Name: Reconocimiento de la transglutaminasa epidérmica por IgA y anticuerpos transglutaminasa tisular 2 en un raro caso de Rhesus Dermatitis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprende a visualizar la reacción autoinmune en piel de macacos Rhesus con dermatitis herpetiforme mediante tinción inmunofluorescente. Este método permite detectar autoanticuerpos IgA contra la transglutaminasa epidérmica.

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Los autores desean agradecer a Amanda Tardo, el Dr. Mostafa Bouljihad, Feely Stephanie, Coyne Carol, la Dra. Erin Ribka, el Dr. Pete Didier y Kuebler Dorothy por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH R01-DK076653 y 3R01-DK076653-02S1 para KS y la subvención de funcionamiento de la base de TNPRC RR000164.

1. La biopsia de piel la recogida de muestras <ol><li> Antes de la biopsia de piel, anestesiar a los animales por vía intramuscular con 2,5 mg / kg de clorhidrato de tiletamina y zolazepam mezcla de clorhidrato de Telazol (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA). Monitor de los animales de la administración de anestesia hasta postración y retire de su gabinete. </li><li> Eliminar el vello de la piel del área de interés utilizando un Oster A5 de Oro Clipper velocidad Veterinaria individual con un tamaño de 40 cuchillas (Oster Professional Products, McMinnville, TN) y preparar asépticamente con alternancia de matorral Betadine y alcohol. Asegurar un paño fenestrado estéril sobre el sitio de la biopsia seleccionado. </li><li> Usando una técnica estéril, coloque un 4,0 mm Miltex instrumento perforación cutánea Biopsia (Miltex, York, PA) contra la piel mientras se gira el instrumento 180 grados en sentido horario y antihorario con una ligera presión hasta que la biopsia por punción de transectos a través de la dermis en el ti subcutáneaCUESTIÓN. Retire la muestra de la biopsia y agarre la parte seccionada de la piel con pinzas y sin el tejido subcutáneo. </li><li> Cierre el defecto de la piel con sutura de nylon 3-0 unido a una aguja 3 / 8 círculo de corte (Ethilon, Ethicon, Johnson &amp; Johnson Medical Limited, Berkshire, Reino Unido) en un patrón cruzado. Dar a todos los animales de 0,01 mg / kg de hidrocloruro de buprenorfina (Hospira, Lake Forest, IL) por vía intramuscular para la analgesia postoperatoria. </li></ol> 2. Procesamiento de la muestra <ol><li> Trabajar con muestras de biopsia de la piel dermatitis crónica y controles sanos macacos rhesus. La obtención de dos a tres (4 mm de diámetro) las muestras de biopsia de cada animal. </li><li> Fix primera muestra en formol zinc (Z-fix, Anatech Ltd., Battle Creek, MI) durante 24 horas, lave en agua durante 30 minutos, lave brevemente en etanol al 70%, y el lugar en ASP300 procesador de tejidos Leica (Leica Microsystems Inc. , Buffalo Grove, IL), donde los tejidos se deshidratan con los grados de ascenso de 70%, 80%, 95% y 100% de etanol 48minutos cada uno (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), seguido por dos cambios de xileno (Fisher). </li><li> Insertar en los medios de parafina (Fisher) para almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente. Lugar a -20 º C durante 20 minutos antes de cortar. Prepare 6 secciones micras con un micrótomo rotatorio (HM325, Microm Internacional, Waldorf, Alemania). Se colocan en las diapositivas cargada (Fisher) y aire seco a 60 º C durante la noche. Tinción con hematoxilina y eosina (H &amp; E) método estándar (descrito más adelante). </li><li> Fix segunda muestra en paraformaldehído al 2% (USB Corp, Cleveland, OH) durante 30 min a temperatura ambiente, lavar tres veces en tampón fosfato salino (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), lugar