Name: Procedimientos para la Rata In situ Propiedades contráctiles del músculo esquelético (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprende a medir propiedades contráctiles del músculo esquelético en rata in situ mediante estimulación nerviosa y transductor de fuerza. Este método permite evaluar fatiga, velocidad de fuerza y frecuencia en condiciones fisiológicas con flujo sanguíneo normal.

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Investigación respaldada por el Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá.

1. Introducción <ol><li> El laboratorio de Macintosh ha estado usando la preparación músculo gemelo medial durante varios años, y antes de eso, toda la preparación de los músculos gemelos, como el desarrollado con el Dr. Phil Gardiner 1. </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> Adulto ratas Sprague-Dawley (200-300 g) se utilizan normalmente en nuestro laboratorio para el estudio de las propiedades contráctiles en el lugar. La rata se puede restringir en un dispositivo de plexiglás, disponibles en el mercado, o cubriendo con una toalla, y la celebración. </li><li> Usamos la ketamina / xilazina, (100 mg · ml -1, cada uno) mezclados en 85:15, y administrar 0,1 ml por cada 100 g de peso del animal por vía intramuscular 2,3. Pentobarbital sódico (50 a 60 mg · kg -1, intraperiteneal) o isoflurano (2-3,5%, inhalada) también se puede utilizar 4. </li><li> Mientras que la anestesia hace efecto, un peso exacto se puede obtener y se afeitó la izquierda los miembros traseros. Esto también es un buen momento para estar seguro de todos los aparatos electrónicos están encendidos y listos. Esto incluye ordenadores, un amplificador de calibrador de tensión, el calentador de aceite, entre otros. </li><li> Compruebe si hay retorno de respuesta refleja periódicamente y complementar la anestesia cuando sea necesario (0,05 a 0,1 ml por cada 100 g). </li></ol> 3. Inicio de la cirugía <ol><li> Utilizamos una plataforma de plexiglás en la que para inmovilizar la rata para la cirugía. Cinta adhesiva simple hace el trabajo. Asegúrese de que el animal se extendía desde extremidad posterior izquierda de extremidad anterior derecha. Agregar una gota de lubricante para los ojos. Usamos aceite de parafina. De lo contrario, los ojos se secan con anestesia ketamina. </li><li> Una lámpara de quirófano pequeña es útil. Éste emite calor suficiente como para ayudar a mantener al animal caliente. Por otra parte, una manta de calentamiento de agua se puede utilizar. Compruebe que reflejos de la córnea o del pie emergente están ausentes antes de proceder. Técnicas de esterilización no es necesaria, ya que este procedimiento es aguda. El animal no se recupere de la anestesia. Nosotros la eutanasia a la rata con anestesia sobredosis (0,2 ml, intracardíaca) cuando se ha terminado. </li><li> La primera incisión es a través de la piel desde el talón hasta la columna vertebral. Nosotros usamos las tijeras, ya que la profundidad del corte puede ser controlada y las tijeras se utilizan para separar la piel de los tejidos subyacentes. Las ratas tienen una hemostasia excelente, así que el tiempo que evitar los grandes vasos sanguíneos, hemorragia será limitado. Mantenga las superficies expuestas cubiertas con solución salina isotónica una gasa empapada, siempre que sea posible. </li><li> Después se separa la piel del tejido conectivo subyacente, la capa muscular superficial se corta. Asegúrese de no ir demasiado profundo, que no quieren dañar el nervio ciático o los vasos sanguíneos o el músculo de su interés. Comience por los músculos gemelos y el corte proximal, en la misma línea que la incisión de la piel. Por debajo de Peek para localizar y evitar el nervio ciático. Una vez que vea el nervio, puede seguir su camino con la incisión, pero se quedan muy por encima del nervio. Hay una unión clara entre los músculos. Localizar este, y corte en esa unión hacia la rodilla. Vigilar y evitar los vasos sanguíneos. </li></ol> 4. Prepare agujero piloto en el fémur para el pasador de hueso <ol><li> Corte a través de la delgada capa de músculo en la cara caudal del fémur, dejando al descubierto el hueso al descubierto. Usando una mano herramienta rotatoria, perforación, o viceversa, pines, (0,9 mm de acero al carbono fresa), haga un agujero piloto a pequeña escala a través de la corteza, y sólo en la médula. No perforar