Name: Embalaje VIH o FIV basados en lentivirus Construcciones de expresiones y de transducción de la VSV-G partículas virales pseudotyped (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprende a empaquetar partículas virales pseudotipadas con VSV-G para transducción eficiente de células mamíferas usando células productoras 293TN. Este protocolo de cinco días optimiza la producción de virus de alto título para expresión génica estable.

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Nos gustaría agradecer al personal y los científicos en el OSE por su apoyo en el desarrollo y prueba de estos protocolos.

1. La transfección de células con plásmidos 293TN de embalaje y de Expresión de la Construcción <ol><li> Semillas 7,0 a 8,0 x 10 6 293TN células por placa de 15 cm de cultura 2 en 20 ml de medio de cultivo que contiene medio DMEM suplementado con 4 mM de L-glutamina, 4,5 g de glucosa / l, y suero bovino fetal (10%) sin antibióticos. Crecer durante 18-24 horas a 37 ° C con 5% de CO 2 de manera que la densidad celular alcanza 60-80% de confluencia en el momento de la transfección. En algunos casos, puede ser necesario para las placas de semillas de varias células para obtener un alto título suficiente para la transducción de las células diana. </li><li> Para cada placa de las células, añadir 1,6 ml de DMEM libre de suero a un autoclave tubo 2 ml Eppendorff. Añadir 45 l pPACKH1 o pPACKF1 y 4,5 g de la construcción de lentivirus de la DMEM y mezcla pipeteando arriba y hacia abajo. </li><li> Añadir 55 l de PureFection en el mismo tubo. Vortex durante 10 segundos. Incubar el DMEM-plásmidos PureFection mezcla a temperatura ambiente fo 15 min. </li><li> Agregue el DMEM-plásmidos PureFection mezcla a la placa de cultivo de tejidos, gota a gota y agitar suavemente para dispersar uniformemente en toda la placa. Vuelva a colocar el plato a la incubadora y crecer a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> No hay necesidad de cambiar los medios de comunicación después de la transfección. Si su lentivirus construcción expresa un gen que codifica una proteína fluorescente GFP, como, revisar sus células bajo el microscopio de 12-24 horas después de la transfección. Debería ser capaz de ver las células&gt; 90% GFP-positivo, lo que indica que la transfección se realizó correctamente. </li><li> Recoger el sobrenadante del cultivo de células después de 48 y 72 horas en un tubo de centrífuga de 50 ml estéril. Este sobrenadante del cultivo celular ahora contiene partículas infecciosas pseudoviral. (Siga las pautas recomendadas para trabajar con la clase de seguridad BSL-2.) Se centrifuga a 1.500 xg durante 15 min a temperatura ambiente para precipitar los restos celulares. Transferir el sobrenadante viral a un nuevo tubo, asegurando de no perturbar el sedimento. </li><li> Células 293TN que han sido utilizados para el envasado viral debe ser eliminado de un contenedor séptico y no han de ser utilizados para rondas adicionales de embalaje viral. </li></ol> 2. La concentración del sobrenadante viral <ol><li> Añadir 1 volumen de frío (4 ° C) de PEG-lo solución de precipitación virus a cada 4 volúmenes de lentiviral partícula que contiene sobrenadante. La precipitación de partículas lentiviral de grandes volúmenes se puede lograr con Corning 250 tubos de centrífuga de polipropileno ml. Mezclar la solución por los tiempos de inversión de los tubos varias, pero no del vórtice de la mezcla. </li><li> Refrigerar la solución a 4 ° C durante al menos 12 horas (hasta 4 días es aceptable). No agitar o rotar los tubos durante la etapa de refrigeración. </li><li> Centrifugar el sobrenadante / PEG-se mezcla a 1.500 xg durante 30 minutos a 4 ° C. Después de la centrifugación, las partículas lentiviral aparecerá como un precipitado de color beige o blanco en la parte inferior del tubo. Vierta el supernatant. </li><li> Quite todos los rastros de líquido por aspiración, teniendo cuidado de no alterar las partículas precipitadas lentivirales en el sedimento. Trazas de PEG-residual se va a diluir el virus (reduciendo así el título), pero no afecta a la integridad de las células diana desde el PEG-que es inerte y no tóxico. </li><li> Resuspender y combinar las partículas lentiviral en 1/100 del volumen original utilizando frío (4 ° C), fosfato estéril o solución