Uso de reflectometría espectral para determinar los diámetros de los axones mielinizados en un corte fijo de cerebro de ratón
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 4:16 min • May 29th, 2025
Tome un microscopio confocal hiperespectral con una fuente láser estabilizada configurada para un amplio rango espectral para decodificar la nanoestructura de la vaina de mielina del tejido cerebral.
Utilice un espejo de referencia para capturar el espectro de reflectancia de referencia. Retire el espejo y adquiera un espectro de desplazamiento oscuro para la corrección del ruido del detector.
Transfiera una cámara con una sección fija de tejido cerebral a la platina del microscopio.
Alinee el plano focal con la región del tejido de interés, asegurando suficiente profundidad para minimizar la interferencia de la interfaz vidrio-tejido.
La luz láser se dirige a la vaina de mielina multicapa de los axones.
A medida que la luz interactúa con la mielina, se producen reflexiones parciales en las interfaces de las capas, produciendo patrones de interferencia debido a los diferentes espesores de capa e índices de refracción.
Adquiera imágenes espectrales de estos patrones de interferencia.
Después de la corrección de la línea de base y el análisis de la señal, el espectro de reflectancia revela la periodicidad del número de onda, lo que permite la determinación de los diámetros de los axones mielinizados.
Monte un espejo de referencia en la platina del microscopio, con la superficie orientada hacia la lente del objetivo. Si no es fácil colocar el espejo en la platina del microscopio, adhiera un espejo a la placa plana. Ajuste la platina del microscopio para alinear el plano focal con la superficie del espejo. Luego, ajuste la ganancia de PMT y la potencia del láser, considerando el rango dinámico del detector.
Bajo un pseudocolor, verifique que no haya saturación en todo el rango de longitud de onda. Si se observa saturación, reduzca la potencia del láser. A continuación, ejecute la adquisición del análisis lambda. Retire el espejo del escenario y repita la misma adquisición sin una muestra para obtener la referencia oscura. A continuación, guarde los datos en un formato TIFF de varias pilas.
Para llevar a cabo la adquisición de imágenes SpeRe, coloque el tejido montado en la platina del microscopio. Para alinear aproximadamente el tejido con el plano focal de la lente del objetivo, a través de un ocular, use el modo de fluorescencia de campo amplio. Con el escaneo en vivo activado, controle la platina del microscopio para alinear el plano focal con la región de interés en el tejido. Para evitar el ruido de fondo del cubreobjetos, seleccione una región objetivo de al menos 15 micrómetros de profundidad desde la interfaz de tejido de vidrio.
Adquiera la pila de imágenes espectrales para la región de destino utilizando el mismo procedimiento que se demostró anteriormente en este video. A continuación, guarde los datos del tejido y el desplazamiento oscuro en formato TIFF de varias pilas. Para procesar las imágenes en ImageJ, abra los datos espectrales del espejo de referencia y el tejido cerebral.
Seleccione los ROI para las pilas de imágenes abiertas, el área central para el espejo de referencia y el segmento de una fibra axónica para el tejido cerebral. Luego, ejecute imágenes, pilas, traza el perfil del eje z para adquirir los espectros sin procesar para los ROI seleccionados.
Las fibras del axón pueden ser estructuralmente heterogéneas a lo largo de sus longitudes, por lo que se recomienda seleccionar el ROI en un segmento de axón pequeño, generalmente de menos de 5 micrómetros, para minimizar los artefactos de volumen parcial.
Abra los datos de desplazamiento oscuro, uno tomado para el espejo de referencia y el otro tomado para el tejido cerebral, y trace el perfil del eje z como se acaba de demostrar. A continuación, utilice las opciones de copiar y pegar para guardar todas las opciones adquiridas.
Descripción general
Este artículo demuestra el uso de la microscopía reflectométrica espectral (SpeRe) con un microscopio confocal hiperspectral para analizar la nanoestructura de axones mielinizados en cortes fijados de tejido cerebral. Al capturar y analizar los patrones de interferencia generados por la vaina de mielina multicapa, los investigadores pueden determinar los diámetros de los axones con alta precisión.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Microscopía
- Imagen óptica
Antecedentes
- Los axones mielinizados son fundamentales para la transmisión rápida de señales en el sistema nervioso.
- Los métodos tradicionales para medir el diámetro del axón pueden ser invasivos o carecer de resolución a escala nanométrica.
- Los patrones de interferencia óptica provenientes de las vainas de mielina multicapa proporcionan una manera no destructiva de evaluar la estructura axonal.
- La microscopía confocal hiperspectral permite un análisis espectral detallado de tejidos biológicos.