demasiado profundamente, o sangrado excesivo resultado. Este agujero se usará más adelante para colocar un pin para inmovilizar los huesos del fémur sobre la base de miografía. </li></ol> 5. Aislar a la inervación de los músculos gemelo interno <ol><li> El siguiente paso requiere un microscopio de disección. Busque el lugar donde el nervio poplíteo desaparece detrás del músculo gemelo interno. Suavemente hacia fuera las diversas ramas, y cortar todo lo que no inervan el músculo gemelo interno. Inervación puede ser determinada por microestimulación. En esta etapa, también asegúrese de que las ramas superficiales del nervio ciático se cortan. </li><li> Ahora está claro que el tejido conectivo fuera del nervio ciático, por lo que puede ser deslizado en el manguito de los nervios (más tarde). Asegúrese de tratar el nervio con suavidad. Cualquier tramo del nervio puede llevar a inexcitabilidad, y al final de su experimento antes de tiempo. </li></ol> 6. Aislar el tendón de Aquiles y los músculos gemelos <ol><li> Disección roma, con la ayuda ocasional de unas tijeras, se puede utilizar para separar los músculos gemelos de otros tejidos. El tendón del plantar puede ser sacado de debajo del tendón de Aquiles, atadas y cortadas. El empate se utiliza simplemente para ayudar a sostener el tendón y se puede cortar inmediatamente después de que el tendón se corta y el plantar se separa de los músculos gemelos de una longitud considerable. Colocar una ligadura de seda # 1 alrededor del tendón de Aquiles, y corbata en un nudo cuadrado. No tire demasiado fuerte, o el tendón dañado. Nosotros utilizamos pinzas para cortar hueso calcáneo, dejandoción un pequeño pedazo de hueso todavía adherido al tendón de Aquiles. Mantenga las superficies de corte horizontal para asegurarse de que el hueso se corta, no sólo en el tendón. Esto asegura que el tendón de Aquiles puede ser colocada en el miografía más tarde. </li><li> A lo largo de la parte inferior del gastrocnemio, el sóleo se puede ver. Una vez más, una disección roma se puede utilizar para separar el músculo sóleo de los músculos gemelos. Queremos aislar el gemelo interno, por lo que es el único músculo que todavía unido al tendón de Aquiles. Cortar el tendón del sóleo, cerca del extremo distal. Entonces usted puede separar los músculos gastrocnemio medial y lateral, y cortar el tendón lateral, dejando sólo el músculo gemelo interno unido al tendón de Aquiles. Tire del músculo gastrocnemio lateral lejos de la media, a lo largo de aproximadamente el 50% de su longitud. Más allá de esta longitud, las fibras se cruzan y el daño será el resultado de más tirón. Compruebe que el músculo es el tejido conectivo. </li></ol> 7. Cortar la tibia <ol><li> Colocar una ligadura alrededor del vástago, justo por encima del punto medio. Esto tiene que ser ajustada, sin cortar en el tejido. Un segundo bucle antes de atar ayuda a evitar los resbalones. Una vez más utilizar un nudo cuadrado de seguro. </li><li> Con una sierra pequeña, cortar la pierna de distancia. Este corte debe ser a medio camino a lo largo de la tibia. </li><li> Insertar una sonda aguda en la médula de la tibia. Esta sonda se utiliza para inmovilizar la tibia sobre la base de miografía. </li><li> Adjuntar dos elásticos de la piel, utilizando clips de Michel. Elásticos Estos y otros serán utilizados para mantener la piel alrededor de los músculos para formar un recipiente que se llena con aceite de parafina caliente. </li></ol> [OPCIONAL] 8. Inserte cristales sonometric (paso opcional) 5 <ol><li> Colocar el animal sobre una almohadilla térmica en el nivel bajo. Una sonda rectal, si no se ha insertado se puede insertar en este momento. Use una pequeña gota de aceite de parafina para lubricar. </li><li> Utilizando microestimulación, identificar los extremos de un fascículo en el músculo. Poke una aguja de calibre 21 en el sitio de el origen y la inserción del músculo. </li><li> Deslice un cristal sonometric en el agujero hecho por la aguja, y sellar con pegamento veterinario de bonos quirúrgica. Use una pequeña gota de pegamento, asegurándose de que está situado justo sobre el cristal. Dar la cola a un pedazo de papel cortado con un ángulo agudo ayuda en la aplicación de la cola con precisión. Estamos colocando un cristal adicional en la inserción de los fascículos que fue identificado por microestimulación. </li></ol> [CONTINUAR] 