Microscopía de dos fotones para monitorizar la dinámica del calcio en los fotorreceptores de los conos de la retina de los ratones
Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Neurociencia
0 visualizaciones • 3:18 min. • June 17th, 2025
Coloque un cubreobjetos que contenga tejido retiniano de ratón montado en una membrana bajo un microscopio de dos fotones.
El tejido expresa un biosensor de calcio basado en FRET en fotorreceptores de cono.
Usando un objetivo de inmersión en agua, concéntrese en el tejido.
Bajo iluminación de fondo, los terminales del axón del cono permanecen despolarizados, lo que permite la entrada de calcio.
La unión intracelular al calcio altera la conformación del biosensor, acercando los fluoróforos donante y aceptor.
Comience la obtención de imágenes de dos fotones.
El láser del microscopio enfoca la luz infrarroja cercana de baja energía en el tejido.
En el punto focal del láser, dos fotones excitan simultáneamente el biosensor, desencadenando la transferencia de energía del donante al aceptor.
Esto aumenta la fluorescencia del aceptor mientras disminuye la fluorescencia del donante.
Calcule la relación de fluorescencia.
A continuación, administre estimulación lumínica para hiperpolarizar los conos, reduciendo los niveles de calcio intracelular.
Esto revierte la conformación del biosensor, inhibiendo la transferencia de energía del donante al aceptor y reduciendo la relación de fluorescencia.
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