en el 30% de sacarosa (Fisher) para 4 horas, e incluir en el medio de congelación octubre (Sakura Finetek, Torrence, California). Mantener a los 80 ° C durante 20 minutos antes de cortar. Prepare 15 secciones micras utilizando el criostato (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI). </li></ol> 3. H &amp; E tinción <ol><li> Desparafinar incrustarsecciones ded a través de tres cambios de xileno (Fisher) y rehidratar a través de etanoles clasificados: tres cambios de 100%, dos cambios de 95%, un cambio del 80% y agua destilada, a 2 minutos cada uno. </li><li> Tinción con hematoxilina (Richard Allan-Científico, Kalamazoo, MI) durante un minuto y seguir por un breve lavado en agua corriente del grifo. </li><li> Contratinción con eosina (Sigma) durante 6 minutos. </li><li> Deshidratar los tejidos teñidos a través del 95% y etanol absoluto, dos cambios de 2 minutos cada uno y claro en tres cambios de xileno, a 3 minutos cada uno. </li><li> Monte cubre objetos usando Medio Cytoseal de montaje (Richard Allan-científico) en el H &amp; E-manchado secciones de tejido. </li></ol> 4. Evaluación histopatológica Inspeccione H &amp; E-manchado secciones biopsia de la piel bajo un microscopio óptico con el 4 - 40 aumentos y un microscopio Leica con un punto penetración de cámaras digitales (Digital Instruments Inc., Michigan, EE.UU.). 5. Inmunofluorescencia staiNing <ol><li> Trabajar con secciones de piel octubre embebido para la tinción de inmunofluorescencia. Antes de la tinción, en remojo durante 20 min en PBS que contenía 0,2% de gelatina de piel de pescado (FSG, Sigma) con 0,1% Triton X-100 (Sigma) para eliminar los PTU y para permeabilizar el tejido. </li><li> Después de lavar las diapositivas, se incuban con 10% de suero normal de cabra (NGS, Sigma), diluido en PBS-FSG durante 1 hora a temperatura ambiente, en una cámara de diapositivas humidificado. </li><li> Para poder visualizar el depósito de IgA y anticuerpos tTG2, Incubar los portaobjetos con anti-rhesus IgA y anticuerpos primarios tTG2, diluido en un 10% NGS-PBS-FSG durante 1 hora. </li><li> Lavar con PBS-FSG-Triton X-100 (Sigma) durante 10 minutos, seguido por PBS-FSG durante 10 minutos. </li><li> Se incuba con el secundario, isotipo de los anticuerpos específicos marcados con fluorocromo Alexa Fluor 488 (verde), 568 (rojo) o 633 (azul) (Molecular Sondas-Invitrogen) a 1:1000 dilución. El uso del tinte ToPro-3 para visualizar el ADN nuclear. Utilizar el 10% de NGS-PBS-FSG como diluyente para anticuerpos. </li><li> Use la solución anti-temple (Sigma) para montar las secciones de tejidos teñidos. </li></ol> 6. Microscopía confocal Realizar imágenes con una Leica TCS SP2 verdadero microscopio de escaneo láser confocal (Leica, Wetzlar, Alemania) equipado con tres láseres (seis líneas de excitación está disponible): un láser de argón, kriptón a 488 nm (verde), un láser de criptón a 568 nm ( rojo) y un láser de helio-neón de 633 nm (azul), que abarcan desde el visible hasta el otro lado rojo del espectro. Registro de contraste de interferencia diferencial (DIC) imágenes para la evaluación de los no etiquetados arquitectura del tejido. 7. Resultados representante Un ejemplo de un reconocimiento positivo de la ETG por tanto tTG2 e IgA se muestra en la fig. 3A. De acuerdo con la situación en pacientes humanos, y debido a la prevalencia mucho más baja de DH-como dermatitis de CD-como la sensibilidad al gluten también en los macacos rhesus, la mayoría de las muestras de biopsia de piel se espera que show la reacción positiva con anticuerpos tTG2 pero sin la presencia de tTG2 + IgA + doble células positivas (Fig. 4). Estos casos DH-relacionados, incluyendo casos de dermatitis de origen