Inyección estereotáxica de vectores virales para la reprogramación de células gliales en un modelo de ratón

Asegure un ratón transgénico anestesiado en un marco estereotáxico con el cráneo expuesto.

Este ratón expresa Cre recombinasa en células gliales.

Coloque el brazo estereotáxico que sostiene el tubo capilar sobre el cráneo y alinéelo por encima del bregma.

Ajuste los ejes estereotácticos para una orientación precisa.

Taladre un agujero en el sitio objetivo, asegurándose de que la duramadre permanezca intacta. Retire los fragmentos de hueso.

Enjuague el tubo capilar con tampón. Dibuje una burbuja de aire, luego cargue el virus adenoasociado que lleva genes de proteínas fluorescentes y reprogramación neuronal inactiva.

Baje el tubo capilar a la profundidad objetivo e inyecte la solución viral en la región rica en células gliales.

Retraiga con cuidado el tubo para evitar el reflujo.

Cierre la incisión y permita la recuperación.

Los virus internalizados entregan genes inactivados flanqueados por loxP al núcleo glial. La cre recombinasa los invierte, activando genes de reprogramación neuronal e impulsando la conversión neuronal. Las interneuronas reprogramadas expresan la proteína fluorescente bajo el promotor específico de la neurona.

Para inyectar factores de reprogramación, coloque un ratón anestesiado en el marco estereotáxico, administre la analgesia adecuada al comienzo de la cirugía, luego lleve la punta del capilar de vidrio de la aguja de inyección justo por encima del bregma. Asegúrese de que la punta capilar esté perfectamente recta en los planos A-P y M-L. Restablezca los valores M-L y A-P a 0,0 en el contador de coordenadas digital.

Para asegurarse de que la cabeza del animal esté en una posición perfectamente plana, use el contador de coordenadas digital para medir el valor de la coordenada D-V cuando el brazo A-P está en más 2.0 y menos 2.0, así como cuando el brazo ML está en más 2.0 y menos 2.0. Ajuste la altura de la barra dental y las barras de los oídos en consecuencia. Luego, levante ligeramente la jeringa y taladre un agujero con un taladro dental en las coordenadas de inyección.

Comience a perforar en el sitio, trabajando de manera circular y suave. Luego, coloque un trozo de gasa de algodón sobre la incisión abierta y enjuague la jeringa con solución salina. Después del lavado, extraiga una burbuja de aire y luego 1 microlitro de solución que contenga el vector viral. Asegúrese de que la solución viral se pueda visualizar fácilmente debajo de la burbuja de aire.

A continuación, baje la jeringa, progresando lentamente hasta la profundidad deseada y asegúrese de que la trayectoria esté libre de fragmentos óseos. Posteriormente, inyecte 1 microlitro de la solución viral a una velocidad de 0,4 microlitros por minuto. Cuando termine la inyección, espere dos minutos para la difusión antes de retirar la jeringa.

Después de la difusión, retraiga lentamente la jeringa hasta que la punta del capilar se retire por completo del cerebro. Luego, sutura con cuidado la incisión y retira al animal del marco estereotáxico. Monitoree al animal en una estación postoperatoria hasta que recupere la conciencia.

Los animales se mantienen hasta 12 semanas después de la inyección del virus para permitir que la glía residente se reprograme en neuronas maduras.