salina tamponada con DMEM que contenía 25 mM de tampón HEPES. </li><li> Dividir en partes alícuotas en viales criogénicos estériles y se almacena a -70 ° C hasta que estén listos para su uso. </li></ol> 3. Titulación viral y transducción de las células diana <ol><li> Le recomendamos titulación de las partículas antes de la transducción de lentivirus el objetivo de las células de interés y el cálculo de la multiplicidad caso de infección (MOI) de las células diana para la coherencia entre los experimentos. Tituló el virus, se recomienda utilizar las células HT1080 como una línea de control fácil de infectar a positivo. Pl.facilidad en cuenta que el protocolo titering implica transducir células HT1080 con una pequeña alícuota de las partículas lentiviral que han envasados. Una vez que el título se sabe, las células diana de interés también puede ser transducidas con las partículas producidas lentivirales. Un protocolo de Titulación recomendamos se puede encontrar en: <a href="http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf</a> 7. </li><li> Placas 50.000 células diana de interés por pocillo en una placa de 24 pocillos en medio de cultivo celular. Utilice los medios de comunicación que las células normalmente se cultivan in crecer las células durante la noche en sus condiciones de cultivo específicas. Las células deben ser entre 50 a 70% confluentes en el día de la transducción. </li><li> En el día de la transducción, aspirar los medios de comunicación de las células. Combinar medio de cultivo con TransDux a una concentración de 1 x final (por ejemplo, 2,5 l TransDux a 500 l de medio de cultivo). A continuación, traslado de la TransDux-ceEl cultivo LL mezcla medio a cada pocillo. </li><li> Pipetear el volumen apropiado de virus que corresponde a la óptima MOI para las células diana en cada pocillo. Si la MOI óptimo es desconocido, se recomienda tratar una gama de diferentes MOI (tal como una MOI de 1, 2 y 5 para fácil de infectar las células de cultivo de tejidos, y una MOI de 1, 10 y 20 para más difíciles de a infectar a las células primarias). Si la concentración de las partículas lentiviral no es conocido (como se determina a través de un protocolo titering virus), diferentes volúmenes de virus puede ser tratado, tal como l 1, 2 y 5 del virus. El virus puede permanecer en contacto con las células diana por hasta 72 horas. </li><li> Otros experimentos con las células transducidas de interés objetivo puede ser iniciada 72 horas después de la transducción, una vez que el constructo viral ha integrado en el genoma de la célula huésped. Cambiar el medio y el paso de la meta de las células de interés de acuerdo a sus necesidades específicas. </li></ol> 4. Los resultados representativos <pclass la transfecci de c> La densidad inicial de las células 293TN es crítico para el envasado viral exitosa. Células 293TN debe estar entre 60 -80% confluente el día de la transfección (Figura 2). Si las células 293TN son menos del 60% confluentes, que puedan crecer durante unas horas más antes de intentar la transfección. Si las células son confluentes 293TN&gt; 80%, deben ser replated antes de la transfección. Si se utiliza un GFP lentivirus expresar, por lo menos 90% de las células 293TN debe fluorescencia verde 24 horas después de la transfección, lo que indica una transfección exitosa (Figura 3). Si menos del 90% de las células son GFP-positivo, no proceda con el siguiente paso, porque esto indica que la transfección no tuvo éxito, y los títulos virales será baja. En cambio, la placa 293TN nuevas células y empezar de nuevo, asegurándose de que las células son 293TN a la densidad celular adecuada antes de la transfección. 