microbiano, se revelan algunas células de un solo positivo IgA + esparcidos por debajo del epitelio, pero no solapamiento espectral entre las tTG2 e IgA marcados con marcadores (Fig. 3B y 4). Por lo tanto, es importante para mantener el orden de los procedimientos de prueba sugerido, a partir de la exploración clínica (Fig. 1), seguida de evaluación histopatológica (Fig. 2) y sólo si no que causan dermatitis y otras más comunes agentes pueden ser identificados confocal, examen microscópico de biopsias de piel manchada para tTG2 e IgA se justifica. Las evaluaciones clínicas y / o histopatológicos no son suficientes para el diagnóstico positivo de esta condición. En los casos en doble positivo (+ tTG2 IgA +) las células se identifican en el área de las papilas dérmicas, DH-como el diagnóstico dermatitis pueden ser emitidas. En tales casos, la retirada del gluten de la dietay la administración de la dieta sin gluten se recomienda con el fin de aliviar los síntomas de la dermatitis. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Región inguinal de EM96 macaco antes (A) y después (B) la retirada del gluten de la dieta durante 5 semanas. La reintroducción del gluten de la dieta coincidió con la reaparición de la dermatitis (C). <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. HE tinción de las biopsias de piel EM96 macacos recogidos antes (A) y después (B) la retirada del gluten de la dieta durante 9 semanas. R: El epitelio se espese (7-15 capas de células epiteliales), con una gruesa capa superficial de células hiperqueratósicas infiltrado de neutrófilos en degeneración. Los neutrófilos aparecen también en el interior del epitelio y se mezclan con un número moderado de linfocitos, células plasmáticas e histiocitos alrededor de los anexos en la dermis superior. B: Algunos hyperkeratosis todavía está presente, el espesor del epitelio está normalizado (4-7 capas) con mínima infiltración linfoplasmocitario en la dermis superior. C: La piel normal abdominal de FR56 macacos, sin infiltración linfoplasmocitaria, se incluye para la comparación. Magnificación de 20x. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Imágenes de microscopía confocal de EM96 biopsias de piel macacos recogidos antes (A) y después (B) la retirada del gluten de la dieta durante 9 semanas. A: tinción IgA (verde), tTG2 (rojo) y ToPro-3 de marcadores de ADN nuclear (azul). Co-localización de IgA y tTG2 aparece en amarillo en la zona de papilae dérmica. B: muestra de piel tomada después de 9 semanas de dieta sin gluten no muestra IgA en el epitelio, mientras que algunos subepitelial de IgA está presente (verde), tTG2 (rojo) y ToPro-3 de marcadores de ADN nuclear (azul). <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. <table border="1"><tbody><tr><td> Animal Etiqueta </td><td> Sexo [M / F] </td><td> Edad [Años] </td><td> Los síntomas clínicos </td><td> Plasma tTG2 anticuerpos </td><td> Dieta [1,2] * </td></tr><tr><td> HJ71 </td><td> F </td><td> 1.3 </td><td> Saludable </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HD13 </td><td> M </td><td> 1.4 </td><td> Diarrea sanos, ocasionales </td><td> + </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FR56 </td><td> M </td><td> 5.4 </td><td> Diarrea crónica idiopática </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> EM96 </td><td> F </td><td> 5.0 </td><td> Dermatitis crónica </td><td> + / - (Borderline) </td><td> 1 y 2 </td></tr><tr><td> GI24 </td><td> F </td><td> 4.6 </td><td> Dermatitis crónica </td><td> - </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. TNPRC macacos rhesus utilizados para la recogida de biopsias de piel * Dieta 1 - regular comida mono (con gluten), la dieta 2 - dieta libre de gluten