Objetivo del estudio
- Demostrar un protocolo para utilizar la reflectometría espectral en el análisis de axones mielinizados in situ.
- Proporcionar un método para determinar con precisión los diámetros de los axones en cortes de tejido cerebral fijado.
- Mostrar la aplicación de la microscopía confocal hiperspectral en la investigación neurobiológica.
Métodos Utilizados
- Preparación de cortes de tejido cerebral fijado para imágenes.
- Uso de un microscopio confocal hiperspectral con una fuente láser estabilizada que cubre un amplio rango espectral.
- Adquisición de espectros de reflectancia de referencia utilizando un espejo de referencia y espectros de compensación oscura para la corrección de ruido.
- Alineación del plano focal con la región de interés del tejido, asegurando una profundidad suficiente desde la interfaz vidrio-tejido.
- Recolección de pilas de imágenes espectrales de las fibras nerviosas mielinizadas y regiones de referencia.
- Procesamiento de imágenes y análisis espectral mediante ImageJ para extraer espectros de reflectancia y determinar los diámetros de los axones.
Resultados principales
- Se capturaron con éxito patrones de interferencia generados por la vaina de mielina mediante reflectometría espectral.
- Las correcciones de línea base y de desplazamiento oscuro permitieron mediciones espectrales precisas.
- El análisis del espectro de reflectancia reveló una periodicidad en número de onda correspondiente al diámetro del axón.
- La selección de pequeñas regiones de interés minimizó artefactos debidos a la heterogeneidad axonal.
Conclusiones
- La microscopía reflectométrica espectral proporciona un método no destructivo y de alta resolución para analizar in situ la estructura de axones mielinizados.
- El protocolo permite mediciones precisas del diámetro de axones en tejido cerebral fijado.
- Este enfoque puede facilitar estudios avanzados de la microestructura neural y de patologías relacionadas con la mielina.
Preguntas frecuentes
Relevancia Empresarial e Industrial
La medición cuantitativa de los diámetros de axones mielinizados mediante reflectometría espectral permite un análisis estructural de alta resolución, fundamental para el descubrimiento de fármacos enfocado en neurobiología. Este enfoque respalda la confianza predictiva en la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas para los activos de cartera del SNC. La integración de métricas axonales precisas en las etapas tempranas del descubrimiento mejora la continuidad traslacional y la toma de decisiones ajustada al riesgo.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación cuantitativa de la microestructura neural relacionada con modelos de enfermedades.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al proporcionar mediciones directas de la arquitectura de la vaina de mielina.
- Facilita la validación confiable de objetivos terapéuticos en vías relacionadas con la mielina y en condiciones neurodegenerativas.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Prepara sistemas de tejido cerebral validados para la cribado de compuestos posteriores.
- Proporciona resultados cuantitativos reproducibles para la evaluación del diámetro de los axones.
- Facilita la estandarización de ensayos y la reutilización de plataformas en los flujos de trabajo de neurobiología.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Correlaciona lecturas estructurales con biomarcadores relevantes para enfermedades en estudios traslacionales.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica en programas del sistema nervioso central.
- Proporciona valor predictivo para la integridad de la mielina en modelos preclínicos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
La medición de axones basada en reflectometría espectral se integra en el continuo desde el descubrimiento inicial hasta la fase preclínica, apoyando tanto la comprobación de hipótesis como la alineación de biomarcadores traslacionales.
- Biología del Descubrimiento: Proporciona datos estructurales cuantitativos para la validación de objetivos basada en hipótesis.
- Tamizaje: Ofrece mediciones reproducibles y estandarizadas para el desarrollo de ensayos.
- Análisis: Genera lecturas espectrales que permiten la comparación directa de características axonales entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con estrategias de biomarcadores preclínicos en la investigación del SNC.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de imagen y análisis reutilizable para carteras de neurobiología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas del SNC.
- Valor operativo: Estandariza la medición de axones de alta resolución para flujos de trabajo escalables.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance/no avance y la eficiencia del capital en programas de neurobiología.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de activos del SNC basada en puntos finales estructurales cuantitativos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía confocal hiperspectral y análisis espectral.
- Necesita acceso a fuentes láser estabilizadas e infraestructura avanzada de imagen.
- Exige estandarización entre equipos en la adquisición de imágenes y la selección de regiones de interés (ROI).
- La adaptación a diferentes tipos de tejidos puede requerir optimización del protocolo para la corrección de profundidad y fondo.
- Los artefactos por volumen parcial y la heterogeneidad del tejido deben gestionarse mediante una selección cuidadosa de las regiones de interés (ROI).
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Última actualización: 29 agosto 2026