293TN células pueden quitar las placas de cultivo de tejidos de 48-72 horas después de la transfección. Esto no afecta negativamente a la producción de partículas lentivirales. Titulando con células HT1080 Los títulos virales se puede calcular utilizando el kit de OSE global Titulación ultrarrápido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este sistema utiliza qPCR para medir la integración de la secuencia viral WPRE a partir del vector lentiviral en las células HT1080 y la compara con una curva estándar, basada en una secuencia de referencia genómico para medir con precisión las unidades infecciosas por ml (Figura 4). La transducción de las células diana Si se utiliza partículas lentivirales que expresan un marcador GFP constitutivamente activa, las células GFP positivos deberían comenzar a aparecer dentro de 12-24 horas de la transducción, si la reacción de transducción está trabajando. La expresión de GFP debe continuar después de la construcción se integra en forma estable lentiviral tél alojar genoma de la célula. Si con la transducción de las MOI diferentes, la fluorescencia de GFP aproximadamente debe coincidir con el momento de inercia, donde las MOI bajas muestran una menor fluorescencia de la GFP y el aumento de las MOI muestran un aumento de la fluorescencia de GFP (Figura 5). <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Visión general del protocolo de la producción viral. Los plásmidos de envasado y lentivirus PPACK se mezclan y se co-transfectaron en células 293TN. Después de 48 -72 horas, el sobrenadante viral se recoge, y las partículas virales se precipitó con PEG-ella. Después de titulación de las partículas lentivirales, que puede ser utilizado para la transducción de la meta de las células de interés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3171/3171fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fase de contraste de imagen de las células 293TN. Celular Density debe ser de entre 60-80% confluente el día de la transfección. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. La imagen fluorescente de las células GFP-positivas 293TN 24 horas después de la transfección con Purefection, pPACKH1, y un lentivirus GFP construir codificación. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Resultados WPRE qPCR y la curva estándar obtenida usando el kit de Global OSE Titulación ultrarrápido para el cálculo de MOI y el título correspondiente de paquetes de partículas virales. <img src="/files/ftp_upload/3171/3171fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Imágenes de la Figura 5. Fluorescentes de las células HT1080 transducidas con cantidades crecientes de los lentivirus. Las imágenes son de 72 horas después de la transducción. </pclass>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNA+Viruses.+A+Practical+Approach%22">RNA Viruses. A Practical Approach</a>. Cann, A. J. , Oxford Univ. Press. (2000).</li>
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</ol>

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Este embalaje viral y la transducción de las células objetivo del Protocolo ha sido optimizado para su uso con los reactivos de empaque virales de SBI. La sustitución de otros reactivos pueden afectar el resultado del protocolo. Este protocolo sólo se ha optimizado para la producción lentiviral y puede no ser adecuado para producir otros tipos de virus o pseudoviruses. Envases viral exitosa depende de varios pasos clave. Las células 293TN expresan el antígeno T de SV40 grande, que es absolutamente necesario para la secreción de las partículas lentiviral en el sobrenadante del cultivo celular. La densidad en el que las células son 293TN en el momento de la transfección es especialmente importante para que el reactivo PureFection para transferir suficientemente el lentivirus y plásmidos de envasado en las células. Adición de la mezcla PureFection a la placa de cultivo de tejidos de una manera gota a gota seguido por agitación a fondo la placa es importante para la dispersión de los plásmidos de envasadoy lentivirus construir a lo largo de todas las células. El fracaso para distribuir apropiadamente los vectores puede resultar insuficiente partículas lentiviral que se producen. La reacción de envases viral puede ser ampliado para la producción de virus de alto título, basado en el área de la superficie de las placas de cultivo de tejidos. Uno puede elegir a la placa de varios platos de cultivo de tejidos de células 293TN por constructo que necesita ser embalado. La concentración de los sobrenadantes virales es especialmente útil en la creación de alto título de virus. Sobrenadante viral a partir de placas múltiples de células pueden ser combinadas y se concentraron para su uso en experimentos in vivo, o para las células que son difíciles de transducir. Titulación de las partículas producidas lentiviral es importante para el cálculo de una precisa MOI a utilizar para la transducción de las células