<ol><li>Diosdado, B., Wijmenga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+the+adaptive%2C+innate+and+regulatory+immune+responses+in+the+intestinal+mucosa+of+celiac+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients.</a> Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).</li>
<li>Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+nutritional+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr.+Clin.+Care%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management.</a> Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).</li>
<li>Sardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+transglutaminase+%28TGase+3%29+is+the+autoantigen+of+dermatitis+herpetiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis.</a> J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).</li>
<li>Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+against+epidermal+transglutaminase+are+a+sensitive+diagnostic+marker+in+patients+with+dermatitis+herpetiformis+on+a+normal+or+gluten-free+diet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Acad.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).</li>
<li>Bethune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+and+enzymatic+detoxification+of+gluten+in+gluten-sensitive+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques.</a> PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).</li>
<li>Mazumdar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+transepithelial+passage+of+the+immunogenic+33-residue+peptide+from+%CE%B1-2+gliadin+in+gluten-sensitive+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques.</a> PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).</li>
<li>Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+from+pathogenesis+to+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies.</a> Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).</li>
<li>Hunt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+identified+genetic+risk+variants+for+celiac+disease+related+to+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response.</a> Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).</li>
<li>Abadie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+genetic+and+immunological+insights+into+a+model+of+celiac+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Nuestra reciente creación no humana modelo de primates de la sensibilidad al gluten se ha utilizado recientemente para estudiar los cambios de permeabilidad intestinal provocada por gluten de la dieta 5,6. Plasma tTG2 anticuerpos, así como intestinal tTG2 + + depósitos de IgA se detectaron en algunos macacos sensibilidad al gluten. Ya que recientemente identificado incidentes raros de dermatitis idiopática en la colonia de macacos rhesus, que no se pudo habitual (infecciosas / metabólicas) etiología estableci...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo o equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo / Código de producto </td><td> Nota </td></tr><tr><td> Anti-IgA humana-FITC * </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> F-5259 </td><td> 1:100 dilución de trabajo </td></tr><tr><td> Anti-Human tTG2 </td><td> Thermo Scientific, Kalamazoo, MI </td><td> MS-300-P1ABX </td><td> 1:100 dilución de trabajo </td></tr><tr><td> Anti-ratón IgG1 ** </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> A-21124 </td><td> 1:1000 dilución de trabajo </td></tr><tr><td> ToPro-3 *** sonda de ADN </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> T-3605 </td><td> 1:1000 dilución de trabajo </td></tr><tr><td> Zinc formalina (Z-fix) </td><td> Anatech Ltd., Battle Creek, MI </td><td> 171 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Octubre de congelación Medio </td><td> Sakura Finetek, Torrence, CA </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal montaje Medio </td><td> Richard Allan-Científico, Kalamazoo, MI </td><td> 8312-4 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-enfriamiento Solución </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> P 3130 </td><td></td></tr><tr><td> Ethilon (Sutura de nylon) </td><td> Ethicon, Johnson &amp; Johnson, Berkshire, Reino Unido </td><td> 663G </td><td></td></tr><tr><td> Miltex sacador cutáneo instrumento de biopsia </td><td> Miltex, York, PA </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> Oster A5 de oro Single Speed ​​Clipper veterinario con un tamaño de 40 cuchillas </td><td> Productos Oster, McMinnville, TN </td><td> 78005-050 </td><td></td></tr><tr><td> Leica procesador de tejidos </td><td> Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL </td><td> ASP300 </td><td></td></tr><tr><td> Micrótomo rotatorio </td><td> Microm Internacional, Waldorf, Alemania </td><td> HM325 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Thermo Scientific, Kalamazoo, MI </td><td> HM560 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio Confocal </td><td> Leica, Wetzlar, Alemania </td><td> TCS SP2 </td><td></td></tr></tbody></table> * Isotiocianato de fluoresceína ** Secundaria (Alexa Fluor 568-conjugado) anticuerpo utilizado después de tTG2 anticuerpo primario ** Tinte