9. Montaje en el aparato (ver Figura 1) <ol><li> Posición de la rata en la base de miografía, con la sonda tibial orientado hacia la palanca. Coloque la sonda en el soporte, para inmovilizar la pierna. </li><li> Tire de la piel a los lados, para formar un recipiente y seguro con elásticos. </li><li> Conjunto broca (1 / 16 de pulgada º) en el fémur, a través del orificio piloto que se creó durante la preparación quirúrgica. Asegúrese de que el apoyo del fémur en la parte anterior como se coloca la broca (en un tornillo pasador) la rotura del fémur puede dar lugar, terminando el experimento antes de tiempo. Fije el pasador de vice a una barra transversal para inmovilizar el fémur. </li><li> Coloque el muñón distal del nervio ciático a través del manguito de los nervios estimulantes (cátodo hacia los músculos) y meter de nuevo cerca del origen del músculo. Conectar el estimulador de estos cables. </li><li> Conecte el tendón de Aquiles de la palanca, que tiene sensores de presión del medidor en la misma. Empate cómodamente, pero deja un cierto margen de ajuste posterior. Asegúrese de que la alineación de los músculos es perpendicular a la palanca. </li><li> Llene el recipiente formado por la piel con aceite de parafina caliente. </li><li> Encender la lámpara de calor y escudos hechos de papel de aluminio puesto sobre la cabeza del animal, y el transductor de fuerza. Escudos de aluminio adicionales pueden ser necesarias para asegurar la temperatura del núcleo del animal no exceda de 38 ° C. La longitud del músculo puede ser ajustada hasta holgura de la cadena se retira de la conexión entre el gemelo interno y el transductor de fuerza. </li></ol> 10. Ajuste de tensión máxima y la longitud de referencia <ol><li> Mientras que el músculo se está calentando, configurar el estimulador y poner a prueba la tensión de la estimulación. Es importante asegurarse de que la estimulación se fija en la duración del pulso muy breve. Usamos 50 ms. Tensión máxima debe ser inferior a 1 V. A partir de 0,5 V, aumentar la tensión hasta que la amplitud de contracción no se incrementa. Tensión máxima es la más baja de voltaje que activa todas las unidades de motor. Por lo general estimulan el doble de la tensión máxima o 3 V que sea mayor. </li><li> Por lo general, los experimentos se iniciará con el músculo en la longitud que da a la contracción de la mayor contracción. Una contracción se obtiene con un pulso único estimulante. La longitud del músculo se incrementa alrededor de 1 mm por otra de contracción. Esto se repite siempre y cuando la amplitud de movimiento es increacantar. Una vez que disminuye la amplitud de contracción, la longitud será devuelto a la que dio la mayor amplitud de contracción. </li><li> Después de esta configuración inicial de longitud, prueba el sistema con lo que nos referimos como "contracción tetánica acondicionado". El estimulador se ajusta para proporcionar pulsos de 200 Hz para 500 ms. La entrega de este estímulo se traducirá en una contracción tetánica fusionado completamente. La fuerza generada por el músculo se apriete todas las conexiones, incluyendo los nudos en los músculos. Después de un descanso adecuado para la disipación de la potenciación 4, la longitud de referencia del músculo se pone a cero (véase la parte 9.2). Por lo general, la contracción tetánica acondicionado se han permitido algunas acortamiento fascículo, por lo que el músculo tiene que ser estirado un poco para volver a la longitud que le da mayor amplitud de la contracción nerviosa. </li></ol> 11. Iniciar el experimento <ol><li> Un experimento típico se incluyen ajuste de la longitud y / o la estimulación con una variedad de patrones de estimulación. La recolección de datos puede implicar simplemente la fuerza o la fuerza, con la longitud, la longitud fascículo y el electromiograma. </li></ol> [OPCIONAL] 12. Fuerza-frecuencia 2 <ol><li> Establecer la duración del tren el tiempo suficiente para llegar a una meseta de la fuerza en cualquier frecuencia de interés. La fuerza isométrica máxima se alcanza en el músculo gemelo interno de 200 Hz. Duración de los trenes deben ser de al menos 200 ms, ya es mejor para las frecuencias más bajas, pero se traducirá en algo de fatiga, si varias contracciones se utilizan para determinar la gama completa de la relación fuerza-frecuencia. Por lo general utilizan las contracciones a las 0, 20, 40, 60, 80, 