diana. Conociendo el momento de inercia que se utilizó en una transducción dado permite reparación en el caso de que la transducción no es correcta. Por ejemplo, utilizando una MOI que esdemasiado baja puede dar lugar a células diana que expresan muy pocos el constructo de interés. El uso de un momento de inercia que es demasiado alto, sin embargo, puede dar lugar a células diana que muestran signos de estrés. El objetivo es usar una MOI que maximiza la expresión del constructo de interés, preservando la salud de las células. Aunque se recomienda un protocolo titering qPCR basado en que mide copias integradas del constructo lentiviral en las células HT1080, otros enfoques tituló también se puede utilizar, tales como ELISA p24 o estimación del porcentaje de células positivas GFP. El éxito de la transducción de las células diana es también dependiente de varios factores clave. TransDux es un reactivo de infección único que permite una alta eficiencia de transducción, pero que no es tóxico para las células. TransDux puede utilizarse en lugar de polibreno, que a menudo es tóxico para las células diana. La inclusión de TransDux en la transducción de las células diana ayuda para neutralizar las cargas sobre las partículas virales y permite que el virus en la células. Desde TransDux no es tóxico para las células, se puede permitir que las partículas lentiviral a permanecer en contacto con las células durante 72 horas (el tiempo en que los constructos virales han integrado en el genoma de la célula huésped), aumentando así la probabilidad de que el partículas virales de entrar en la célula. Para algunas células difíciles de transduce, transducción se puede repetir en días sucesivos para aumentar la eficiencia de transducción. Por ejemplo, transducir las células en el día 1, permitir que las células para descansar en el día 2 y, a continuación transducir las células de nuevo el día 3. Es importante que esperar 72 horas después de la transducción última antes de la selección principio, experimentos adicionales o caracterización de las células diana. Embalaje viral eficiente es también depende del tamaño del constructo lentiviral, entre el 5 &#39;y regiones 3&#39;LTR. Esta sección de la construcción lentiviral debe ser de aproximadamente 9 kb o menos, lo que corresponde al tamaño del genoma del VIH nativo. Superior al 9 kb de mayo deaumentar el título de las partículas producidas pseudoviral. La nueva tecnología, como piggyBac vectores de transposones, permitir la integración fiable y estable de los transgenes de hasta 100 kb a través de una sola transfección. Este enfoque puede ser utilizado para las construcciones que exceden el límite de tamaño para los vectores lentiviral, en los casos en que es posible transfectar células diana, y proporciona la ventaja adicional de no requerir una etapa de envasado viral 9,10. Las partículas producidas pseudoviral que utilizan este protocolo son infecciosos en que pueden infectar a la mayoría de tipos de células de mamíferos. Los productos utilizados en este protocolo, sin embargo, son de tercera generación BIOSAFE ya que producen no replicativa y pseudoviruses auto-inactivantes. Por lo tanto, una vez traducida en las células diana o los animales, las células diana o animales no son infecciosas o contagiosas. La sustitución de otros lentivirus plásmidos que no son de tercera generación BIOSAFE es posible aunque no es recomendable a partir de una seguridad de la biotecnologíaperspectiva. El protocolo de la producción viral y la transducción de las células diana siguiente debería llevarse a cabo bajo nivel de bioseguridad 2, de acuerdo con las directrices del NIH 11, y los investigadores siempre deben usar una bata de laboratorio y guantes para manipular las partículas virales. Las pilas de productores 293TN, tubos de partículas virales, y pipetas desechables se deben tirar en un contenedor de riesgo biológico correspondiente. Pipetas reutilizables y material de vidrio deben ser descontaminados con cloro y autoclave para disminuir la exposición del personal.