Microscopía de dos fotones para monitorizar la dinámica del calcio en los fotorreceptores de los conos de la retina de los ratones

Coloque un cubreobjetos que contenga tejido retiniano de ratón montado en una membrana bajo un microscopio de dos fotones.

El tejido expresa un biosensor de calcio basado en FRET en fotorreceptores de cono.

Usando un objetivo de inmersión en agua, concéntrese en el tejido.

Bajo iluminación de fondo, los terminales del axón del cono permanecen despolarizados, lo que permite la entrada de calcio.

La unión intracelular al calcio altera la conformación del biosensor, acercando los fluoróforos donante y aceptor.

Comience la obtención de imágenes de dos fotones.

El láser del microscopio enfoca la luz infrarroja cercana de baja energía en el tejido.

En el punto focal del láser, dos fotones excitan simultáneamente el biosensor, desencadenando la transferencia de energía del donante al aceptor.

Esto aumenta la fluorescencia del aceptor mientras disminuye la fluorescencia del donante.

Calcule la relación de fluorescencia.

A continuación, administre estimulación lumínica para hiperpolarizar los conos, reduciendo los niveles de calcio intracelular.

Esto revierte la conformación del biosensor, inhibiendo la transferencia de energía del donante al aceptor y reduciendo la relación de fluorescencia.

Registre las respuestas para analizar la dinámica del calcio evocado por la luz en los terminales de los axones de los conos.

Transfiera una rebanada de la cámara de retención a la cámara de registro e inmediatamente comience a perfundirla con una solución extracelular carbooxigenada. Mantenga un caudal de perfusión de 2 mililitros por minuto y una temperatura de 37 grados centígrados en la cámara de registro. Utilice un objetivo de inmersión en agua de 20x y 0,95 NA y una cámara CCD en combinación con un LED infrarrojo debajo de la cámara de grabación para localizar el corte de retina.

Inicie el sistema de imágenes de dos fotones, según lo indicado por el fabricante. A continuación, encienda el láser y configúrelo en 860 nanómetros. Encienda los dos canales de detección para imágenes de fluorescencia de ECFP y citrino. A continuación, utilizando el software de adquisición de imágenes, controle el microscopio de dos fotones para escanear y seleccionar una fila de terminales de cono para grabar. Establezca la adquisición de imágenes en imágenes de 128 por 16 píxeles o una configuración similar.

Restrinja el área escaneada a los terminales del cono para evitar el blanqueamiento de fotopigmentos en los segmentos externos. Encienda el láser. Deje que los conos se adapten al láser de barrido y a la luz de fondo del estímulo durante 20 a 30 segundos antes de presentar estímulos lumínicos o aplicar agentes farmacológicos. Ahora, comience la presentación de los estímulos arbitrarios. Los estímulos se generan modulando la intensidad de los dos LED a lo largo del tiempo, utilizando una placa de microprocesador controlada por un software personalizado. A continuación, comience a grabar los dos canales de fluorescencia simultáneamente utilizando el software de adquisición de imágenes correspondiente.