100 y 200 Hz.. Este rango de frecuencias permitirá a toda la gama de la relación fuerza-frecuencia que se describe. Un descanso adecuado entre las contracciones se debe permitir para evitar la fatiga (1-10 min). </li></ol> 13. Fuerza-talla 6 <ol><li> Con el tiempo estimado óptimo establecido anteriormente, la relación fuerza-longitud se puede determinar de forma sistemática el ajuste de la longitud del músculo de -4 a 4 mm mm usando un aparato de servo-motor. Esto se debe hacer uso de la estimulación máxima (200 Hz), pero hemos encontrado que las contracciones muy breve dará la misma longitud real óptimo 7. Contracciones submáximas, como tics, se puede utilizar, pero esto dará lugar a una diferente longitud de la dependencia de la fuerza 8. </li><li> Un aspecto importante de la determinación de la relación fuerza-longitud es la necesidad de estimar la fuerza pasiva en la longitud fascículo en el que la fuerza medida se produce. Fuerza activa se calcula como la diferencia entre el total de la fuerza y ​​la fuerza pasiva apropiado. Dado que las estructuras elásticas paralelas tienen la fuerza pasiva y estos están en serie con las estructuras de serie elástica, la contribución de la fuerza pasiva de la fuerza total debe disminuir a medida que las estructuras de la serie elástica se estiran durante una contracción del 3. Una vez que la fuerza pasiva es conocido por todas las longitudes de los músculos correspondientes, la fuerza pasiva adecuada se puede estimar con la medición continua de la longitud de fascículos con sonomicrometría, o por la estimación del cumplimiento del sistema de medición y las estructuras en la serie de la unidad músculo-tendinosa. Si esto no se hace, la duración óptima de la preparación y las fuerzas de pico, están subestimados. </li></ol> 14. Relación fuerza-velocidad 9 <ol><li> Si desea determinar la relación fuerza-velocidad, tendrá que adjuntar los transductores de fuerza a un sistema, que permite el control de cualquiera de la carga o la tasa de cambio de longitud. El método más fácil y más rentable es el uso de la presión del aire para limitar el acortamiento de una carga controlada. En nuestro sistema, el músculo está unido a la palanca de un lado del punto de apoyo y la presión del aire impide el cambio de longitud en el otro lado. Un sensor de longitud debe ser empleado de manera que usted es capaz de detectar el cambio en la longitud muscular durante las contracciones isotónicas. Esta disposición permite contracciones afterloaded con resistencia neumática. Tanques de doble puede permitir la contracción isométrica con la liberación de una carga isotónica. Un total de 15 a 20 contracciones se deben obtener, con cargas que van desde cerca de descarga de la fuerza isométrica máxima. Al colocar los datos en una ecuación, las cargas por encima del 90% de los isométricos no debe ser utilizado 9. </li></ol> 15. Los resultados representativos: Contracciones de la muestra se presentan en la Figura 2. Estas contracciones se obtuvieron para ilustrar la relación fuerza-frecuencia. Cálculo de la fuerza máxima activa de estas contracciones, y el trazado de la fuerza activa de la frecuencia, el rendimiento de la figura 3, la relación fuerza-frecuencia. Los datos presentados en la Figura 2 puede estar en forma para la siguiente ecuación: AF = c / (1 + e ((AF) / b) + d), AF es la fuerza activa, F es la frecuencia y, b, c, yd son constantes. Para el músculo gemelo interno de ratas, la frecuencia media máxima de estimulación suele ser de 50-60 Hz no fatigados músculos 2. Los resultados se ajustan estrechamente a la línea descrita por la ecuación anterior. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Aparato muscular y set-up:. Neumática de configuración se muestra a la izquierda, isométrica a la derecha. El sistema de palanca muestra a la izquierda se une a la tabla de traducción cuando las contracciones dinámicas son deseados (adaptado de 13). El motor paso a paso está controlado por un ordenador (adaptado de 14). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> . Figura 2 superpuestas contracciones isométricas: 20, 40, 60, 80, 100 y 200 Hz.. La amplitud de la contracción de 200 Hz es 8,13 N. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> . Figura 3 fuerza-frecuencia: la fuerza activa de las contracciones en la figura 2 se representan y la línea representa la recta de mejor ajuste.