reconocimiento de la transglutaminasa epidérmica por iga y anticuerpos transglutaminasa tisular 2 en un raro caso de rhesus dermatitis

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Transglutaminasa tisular 2 (tTG2) es una enzima digestiva intestinal que deamidates ya parcialmente digerido la dieta gluten péptidos de la gliadina por ejemplo. En individuos genéticamente predispuestos, tTG2 desencadena la respuesta autoinmune que se caracteriza por la producción de anticuerpos y tTG2 su deposición directa en 1,2 pequeña pared intestinal. La presencia de anticuerpos de ese tipo constituye una de las características principales de la enfermedad celiaca (EC). Transglutaminasa epidérmica (ETG) es otro miembro de la familia de la transglutaminasa, que también puede funcionar como un autoantígeno en una pequeña minoría de los pacientes con EC. En estos casos relativamente raros, ETG desencadena una reacción auto inmune (una erupción de la piel) clínicamente se conoce como dermatitis herpetiforme (DH). Aunque el mecanismo exacto de la patogenia de CD y DH no se entiende bien, se sabe que tTG2 y ETG epítopos antigénicos compartir que pueden ser reconocidos por los anticuerpos de suero de los pacientes de CD y DH 3,4. (Macaca mulatta) con dermatitis (tabla 1, fig. 1 y 2) se utilizó para estudiar los tejidos afectados. En un animal (EM96) una superposición espectral de IgA y anticuerpos tTG2 (Fig. 3) se demostró. La presencia de doble positivas tTG2 + IgA + células se centró en la epidermis de profundidad, alrededor de las papilas dérmicas. Esto es consistente con las lesiones descritas en pacientes con DH 3. Cuando EM96 fue colocado en una dieta libre de gluten, dermatitis, así como tTG2 + IgA + depósitos desaparecido y ya no eran detectables (Fig. 1-3). Dermatitis reapareció sin embargo, sobre la base de re-introducción del gluten de la dieta en el EM96 (no mostrado). En los macacos otros como animales no relacionados con la dermatitis, la tTG2 + IgA + depósitos no fueron detectados. Dieta libre de gluten-dependiente de la remisión de la dermatitis en el EM96 junto con la presencia de tTG2 + IgA + células en la piel indican una enfermedad autoinmune, como DH-mecanismo para el desarrollo de esta condición. Este es el primer informe de DH-como la dermatitis en los primates no humanos.

La dermatitis herpetiforme (DH) es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por una reacción autoinmune entre IgA y la epidermis transglutaminasa (ETG). DH se desarrolla en una porción muy pequeña de los pacientes con sensibilidad al gluten y / o enfermedad celíaca. Los resultados de este estudio indican que DH también puede desarrollarse en una gran mono rhesus con síntomas de la dermatitis idiopática.

Reconocimiento de la transglutaminasa epidérmica por IgA y anticuerpos transglutaminasa tisular 2 en un raro caso de Rhesus Dermatitis

La transglutaminasa tisular 2 (tTG2) es una enzima digestiva intestinal que desamida el gluten dietético ya parcialmente digerido, por ejemplo, los péptidos de la gliadina. En ...

