así que, de nuevo, hacemos lo que queremos, porque uno, asegurarnos de que nuestras células sean CD cuatro positivas y CD tres positivas. Así que en este caso se puede decir a, muchas de nuestras células están en d CD tres positivas, lo cual es bueno. Nos da especificidad en nuestra captura.

Lo grande, podría ser basura, pero muchas veces lo que sucede es que a veces una célula simplemente reúne más descargas de CD tres, CD tres sobre sí mismas. Entonces, en esta imagen, este es uno de los datos que hemos recopilado para este dispositivo de microfluido y es básicamente un profesional de captura de células. Así que en la anterior, ya sabes, diapositivas, etc., se puede decir que había muchas, ya sabes, imágenes con celdas en ellas.

Pero, ¿a qué se acumulan realmente? Pues bien, se acumulan hasta formar un perfil de captura de células, en cuyo caso podemos trazar en el eje X tenemos la distancia desde la entrada y en el eje Y tenemos el disco de células de captura. Y se puede decir que en todo el dispositivo, ya sabes, tu densidad inicialmente es extremadamente alta y luego disminuye lentamente, que es lo que esperaríamos porque estamos capturando las células C cuatro positivas y tres po, C3 positivas del torrente sanguíneo y estarán disminuyendo la concentración de esas células en la muestra de sangre.

Y así es básicamente como se suelen presentar nuestros datos.