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> DMEM medio de glucosa de alta </td><td> Gibco </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> Las células 293TN </td><td> OSE </td><td> LV900A-1 </td><td></td></tr><tr><td> pPACKH1 </td><td> OSE </td><td> LV500A-1 </td><td> Para el VIH basados ​​en lentivectors </td></tr><tr><td> pPACKF1 </td><td> OSE </td><td> LV100A-1 </td><td> Para FIV basados ​​en lentivectors </td></tr><tr><td> Cualquier vector lentiviral </td><td> OSE </td><td> Varios </td><td> cDNA, shRNA, microRNA, los reporteros de la transcripción </td></tr><tr><td> PureFection </td><td> OSE </td><td> LV750A-1 LV750A-5 </td><td></td></tr><tr><td> PEG-lo </td><td> OSE </td><td> LV810A-1 LV825A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Kit Global Titulación ultrarrápido </td><td> OSE </td><td> LV961A-1 </td><td> No se han descrito en este protocolo, pero es necesario para titular las partículas virales </td></tr><tr><td> TransDux </td><td> OSE </td><td> LV850A-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

embalaje vih o fiv basados ​​en lentivirus construcciones de expresiones y de transducción de la vsv-g partículas virales pseudotyped

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Como con el estándar de vectores plasmídicos, es posible transfectar lentivectors en forma de plásmido en las células con bajo a mediano eficiencia para obtener la expresión transitoria de efectores. Constructos de embalaje lentiviral expresión en partículas pseudoviral, sin embargo, permite hasta 100% de transducción, incluso con difíciles de transfectar células, tales como tallo principal, y las células diferenciadas. Además, la entrega lentiviral no produce las respuestas celulares específicos asociados típicamente con transfecciones químicos, tales como la muerte celular resultante de la toxicidad del reactivo de transfección 1, 2. Cuando transducidas en las células diana, el constructo lentiviral integra en el ADN genómico y proporciona la expresión estable de la horquilla pequeño ARN (shRNA), gen microARN ADNc, o reportero 3, 4. Las células diana que expresan establemente la molécula efectora se puede aislar utilizando un marcador seleccionable contenida en el vector de expresión construir tales como puromicina o GFP. Después de pspartículas eudoviral infectar las células diana, no puede replicarse dentro de las células diana debido a que los genes estructurales víricas están ausentes y las repeticiones terminales largas (LTR) están diseñados para ser auto-inactivación en la transducción de 5, 6. Hay tres componentes principales necesarios para el envasado eficiente lentiviral 1, 5, 6, 7. <ol><li> El vector de expresión lentiviral que contiene algunos de los elementos genéticos requeridos para el envasado, la integración estable de la expresión viral construir en el ADN genómico, y la expresión del efector o informador. </li><li> Los plásmidos de envasado lentiviral que proporcionan las proteínas esenciales para la transcripción y el envasado de una copia de ARN de la construcción de expresión recombinantes en partículas pseudoviral. Este protocolo utiliza los plásmidos PPACK (OSE) que codifican para gag, pol, y revoluciones del genoma del VIH o la FIV y la proteína virus de la estomatitis vesicular g (VSV-G) para la proteína de la cápsida viral. </li><li> 293TN producen<html> r células (derivado de células HEK293) que expresan el antígeno T de SV40 grande, lo cual es necesario para la producción de alto título lentiviral y un gen de resistencia a neomicina, útil para volver a seleccionar las células para su mantenimiento. </li></ol> Una visión general del protocolo de producción viral puede verse en la Figura 1. Producción viral se inicia por la co-transfección de células productoras 293TN con el vector de expresión lentiviral y los plásmidos de embalaje. Las partículas virales son secretadas en los medios de comunicación. Después de 48-72 horas, los medios de cultivo celular se cosecha. Los restos celulares se retira de los medios de cultivo celular, y las partículas virales se precipitó por centrifugación con PEG-que para la concentración. Producido partículas lentiviral luego se titularon y se puede utilizar para transducir células diana. Los detalles de Titulación viral no están incluidos en este protocolo, pero se puede encontrar en: anco &quot;&gt; http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf 8. Este protocolo ha sido optimizado con los productos específicos que se indican. Otros reactivos puede ser sustituido, pero el mismo resultado no puede ser garantizada.