Este artículo en video demuestra un método para visualizar la reacción autoinmune en la piel de Reeses Maccas sensibles al gluten con dermatitis herpetiforme. Esto se logra primero identificando animales con dermatitis que no puede asociarse con otras causas de dermatitis más comúnmente diagnosticadas, aparte de estos casos idiopáticos más controles sanos apareados por edad. Se obtienen muestras de piel de la zona afectada para evaluar la arquitectura tisular, la inflamación, así como la presencia de transglutaminasa epidérmica.Las muestras de autoanticuerpos recolectadas se fijan en formol con zinc y hematoxilina al 2% en eosina o HNE. Luego se realiza la tinción para evaluar el grado de inflamación y la histopatología, y se lleva a cabo la tinción inmunofluorescente para evaluar el depósito de autoanticuerpos contra la transglutaminasa epidérmica en la epidermis profunda. La dermatitis herpetiforme es una afección inflamatoria crónica caracterizada por una reacción autoinmune entre la IgA y la transglutaminasa epidérmica. La DH se desarrolla en una porción muy pequeña de pacientes celíacos sensibles al gluten. Los resultados de este estudio indican que la DH también puede desarrollarse en una pequeña fracción de monos Resus sensibles al gluten.Nuestros resultados corroboran la validez del modelo Resus Meac recientemente desarrollado de sensibilidad al gluten, tal como se presenta. Los resultados muestran que las manifestaciones clínicas de esta afección no se limitan únicamente al intestino delgado. Un protocolo típico incluye un animal con dermatitis idiopática y un control sano emparejado por edad.Tras la anestesia adecuada y la preparación del sitio utilizando técnica estéril, coloque un instrumento de biopsia dérmica con punzón Miltex de 4,0 milímetros contra la piel del animal aplicando una ligera presión. Gire el instrumento 180 grados en sentido horario y antihorario hasta que el punzón de biopsia atraviese las capas dérmicas y llegue al tejido subcutáneo. Repita para una segunda biopsia utilizando fórceps.Sujete la porción de piel seccionada y libérela del tejido subcutáneo. Coloque la primera muestra, que será procesada para tinción con hematoxilina y eosina, en formol con zinc. Luego, coloque la segunda muestra, que será evaluada mediante microscopía de inmunofluorescencia, en paraformaldehído al 2 %, utilizando una aguja de corte de tres octavos de círculo con sutura de nylon tres raya cero.Cierre el defecto cutáneo en patrón cruzado. Repita este proceso para obtener de dos a tres muestras de biopsia de cada animal. Administre analgesia posoperatoria según se describe detalladamente en el protocolo escrito para examinar la presencia y localización de IGA y TTG dos.Comience incubando las muestras que fueron colocadas en formaldehído al 2% durante cuatro horas a temperatura ambiente para fijarlas tras la fijación. Retire el paraformaldehído y lave con PBS durante 30 a 60 minutos en una plataforma agitadora. Repita dos veces, para un total de tres lavados, luego retire el PBS y reemplace con sacarosa al 30% durante al menos cuatro horas y hasta dos semanas.A continuación, coloque la muestra en medio de congelación OCT e introdúzcala en un baño de butano metílico y hielo seco hasta que el OCT transparente se vuelva blanco opaco, lo que indica que se ha congelado completamente. Luego, coloque los bloques a menos 80 grados Celsius durante al menos 20 minutos. Esto asegura que el tejido quede completamente congelado para que la hoja lo corte sin aplastarlo.El tejido puede almacenarse a largo plazo en OCT a menos 80 grados Celsius. Después de cortar y montar las secciones sobre portaobjetos, elimine el OCT y permeabilice el tejido. Sumerja los portaobjetos en un frasco de Copeland que contenga PBS con 0,2 % de gelatina de piel de pescado y 0,1 % de Triton X-100.Luego, coloque el frasco sobre un agitador durante 20 minutos; después de 20 minutos, lave las láminas durante 10 minutos en PBS con 0,2 % de gelatina de piel de pescado, e incube con suero de cabra normal al 10 % diluido en PBS con 0,2 % de gelatina de piel de pescado durante 40 minutos a temperatura ambiente en una cámara para láminas humedecida. Incube las láminas con los anticuerpos primarios anti resus IGA y TTG dos por separado durante una hora. A continuación, sosteniendo la lámina por sus bordes, rocíe suavemente con P-B-S-F-S-G Triton X-100 utilizando una pipeta de transferencia.Luego colóquelo en un frasco Copeland que contenga el mismo tampón. A continuación, coloque el frasco sobre un agitador durante 10 minutos. Repita la lavada una vez.Luego, realice un lavado con P-B-S-F-S-G durante 10 minutos. Incube con anticuerpos secundarios marcados con Alexa floor específicos para el isotipo durante 40 minutos tras la incubación. Lave el portaobjetos como antes.Luego, agregue el colorante de ADN nuclear al medio de montaje antifluorescente en una dilución de uno