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Se pueden obtener resultados contráctiles de buena calidad con cuidado en la preparación quirúrgica, sujeción segura en el aparato y electrónica de buena calidad. Cuando un estudiante está aprendiendo esta cirugía, algunos errores comunes incluyen: estirar el nervio ciático, interrumpir el flujo sanguíneo y hemorragia excesiva. El nervio debe manipularse con cuidado para evitar daños. Sabrá que ha dañado el nervio si la fuerza tetánica máxima a longitud óptima es considerablemente menor que la mostrada en la Figura 3, o si el voltaje de estimulación necesario para activar completamente todas las unidades motoras es mayor de 5 voltios. Es relativamente fácil evitar los vasos sanguíneos que irrigan este músculo durante la cirugía. La interrupción de estos vasos puede ocurrir cuando la broca se coloca en la superficie caudal del fémur. Si el orificio piloto no está en la superficie plana del fémur, la broca puede deslizarse. Cuando esto sucede, existe la posibilidad de que los vasos poplíteos resulten dañados. Si se acumula sangre alrededor del músculo después del montaje, es señal de que ha interrumpido estos vasos. También puede ocurrir hemorragia excesiva si se corta una vena grande y no se liga. Las venas grandes que deben vigilarse son las que se encuentran alrededor del tobillo.
La preparación muscular in situ es un enfoque valioso para el estudio de las propiedades contráctiles del músculo. Se pueden activar unidades motoras individuales10, pero por lo general todas las unidades motoras se activan de forma sincrónica. Esto representa una desventaja en comparación con la activación normal asincrónica que ocurre mediante el reclutamiento voluntario de unidades motoras, por lo que constituye una limitación. Sin embargo, como aspecto positivo, la activación sincrónica permite la cuantificación de una respuesta promedio de todas las unidades motoras.
Existen dos enfoques que se han utilizado para evitar la activación sincrónica. Uno consiste en usar una funda de electrodo con varios pares de cables estimulantes. Esto permite la activación de una porción de las unidades motoras con cada par, y la estimulación puede rotar entre los pares para lograr una activación asincrónica. Este método de activación puede combinarse con un bloqueo anódico11 para intentar activar las unidades motoras en la secuencia adecuada según el principio de tamaño12. En este enfoque, todas las unidades motoras se activan con un par proximal de electrodos, y se impone un bloqueo mediante estimulación con corriente continua. La amplitud del estímulo para el bloqueo puede modularse para inhibir las unidades motoras cuya activación no se desea. Aparentemente, el bloqueo afecta primero a los axones grandes con el voltaje más bajo, y progresivamente afecta a las unidades más pequeñas.
La preparación del músculo gastrocnemio de rata in situ es un enfoque fisiológico valioso para el estudio de la contracción muscular esquelética y de las propiedades bioquímicas en estado de salud y en enfermedad.

