Embalaje VIH o FIV basados ​​en lentivirus Construcciones de expresiones y de transducción de la VSV-G partículas virales pseudotyped

El objetivo general de este procedimiento es aprender sobre el empaquetamiento lentiviral. Un protocolo de cinco días. El primer día, 2 9 3, las células productoras de TN se siembran a una densidad calculada.

Al segundo día, las células se transfectan con la construcción del vector lenti de elección que contiene el gen de interés y la mezcla de plásmidos de empaquetamiento viral. En el cuarto día, el estado viral se cosecha y se concentra mediante la adición de una solución de precipitación de virus PEG. Los pasos finales del procedimiento son recolectar el virus concentrado PEG, alicuota del virus e infectar las células con el virus concentrado para que el virus se tambalee.

En última instancia, la PCR cuantitativa de genes integrados de forma estable se utiliza para calcular el número de constructos integrados estables. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la transfección de plasma o la transducción retroviral, es que el protocolo optimizado de empaquetamiento de lentivirus del FBI produce un virus funcionalmente activo de alto título, lo que permite una entrega eficiente en casi cualquier célula de mamífero, incluidas las células difíciles de transfectar como las células madre y las células primarias que no se dividen. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no están familiarizadas con los pequeños detalles del protocolo, que son esenciales para la producción exitosa del virus de alto título.

La demostración visual de este método es útil ya que la densidad celular visualizada a través de un microscopio durante la transfección determina la eficiencia del empaquetamiento viral, que determina el título viral final. En los casos en que la expresión del indicador fluorescente es aplicable, determina la eficiencia de la transfección, lo que tiene un impacto significativo en el título viral final. Además, la demostración visual de este método es útil para que los investigadores se familiaricen con partes sutiles pero importantes del protocolo, como las mejores prácticas para mantener la esterilidad durante todo el proceso y cómo evitar incluir restos celulares en el virus cosechado.

Un empaquetado lentiviral eficiente se basa en tres componentes. En primer lugar, el vector de expresión lentiviral debe contener algunos de los elementos necesarios para el empaquetamiento del virus y la integración estable, así como elementos para la expresión del gen de interés. Horquilla corta, ARN, micro ARN o un casete reportero.

En segundo lugar, los plásmidos de empaquetamiento lentiviral deben proporcionar las proteínas esenciales para empaquetar una copia de ARN de la construcción de expresión en partículas pseudovirales recombinantes y la posterior transcripción inversa e integración del virus tras la infección. En tercer lugar, las celdas productoras de 2 9 3 TN deben ser seccionadas transitoriamente con los vectores de expresión y empaquetamiento. Estas células producen altos títulos, partículas pseudovirales que se extraen de los medios de cultivo.

En última instancia, la transducción exitosa de las células objetivo depende principalmente del número de partículas virales por célula para un tipo de célula determinado. En otras palabras, la multiplicidad de infecciones comienza con el crecimiento de 2 9 3 células TN. En placas de cultivo celular de 15 centímetros durante 18 a 24 horas para obtener un 60 a 80% de fluidez.

En el momento de la transfección, cada placa producirá aproximadamente 14 millones de células para aumentar la producción del virus. Se puede usar más de una placa al día siguiente, cuando las células 2 9 3 TN tienen un 60 a 80% de confluente, están listas para la transfección. Para cada placa de células, agregue 1,6 mililitros de DMEM sin suero a un tubo de halcón de 15 mililitros.

A continuación, añada 22,5 microgramos de ppac H one o Ppac F1 y 4,5 microgramos de su vector lenti Construct al DMEM y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, agregue 55 microlitros de afecto puro en el mismo tubo y vórtice durante 10 segundos, seguido de una incubación a temperatura ambiente de 15 minutos. Después de 15 minutos, agregue un tubo en cada placa de cultivo.

Gota a gota, luego agite suavemente la placa, luego incube las células durante 48 horas a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono después de 48 horas. Si la construcción del vector lenti expresa un gen fluorescente como GFP, verifique las células bajo un microscopio, una transfección exitosa producirá entre 50 y más del 90% de células fluorescentes verdes que ahora recogen el sobrenadante de cultivo celular en un tubo cónico de 50 mililitros. El sobrenadante contiene las partículas pseudovirales infecciosas.

Cualquier célula que se desprenda de la placa no afectará negativamente la producción del virus. Para eliminar los residuos, centrifugar, el sobrenadante viral a 1500 G durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, sin alterar el pellet, recoja el sobrenadante viral asegurándose de dejar un tampón de aproximadamente 500 microlitros de sobrenadante y continúe con el siguiente paso, que es concentrar las partículas virales 72 horas después de la transfección.