a 2000. Aplique una gota del medio directamente sobre cada portaobjetos. A continuación, coloque una lámina de cubreobjetos sobre el tejido y selle con esmalte de uñas.Coloque la preparación en un lugar oscuro y déjela secar. Para visualizar la tinción de IGA y TTG, realice imágenes mediante un microscopio confocal de barrido láser equipado con los láseres adecuados para los anticuerpos secundarios utilizados en la evaluación del registro de tejido no marcado. Imágenes de contraste por interferencia diferencial, DIC.DIC es un canal dentro del microscopio que resuelve el tejido en una escala de grises. Esto permite determinar mejor la arquitectura celular para realizar la tinción HNE. La muestra que se colocó en formol con zinc primero se bloquea en parafina y se secciona sobre portaobjetos.Las láminas se hornean luego a 60 grados Celsius durante la noche y se colocan en un tinción automática, que tiñe las láminas con HNE cuando la tinción ha finalizado. Inspeccione las secciones teñidas de las biopsias bajo un microscopio óptico equipado con una cámara digital utilizando aumentos de Forex y 40 x. Registre de tres a cuatro imágenes para cada aumento. Se obtuvieron muestras de biopsia de lesiones cutáneas de Reuss Maca y se tiñeron según se describe en este video para estudiar el efecto de la retirada de gluten en la dieta sobre la dermatitis aquí.Se muestra la región inguinal de un macaco antes de retirar el gluten de la dieta. Cuando este animal fue colocado en una dieta libre de gluten, la dermatitis desapareció y ya no fue detectable, como se puede observar aquí. La dermatitis reapareció tras la reintroducción del gluten en la dieta para evaluar la arquitectura del tejido.Se realizó la tinción con H y e antes de la retiración del gluten. El epitelio estaba engrosado, con siete a 15 capas de células epiteliales y una gruesa costra superficial de células hiperqueratósicas infiltradas con neutrófilos en degeneración. Los neutrófilos también aparecieron dentro del epitelio y se mezclaron con cantidades moderadas de linfocitos, células plasmáticas e histiocitos alrededor de las adnexas en la dermis superior tras nueve semanas de retiración del gluten de la dieta.Aún se observaba algo de hiperqueratosis y epitelio engrosado; sin embargo, solo con infiltración linfoplasmocítica mínima en la dermis superior para comparación. Se muestra aquí piel abdominal normal sin engrosamiento epitelial y sin infiltración linfoplasmocítica en la dermis superior. Imágenes de microscopía confocal de las mismas biopsias de piel de macaco, recolectadas antes de la retirada de gluten en la dieta, en las que la colocalización de IgA mostrada en verde y tTG2 mostrada en rojo aparece en amarillo alrededor del área de las papilas dérmicas, lo que indica la presencia de autoanticuerpos contra la transglutaminasa epidérmica.El marcador nuclear de ADN del to pro tres se muestra en azul tras nueve semanas de dieta libre de gluten. La IgA ya no se observó dentro del epitelio, lo que indica la ausencia de autoanticuerpos contra la transglutaminasa epidérmica, que se mostraría en amarillo. Algunas IgA subepiteliales, A mostradas en verde, aún estaban presentes; el marcador nuclear de ADN del to pro tres se muestra en azul en otras Maccas, incluyendo un animal con dermatitis idiopática no relacionada.No se detectaron autoanticuerpos. La tinción de IgA aparece en verde, la ttg dos en rojo y el marcador nuclear de ADN para pro tres está en azul. Las células positivas para ttg dos están presentes dentro del epitelio.Algunas células positivas para IgA bajo el epitelio. Aunque no se observa una superposición espectral extensa entre los marcadores rojo y verde, lo que indica la ausencia de autoanticuerpos contra la transglutaminasa epidérmica. En este estudio, utilizamos microscopía confocal para visualizar la presencia de autoanticuerpos IgA contra la transglutaminasa epidérmica.Al intentar el procedimiento, es importante recordar que la mayoría de los casos de dermatitis no están causados por sensibilidad al gluten. Por lo tanto, deben realizarse otros métodos, incluyendo la detección de anticuerpos en suero, anti-gliadina, anti-transglutaminasa tisular, y una evaluación clínica cuidadosa. A pesar de la prevalencia de la dermatitis, la prevalencia de la dermatitis herpetiforme es menor que la de la enteropatía sensible al gluten.Los resultados proporcionan una base para investigaciones futuras, suponiendo que se identifiquen animales adicionales con esta condición.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En el modelo animal descrito en el presente trabajo, se purificaron los anticuerpos IgG contra un tramo de 200 aminoácidos (aa 757-967) de colágeno VII se inyecta repetidamente a ratones que reproducen el fenotipo de formación de ampollas, así como características de la histo-e inmunopatológicos característicos a humanos epidermólisis bullosa adquirida...