<table><tbody><tr><td>Cortadoras</td><td></td><td></td><td>Cortadoras de buena calidad para mascotas</td></tr><tr><td>Lámpara quirúrgica</td><td>Dyna-Lume</td><td></td><td>Cualquiera de varias opciones sirve</td></tr><tr><td>Miógrafo</td><td></td><td></td><td>Construido a medida</td></tr><tr><td>Estimulador</td><td>Grass Technologies</td><td>S-88</td><td>Cualquiera de varias opciones sirve</td></tr><tr><td>Amplificador de galga extensométrica</td><td>CWE, Inc.</td><td>PM-1000</td><td></td></tr><tr><td>Teletermómetro</td><td>YSI</td><td>YSI-400</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma robótica</td><td>Arrick Robotics</td><td>MD-2</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador sonométrico</td><td>Sonometrics</td><td>Sonolab</td><td></td></tr><tr><td>Computadora y recolección de datos</td><td>PC con tarjeta NI</td><td></td><td>Software personalizado (labview)</td></tr><tr><td>Calentador de bloques</td><td>Labline Instruments</td><td>Multi-bloque</td><td></td></tr><tr><td>Empaquetadura nerviosa</td><td></td><td></td><td>Hecha a medida</td></tr><tr><td>Microestimulador</td><td></td><td></td><td>Hecho a medida</td></tr></tbody></table>

procedimientos para la rata in situ propiedades contráctiles del músculo esquelético

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Hay muchas circunstancias en las que es conveniente para obtener la respuesta contráctil del músculo esquelético en condiciones fisiológicas: la circulación normal, todo el músculo intacto, a temperatura corporal. Esto incluye el estudio de las respuestas contráctiles como la potenciación postetánica, la escalera y la fatiga. Por otra parte, las consecuencias de tratamiento de la enfermedad, falta de uso, las lesiones, la formación y las drogas pueden ser de su interés. Este vídeo demuestra los procedimientos apropiados para instalar y utilizar esta valiosa preparación muscular. Para configurar esta preparación, el animal debe ser anestesiado, y el músculo gemelo interno está aislado quirúrgicamente, con el origen intactos. Se debe tener cuidado para mantener el suministro de sangre y los nervios. Una larga sección del nervio ciático, se elimina el tejido conectivo, y cortó proximal. Todas las ramas del tronco distal que no inervan el músculo gemelo interno se rompen. El tronco del nervio distal se inserta en un puño llena de alambres de acero inoxidable estimulante. El calcáneo es cortada, dejando un pequeño pedazo de hueso todavía adherido al tendón de Aquiles. Sonometric cristales y / o electrodos de electromiografía se puede insertar. La inmovilización de las sondas de metal en el fémur y la tibia evita el movimiento del origen muscular. El tendón de Aquiles se une al transductor de fuerza y ​​la piel suelta se levanta a los lados para formar un recipiente que se llena con aceite de parafina caliente. El aceite distribuye el calor uniformemente y minimiza la pérdida de calor por evaporación. Una lámpara de calor se dirige en el músculo y el músculo y la rata se dejó calentar hasta 37 º C. A pesar de que se está calentando, la tensión máxima y la longitud óptima se puede determinar. Estos son importantes las condiciones iniciales para cualquier experimento en el músculo entero intacto. El experimento puede incluir la determinación del estándar de las propiedades contráctiles, como la fuerza-frecuencia, la fuerza-talla, y la relación fuerza-velocidad. Con el cuidado en el aislamiento quirúrgico, inmovilización del origen del músculo y la alineación de la unidad músculo-tendón con el transductor de fuerza, y el análisis de datos adecuados, mediciones de alta calidad se puede obtener con esta preparación muscular.

Este video demuestra los procedimientos quirúrgicos y preparaciones necesarios para estudiar las respuestas contráctiles del músculo gastrocnemio medial de rata in situ. Esta preparación permite la medición de las propiedades contráctiles del músculo esquelético bajo condiciones fisiológicas. El animal se anestesia y el músculo se separa del tejido circundante en su extremo distal. El tendón de Aquiles se conecta a un transductor de fuerza, lo que permite medir la respuesta contráctil del músculo a 37 grados C con una circulación intacta.