Lentiviral vectores de expresión son los medios más eficaces para que expresan establemente diferentes moléculas efectoras o reportero construcciones para dividir y no dividir las células de mamíferos y organismos enteros. A continuación presentamos un protocolo sobre cómo empaquetar construcciones lentivirus de expresión en las partículas pseudoviral y la transducción de las células diana utilizando las partículas pseudoviral.

Embalaje VIH o FIV basados ​​en lentivirus Construcciones de expresiones y de transducción de la VSV-G partículas virales pseudotyped

Al igual que ocurre con los vectores plasmídicos estándar, es posible transfectar lentivectores en forma de plásmido en células con una eficiencia de baja a media para obtener una expresión transitoria...

El objetivo general de este procedimiento es aprender sobre el empaquetamiento de lentivirus. Un protocolo de cinco días. El primer día, las células productoras 293TN se siembran a una densidad calculada.El segundo día, las células se transfectan con el constructo de vector lenti de elección que contiene el gen de interés y la mezcla de plásmidos de empaquetamiento viral. El cuarto día, se recolecta el sobrenadante viral y se concentra agregando la solución de precipitación viral con PEG. Los pasos finales del procedimiento consisten en recolectar el virus concentrado con PEG, alícuotar el virus e infectar células con el virus concentrado para la titulación viral.Finalmente, la PCR cuantitativa de genes integrados de forma estable se utiliza para calcular el número de constructos integrados de manera estable. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la transfección con plásmido o la transducción retroviral es que el protocolo optimizado de empaquetamiento de lentivirus de FBI produce un virus funcionalmente activo con título elevado, lo que permite una entrega eficiente en casi cualquier célula mamífera, incluidas células difíciles de transfectar como las células madre y las células primarias no divididas. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no están familiarizadas con los pequeños detalles del protocolo, que son esenciales para la producción exitosa de virus con alto título.La demostración visual de este método es útil, ya que la densidad celular visualizada mediante microscopio durante la transfección determina la eficiencia del empaquetamiento viral, lo que a su vez determina la titulación viral final. En los casos en que la expresión del reportero fluorescente aplicable determina la eficiencia de la transfección, esto tiene un impacto significativo en la titulación viral final. Además, la demostración visual de este método resulta útil para que los investigadores se familiaricen con aspectos sutiles pero importantes del protocolo, como las mejores prácticas para mantener la esterilidad durante todo el proceso, y cómo evitar incluir restos celulares en el virus recolectado.El empaquetado eficiente de lentivirus depende de tres componentes. Primero, el vector de expresión lentiviral debe contener algunos de los elementos necesarios para el empaquetado del virus y la integración estable, así como elementos para la expresión del gen de interés: interferencia por ARN en horquilla corta, ARN, microARN o un casete reportero.Segundo, los plásmidos de empaquetamiento lentivirales deben proporcionar las proteínas esenciales para empaquetar una copia de ARN del constructo de expresión en partículas pseudovirales recombinantes y para la posterior transcripción inversa e integración viral tras la infección. En tercer lugar, las células productoras 293TN deben transfectarse transitoriamente de forma conjunta con los vectores de expresión y de empaquetamiento. Estas células producen partículas pseudovirales con títulos altos que se pueden recolectar del medio de cultivo.En última instancia, la transducción exitosa de las células diana depende principalmente del número de partículas virales por célula para un tipo celular determinado. En otras palabras, la multiplicidad de infección comienza cultivando células 293TN en placas de cultivo celular de 15 centímetros durante 18 a 24 horas para obtener un 60 a 80% de confluencia.En el momento de la transfección, cada placa producirá aproximadamente 14 millones de células para aumentar el rendimiento del virus. Al día siguiente, se puede utilizar más de una placa cuando las células 293TN alcancen una confluencia del 60 al 80 %, momento en el que estarán listas