Se puede realizar una segunda recolección opcional del supernat viral utilizando la misma técnica después de que se recolecta el estado viral. Se concentra añadiendo un volumen de solución de precipitación de virus peg helado por cada cuatro volúmenes de sobrenadante en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros. Invierte la solución para mezclarla.

Nunca use un vórtice, luego almacene la solución sin agitación a cuatro grados Celsius durante un máximo de 96 horas. Después de un mínimo de 12 horas de refrigeración, centrifugar la mezcla a 1500 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, las partículas lentivirales precipitadas peggo aparecerán como una bolita beige o blanca en el fondo del tubo.

Ahora, elimine todos los rastros de líquido mediante una aspiración cuidadosa sin alterar las partículas lentivirales precipitadas en el pellet. Alternativamente, retire la mayor parte de la supra natina y vuelva a suspender el pellet en el depurado restante. A continuación, transfiera la suspensión a un tubo estéril de einor de dos mililitros y centrifugue el tubo en una micro fuga fría durante dos minutos.

A 14.000 rpm, pipetear el sobrenadante restante y volver a suspender la pastilla de partículas lentivirales en hielo, tampón frío y estéril a una 100ª a una 100ª. El volumen original pipetea cuidadosamente el pellet en solución sin crear burbujas, manteniéndolo frío en todo momento. Asegúrese de que el pellet esté completamente resuspendido.

Por último, haga de 15 a 25 microlitros de tinta alícuota, viales criogénicos estériles en hielo y almacene los viales a 70 grados centígrados negativos. Una ejecución de empaquetado exitosa producirá de 10 millones a 1000 millones de instrucciones de uso por mililitro para la transducción de virus en una placa de cultivo de 24 pocillos, 50.000 células por pocillo y las cultivará durante la noche en sus condiciones de cultivo especificadas. Las células deben tener entre un 50 y un 70% de confluentes para la transducción con fines de tittering.

Las células HT 10 80 se pueden utilizar como una línea celular de control fácil de transducir al día siguiente para aspirar los medios de las células. A continuación, combine el medio de cultivo con una solución concentrada de pato. Por lo tanto, la concentración final de patos trans es uno x, agregue medio mililitro de lo transducido a cada pocillo con células objetivo a la densidad correcta de 50 a 70%Co fluidez agregue virus a cada pocillo en las siguientes diluciones, uno a 100, uno a 10 y dilución directa uno a uno.

El virus puede permanecer en contacto con las células diana hasta 72 horas sin cambiar el medio. Después de 72 horas, el provirus se habrá integrado de manera estable en el genoma del huésped y estará expresando el gen de interés. Si la expresión presente de marcadores fluorescentes se puede utilizar para estimar la eficiencia de la transducción con diferentes diluciones de virus, entonces el número de unidades infecciosas se puede cuantificar mediante QPCR.

Una vez que se conoce el título del virus, se calcula el volumen apropiado de virus para lograr la multiplicidad deseada de infección para otras células objetivo. La medición del título y el control del MOI garantizan la coherencia entre los experimentos y las diferentes preparaciones virales. El virus ya está listo para su uso en experimentos adicionales.

La densidad inicial de las células 2 9 3 TN fue crítica para el éxito del empaquetamiento viral el día de la transfección. Estas 2 9 3 células TN tenían entre un 60 y un 80% de confluentes. 24 horas después de una transfección exitosa con un vector de lenti que expresaba GFP, se encontró que al menos el 90% de las 2 9 3 células TN mostraron fluorescencia verde.

72 horas después de la transducción, la GFP continuó expresándose en las células huésped HT 10 80. Esto indica que la construcción lentiviral integrada de manera estable en el genoma del huésped transduciendo las mismas células huésped con una dilución diez veces mayor disminuyó proporcionalmente la expresión de GFP. Porque la relación entre el título viral y la expresión génica mediada por lentivirales es directamente proporcional.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en el transcurso de cinco días en aproximadamente una o dos horas por día si se realiza correctamente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo empaquetar partículas virales funcionalmente infecciosas de manera eficiente y segura, y transducir con éxito células con el virus. No olvide que trabajar con lentivirus puede ser peligroso y precauciones como trabajar en BSL dos campanas de cultivo de tejidos.

Siempre se debe usar bata de laboratorio y guantes mientras se realiza este procedimiento.