Procedimientos para la Rata In situ Propiedades contráctiles del músculo esquelético

Existen muchas circunstancias en las que resulta deseable obtener la respuesta contráctil del músculo esquelético bajo condiciones fisiológicas: normales ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las propiedades contráctiles del músculo esquelético bajo condiciones fisiológicas. Esto se logra anestesiando a un animal y aislando quirúrgicamente el suministro motor al músculo de interés. El siguiente paso del procedimiento consiste en aislar el extremo distal del músculo.A continuación, el músculo se monta en un injerto miológico de manera que el origen muscular se inmoviliza y la longitud del músculo se ajusta a una longitud de referencia reproducible. Al estimular los nervios motores, se pueden obtener resultados que muestran propiedades contráctiles fundamentales como la velocidad de la fuerza, la frecuencia de la fuerza y la fatiga, o propiedades únicas asociadas con patrones de estimulación inusuales. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos, como la evaluación in vitro de las propiedades contráctiles, es que la evaluación in situ permite el examen directo de las propiedades contráctiles del músculo a temperatura corporal y con un flujo sanguíneo normal.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la mecánica muscular, el metabolismo muscular y la fisiología del ejercicio, como por ejemplo cuáles son los mecanismos de la fatiga muscular periférica. Cuáles son las consecuencias a corto plazo de la activación repetida. El tratamiento crónico de los animales con entrenamiento o suspensión de la extremidad trasera, por ejemplo, seguido de la evaluación de las propiedades contráctiles, permite determinar el impacto de dicho tratamiento sobre las propiedades contráctiles.Este método in situ puede proporcionar información cuando cambian las propiedades contráctiles del músculo esquelético. Las propiedades contráctiles pueden cambiar agudamente con la activación repetitiva o crónicamente con la inactividad por enfermedad o con el entrenamiento. Las contracciones pueden ser isométricas o dinámicas, y se pueden considerar las variaciones en la longitud del músculo.Una vez que la rata seleccionada esté completamente anestesiada, inmovilícela sobre una plataforma de plexiglás con cinta adhesiva. Añada una gota de aceite de parafina en los ojos y verifique nuevamente que estén ausentes los reflejos corneales o plantares antes de continuar. No es necesario emplear técnica estéril porque este procedimiento es agudo.Ahora, utilizando tijeras, corte a través de la piel afeitada desde el talón hasta la columna vertebral y separe la piel del tejido subyacente. Mantenga las superficies expuestas cubiertas con gasa empapada en solución salina isotónica. Corte proximalmente a través del músculo superficial sobre el músculo gastrocnemio, siguiendo la misma línea de la incisión en la piel. Al cortar a través del músculo, asegúrese de localizar y evitar el nervio ciático.Utilice la trayectoria del nervio para guiar la incisión, pero manténgase bien por encima del nervio. A continuación, identifique la línea divisoria clara entre los músculos y corte a lo largo de esa línea hacia la rodilla. Tenga cuidado de no cortar ningún vaso sanguíneo.Una hemorragia excesiva o incluso un daño al vaso sanguíneo esencial provocará una preparación muscular que se deteriora rápidamente y presenta una relajación muscular lenta. Ahora, elimine el tejido conectivo del nervio ciático para poder introducirlo en la funda nerviosa. Asegúrese de manipular el nervio con delicadeza.Estirar el nervio puede provocar una excitabilidad excesiva, finalizando así el experimento prematuramente. Coloque un lazo alrededor del nervio cortado proximal al lazo y refleje el nervio hacia atrás sobre el músculo. Ahora, utilice una herramienta rotativa manual para perforar un pequeño orificio piloto a través de la corteza, casi hasta la médula del fémur.No taladre demasiado profundamente, ya que podría producir una hemorragia excesiva. Evite tocar los tejidos blandos bajo un microscopio estereoscópico. Localice el punto donde el nervio poplíteo desaparece detrás del músculo gastrocnemio medial.Extienda suavemente las distintas ramas y corte la rama hacia el gastrocnemio lateral. Las otras ramas se seccionarán cuando se retire la parte distal de la pierna. La inervación puede determinarse mediante microestimulación.Además, corte las ramas superficiales utilizando tijeras. Corte o seccione por diseción romo el músculo gastrocnemio para separarlo de otros tejidos. Tire del tendón del terraza plenar hacia afuera desde debajo del tendón de Aquiles.