Imágenes de microscopía confocal de árboles dendríticos intactos y morfología de la columna vertebral en un cerebro de ratón despejado

Tome un cerebro de ratón despejado con células que expresan proteínas fluorescentes y lípidos eliminados para mayor transparencia para obtener imágenes de estructura profunda con alta resolución.

Una malla de hidrogel preserva las biomoléculas y mantiene las redes neuronales.

Transfiera el cerebro a una cámara de imágenes que contenga un anillo de agarosa como soporte.

Asegure el tejido con adhesivo y llene la cámara con una solución de coincidencia de índice de refracción para minimizar la dispersión de la luz y crear un entorno de imágenes estable.

Coloque la cámara en una platina de microscopio confocal y baje suavemente el objetivo en la solución para establecer una columna continua de contacto. Utilice la

epifluorescencia para localizar regiones de interés. A continuación, ajuste los parámetros láser y de imagen para optimizar la calidad de la imagen.

Capture una serie de pilas en Z para crear una representación tridimensional del tejido.

Utilice el software apropiado para analizar la morfología celular, incluidos los árboles dendríticos, sus espinas y la distribución y densidad de las neuronas.

Para construir una cámara de imágenes de tejidos grande para tejidos con más de 5 milímetros de grosor, use un plato de vidrio de 10 centímetros con una pared alta. Coloque un tubo cónico de 50 mililitros en el centro, asegurándose de que el diámetro del tubo sea lo suficientemente grande como para aceptar el barril de la lente del objetivo utilizado. Haga agarosa al 3% en agua y viértala en el espacio entre el plato de vidrio y el tubo cónico.

Luego déjelo enfriar durante una hora. Esto formará un anillo de agarosa sólida. Adhiera firmemente el tejido al fondo de la cámara con superpegamento y llene la cámara con una solución de coincidencia de índice de refracción, que puede comenzar a polimerizarse a menos que se conserve del aire y se almacene a 4 grados centígrados. Adquirir la imagen con un microscopio confocal.

Encienda todos los equipos de imágenes relevantes. Coloque la muestra en el escenario. Acérquese con cuidado a los medios de inmersión con el objetivo y forme una columna continua de medios. Usando epifluorescencia, encuentre un campo de imágenes apropiado. Comience configurando la configuración de resolución y velocidad de escaneo.

Si se obtienen imágenes con un microscopio confocal, cierre completamente el orificio para obtener la sección óptica más pequeña y, por lo tanto, la mejor resolución Z. Aumente gradualmente la potencia del láser o la ganancia del sensor hasta obtener una imagen adecuada con una alta relación señal/ruido. Si utiliza imágenes de dos colores EGFP o tdTomato estándar, establezca la configuración de recolección de luz.

Establezca los parámetros de la pila Z en función del inicio y los puntos finales observados del tejido. Establezca el tamaño del paso en función de la resolución Z deseada. Los tamaños de paso más pequeños producirán una mayor resolución Z, pero pueden provocar el blanqueamiento de la muestra.

Cuando esté satisfecho con la configuración de adquisición de imágenes, adquiera la imagen. Asegúrese de que la imagen tenga una alta relación señal/ruido y muestre límites distintos de las estructuras.