Uso de reflectometría espectral para determinar los diámetros de los axones mielinizados en un corte fijo de cerebro de ratón

Tome un microscopio confocal hiperespectral con una fuente láser estabilizada configurada para un amplio rango espectral para decodificar la nanoestructura de la vaina de mielina del tejido cerebral.

Utilice un espejo de referencia para capturar el espectro de reflectancia de referencia. Retire el espejo y adquiera un espectro de desplazamiento oscuro para la corrección del ruido del detector.

Transfiera una cámara con una sección fija de tejido cerebral a la platina del microscopio.

Alinee el plano focal con la región del tejido de interés, asegurando suficiente profundidad para minimizar la interferencia de la interfaz vidrio-tejido.

La luz láser se dirige a la vaina de mielina multicapa de los axones.

A medida que la luz interactúa con la mielina, se producen reflexiones parciales en las interfaces de las capas, produciendo patrones de interferencia debido a los diferentes espesores de capa e índices de refracción.

Adquiera imágenes espectrales de estos patrones de interferencia.

Después de la corrección de la línea de base y el análisis de la señal, el espectro de reflectancia revela la periodicidad del número de onda, lo que permite la determinación de los diámetros de los axones mielinizados.

Monte un espejo de referencia en la platina del microscopio, con la superficie orientada hacia la lente del objetivo. Si no es fácil colocar el espejo en la platina del microscopio, adhiera un espejo a la placa plana. Ajuste la platina del microscopio para alinear el plano focal con la superficie del espejo. Luego, ajuste la ganancia de PMT y la potencia del láser, considerando el rango dinámico del detector.

Bajo un pseudocolor, verifique que no haya saturación en todo el rango de longitud de onda. Si se observa saturación, reduzca la potencia del láser. A continuación, ejecute la adquisición del análisis lambda. Retire el espejo del escenario y repita la misma adquisición sin una muestra para obtener la referencia oscura. A continuación, guarde los datos en un formato TIFF de varias pilas.

Para llevar a cabo la adquisición de imágenes SpeRe, coloque el tejido montado en la platina del microscopio. Para alinear aproximadamente el tejido con el plano focal de la lente del objetivo, a través de un ocular, use el modo de fluorescencia de campo amplio. Con el escaneo en vivo activado, controle la platina del microscopio para alinear el plano focal con la región de interés en el tejido. Para evitar el ruido de fondo del cubreobjetos, seleccione una región objetivo de al menos 15 micrómetros de profundidad desde la interfaz de tejido de vidrio.

Adquiera la pila de imágenes espectrales para la región de destino utilizando el mismo procedimiento que se demostró anteriormente en este video. A continuación, guarde los datos del tejido y el desplazamiento oscuro en formato TIFF de varias pilas. Para procesar las imágenes en ImageJ, abra los datos espectrales del espejo de referencia y el tejido cerebral.

Seleccione los ROI para las pilas de imágenes abiertas, el área central para el espejo de referencia y el segmento de una fibra axónica para el tejido cerebral. Luego, ejecute imágenes, pilas, traza el perfil del eje z para adquirir los espectros sin procesar para los ROI seleccionados.

Las fibras del axón pueden ser estructuralmente heterogéneas a lo largo de sus longitudes, por lo que se recomienda seleccionar el ROI en un segmento de axón pequeño, generalmente de menos de 5 micrómetros, para minimizar los artefactos de volumen parcial.

Abra los datos de desplazamiento oscuro, uno tomado para el espejo de referencia y el otro tomado para el tejido cerebral, y trace el perfil del eje z como se acaba de demostrar. A continuación, utilice las opciones de copiar y pegar para guardar todas las opciones adquiridas.