Átelo y corte su tendón. Luego separe una longitud considerable de los plantares del músculo gastrocnemio y corte la cuerda atada al tendón de los plantares. Ahora coloque una ligadura de seda número uno alrededor del tendón de Aquiles y átela con un nudo cuadrado.No tire demasiado fuerte o el tendón se dañará. Utilice fresas óseas para cortar el calcáneo, dejando un pequeño trozo de hueso adherido al tendón de Aquiles. Mantenga las superficies de corte horizontales para asegurarse de que se corte el hueso y no solo el tendón.Localice el músculo sous en la cara inferior del gastrocnemio y, mediante disección romo, separe los dos músculos. A continuación, corte el tendón del sóleo cerca del extremo distal. Finalmente, separe los músculos gastrocnemios medial y lateral.Corte el tendón lateral para que el músculo gastrocnemio medial sea el único tejido unido al tendón de Aquiles, separando el músculo gastrocnemio del tendón de Aquiles. Coloque una ligadura ajustada alrededor del eje de la tibia justo por encima del punto medio. No corte el tejido. Haga un segundo lazo para evitar deslizamientos y asegure la ligadura con un nudo cuadrado.Ahora, utilizando una sierra pequeña, corte la pierna inferior por la mitad del peroné. Luego, inserte una sonda afilada en la médula del peroné. Utilizando clips Michel, sujete dos bandas elásticas a este; estas se usarán para mantener la piel elevada alrededor del músculo y formar un recipiente para el aceite de parafina.Coloque la rata sobre la base del injerto mio y inmovilice su pata orientando la sonda tibial hacia la palanca y colocándola en el soporte. Ahora tire de la piel hacia arriba en los lados para formar un recipiente y asegure la piel con elásticos. Sostenga el fémur por el lado anterior y coloque una broca dentro del fémur.Sujete la fresa a una barra transversal. A continuación, pase el muñón distal del nervio ciático a través de la funda estimuladora del nervio. Colóquelo cerca del origen del músculo y conecte el estimulador a los cables de la funda nerviosa.Sujete el tendón de Aquiles a la palanca. Átelo firmemente dejando algo de espacio para realizar ajustes. Luego, alinee el músculo perpendicularmente a la palanca.Ahora, llene el recipiente formado por la piel con aceite de parafina tibio y coloque una lámpara de calor sobre el animal para asegurar que la temperatura central del animal no supere los 38 grados Celsius. Coloque láminas de aluminio entre la lámpara de calor y el transductor de fuerza, y entre la cabeza de la rata y la lámpara de calor. El último paso en esta preparación consiste en ajustar la longitud del músculo hasta que no haya holgura en el hilo entre el gastrocnemio medial y el transductor de fuerza mientras el músculo se calienta.Configure la duración del pulso del estimulador en 50 microsegundos y 0,5 voltios. Ahora estimule el músculo a intervalos de ocho a doce segundos. Aumente gradualmente el voltaje hasta que la amplitud del espasmo alcance una meseta.La meseta se produce en el voltaje máximo, y a menos que el nervio esté dañado, debería ser inferior a 1,5 voltios. A continuación, estimule al doble del voltaje máximo para asegurar la activación de todas las unidades motoras. Después, aumente la longitud del músculo en incrementos de un milímetro y mida la amplitud de la contracción a cada longitud. Utilice una estimulación con doble pulso de 200 hercios cuando se determine la longitud que proporciona la máxima amplitud de contracción.Ajuste el músculo a esta longitud. Ahora configure el estimulador para entregar pulsos a 200 hertzios durante 500 milisegundos, con el fin de generar una contracción tética completamente fusionada. Esto tensa todas las conexiones musculares, incluyendo los nudos en el músculo; luego vuelva a determinar la longitud de referencia y el músculo estará listo para el experimento.Estas contracciones se obtuvieron para ilustrar la relación entre fuerza y frecuencia. Al calcular la fuerza activa máxima de estas contracciones y graficar la fuerza activa frente a la frecuencia, se obtuvo esta relación entre fuerza y frecuencia. Los datos pueden ajustarse a la ecuación presentada en la pantalla, donde AF es la fuerza activa, F es la frecuencia, y A, B, C y D son constantes.Esta ecuación genera una línea que se ajusta estrechamente a los datos. Una vez dominada, la cirugía y la preparación para esta técnica pueden completarse en una hora, pero no convierta esto en una competencia mientras realiza el procedimiento. Es importante verificar regularmente el nivel de anestesia del animal tras este procedimiento.Se pueden realizar otras mediciones, como el flujo sanguíneo mediante EMG o la evaluación bioquímica, para responder otras preguntas, tales como: ¿se ha reducido la excitabilidad de la membrana? ¿Se han agotado los suministros de energía o se ha visto comprometido el flujo sanguíneo?

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