Granulocitos dependiente de autoanticuerpos inducidos por ampollas en la piel

Aquí se describen dos ensayos para medir la activación del complemento inducida por anticuerpos contra las células rojas de la sangre. La principal ventaja sobre los ensayos actuales es su naturaleza cuantitativa y fácil de interpretar.

Los métodos para la detección cuantitativa de anticuerpos inducida por la activación del complemento en los glóbulos rojos

El protocolo para detectar células autorreactivas T CD4 en el cerebro y el corazón mediante tinción directa con complejo mayor de histocompatibilidad de clase II dextramers se ha descrito en el presente informe. Para el análisis integral, un método fiable para enumerar las frecuencias de células T CD4 + específicas de antígeno in situ también se ideó.

La detección in situ de las células T CD4 Autoreactive en Cerebro y Corazón Uso Mayor de Histocompatibilidad clase II Dextramers

Aquí, presentamos los métodos para la detección de autoanticuerpos del islote humano usando análisis electrochemiluminescence (ECL). El protocolo, utilizado para predecir la diabetes tipo 1, se puede ampliar a detectar autoanticuerpos para otras enfermedades autoinmunes.

Electrochemiluminescence ensayos para autoanticuerpos islote humano

En este artículo se describe un protocolo para caracterizar las respuestas de isotipo de inmunoglobulina (Ig) T dependientes y T independientes en ratones usando ELISA. Este método se usa solo o en combinación con el flujo cytometry permitirá a los investigadores identificar las diferencias en las respuestas de isotipo de Ig mediada por células B en ratones después de la inmunización de antígenos T dependientes y T independientes.

Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

Este papel presenta un protocolo para la detección específica de suero, inmunoglobulina E, con un sistema de quimioluminiscencia basado en cartucho de microfluidos y la evaluación de su utilidad en diagnósticos de alergia.

Aplicación de la tecnología de microfluidos Biochip para detectar suero alergénico-específicos de la inmunoglobulina E (sIgE)

Aquí se presenta un protocolo para la separación de la epidermis de la dermis para evaluar la producción de mediadores inflamatorios. Después de la inflamación, la epidermis de la pata trasera de la rata se separa de la dermis por termolisis a 4 ° C.  La epidermis se utiliza para el análisis de ARNm por RT-PCR y la evaluación de proteínas por western blot e inmunohistoquímica.

Separación de la epidermis y la dermis de rata con termoisina para detectar ARNm y proteínas inflamatorias específicas del sitio

Este protocolo utiliza péptidos mixtos G6PI para construir modelos de artritis reumatoide que están más cerca de la artritis reumatoide humana en células CD4+ T y citoquinas. Células T asesinas naturales invariables de alta pureza (principalmente iNKT2) con fenotipos y funciones específicas se obtuvieron mediante inducción in vivo y purificación in vitro para inmunoterapia adoptiva.

Inmunoterapia adoptiva de células iNKT en ratones RA inducidos por glucosa-6-fosfato (G6PI)

Modelamos un ensayo ECL multiplexado simple que combina 7 ensayos de autoanticuerpos. El ensayo es capaz de detectar DT1 y muchas otras enfermedades autoinmunes, simultáneamente, incluida la enfermedad celíaca, la enfermedad tiroidea autoinmune y el síndrome poliglandular autoinmune 1.

Un ensayo de electroquimioluminiscencia 7-plex de alto rendimiento que detecta simultáneamente la diabetes tipo 1 y múltiples enfermedades autoinmunes

Este protocolo describe un método sencillo para cultivar epidermis humana reconstituida tridimensional de una manera reproducible y robusta. Además, caracteriza la relación estructura-función del modelo de barrera epidérmica. Las respuestas biológicas de la epidermis humana reconstituida sobre estímulos proinflammatory también se presentan.

El cultivo de una epidermis humana reconstruida tridimensional a gran escala

Las lesiones cutáneas son características comunes e importantes en muchas enfermedades reumáticas, y la biopsia con análisis patológico desempeña un papel fundamental en el diagnóstico. Este artículo proporciona una descripción detallada del procedimiento estandarizado de biopsia de piel y, utilizando como ejemplo el lupus eritematoso discoide, destaca el papel esencial de la dermatopatología en el diagnóstico de enfermedades reumáticas.

Biopsia de piel para el diagnóstico del lupus eritematoso discoide

Aprende a visualizar la reacción autoinmune en piel de macacos Rhesus con dermatitis herpetiforme mediante tinción inmunofluorescente. Este método permite detectar autoanticuerpos IgA contra la transglutaminasa epidérmica.

Reconocimiento de la transglutaminasa epidérmica por IgA y anticuerpos transglutaminasa tisular 2 en un raro caso de Rhesus Dermatitis (Video) | JoVE Journal

Reconocimiento de la transglutaminasa epidérmica por IgA y anticuerpos transglutaminasa tisular 2 en un raro caso de Rhesus Dermatitis

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