para la transfección. Por cada placa de células, añada 1,6 mililitros de DMEM sin suero a un tubo cónico de 15 mililitros.Luego, agregue 22,5 microgramos de ppac H uno o Ppac F1 y 4,5 microgramos de su construcción del vector lentiviral al DMEM y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. A continuación, agregue 55 microlitros de pure affection al mismo tubo y vortexee durante 10 segundos, seguido de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, agregue un tubo a cada placa de cultivo.Agregue gota a gota y luego gire suavemente la placa, e incube las células durante 48 horas a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono tras 48 horas. Si el vector lentiviral expresa un gen fluorescente como GFP, revise las células bajo el microscopio; una transfección exitosa producirá entre el 50 y más del 90 % de células verdes fluorescentes. Ahora, recoja el sobrenadante del cultivo celular en un tubo cónico de 50 mililitros. El sobrenadante contiene partículas pseudovirales infecciosas.Cualquier célula que se desprenda de la placa no afectará negativamente la producción del virus. Para eliminar los restos celulares, centrifugar el sobrenadante viral a 1500 G durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, sin perturbar el sedimento, recoger el sobrenadante viral asegurándose de dejar un tampón de aproximadamente 500 microlitros de sobrenadante y proceder al siguiente paso, que consiste en concentrar las partículas virales 72 horas tras la transfección.Puede realizarse una segunda recogida opcional del sobrenadante viral utilizando la misma técnica después de recoger el sobrenadante viral. Concentre agregando un volumen de solución fría de precipitación viral con PEG a cada cuatro volúmenes de sobrenadante en un tubo cónico de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros. Invierta la solución para mezclarla. Nunca utilice un vórtex; luego, almacene la solución sin agitación a cuatro grados Celsius durante un máximo de 96 horas. Tras un mínimo de 12 horas de refrigeración, centrifugue la mezcla a 1500 G durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Tras la centrifugación, las partículas lentivirales precipitadas con PEGgo aparecerán como un sedimento beige o blanco en el fondo del tubo.Ahora, elimine todas las trazas de líquido mediante aspiración cuidadosa sin perturbar las partículas lentivirales precipitadas en el sedimento. Alternativamente, retire la mayor parte del sobrenadante y resuspenda el sedimento en el sobrenadante restante. Luego, transfiera la suspensión a un tubo eppendorf estéril de dos mililitros y centrifugue el tubo en una microcentrífuga fría durante dos minutos.A 14.000 RPM, retire con pipeta el sobrenadante restante y resuspenda el pellet de partículas lentivirales en hielo, en un tampón estéril y frío, entre un décimo y un centésimo del volumen original. Pipete cuidadosamente el pellet hacia la solución sin crear burbujas, manteniéndolo frío en todo momento. Asegúrese de que el pellet se resuspenda completamente.Por último, prepare alícuotas de 15 a 25 microlitros de tinta en viales criogénicos estériles sobre hielo y almacene los viales a menos 70 grados Celsius. Un proceso de empaquetamiento exitoso producirá de 10 millones a 1000 millones de UIF por mililitro para la transducción viral en una placa de cultivo de 24 pocillos, con 50.000 células por pocillo, y cultívelas durante la noche en sus condiciones de cultivo especificadas. Las células deben tener una confluencia entre el 50 y el 70 % para la transducción con fines de titulación.Las células HT 10 80 pueden utilizarse como una línea celular control fácil de transducir; al día siguiente, aspire el medio de las células. Luego combine el medio de cultivo con la solución concentrada de transductores. De modo que la concentración final de transductores sea 1x, añada medio mililitro de la solución transducida a cada pocillo con células diana a la densidad adecuada de 50 a 70 % de confluencia. Añada el virus a cada pocillo en las siguientes diluciones: 1:100, 1:10 y dilución directa 1:1.El virus puede permanecer en contacto con las células diana hasta 72 horas sin cambiar el medio. Después de 72 horas, el provirus se habrá integrado establemente en el genoma del huésped y estará expresando el gen de interés. Si hay expresión de un marcador fluorescente, esta puede utilizarse para estimar la eficiencia de transducción con diferentes diluciones del virus, y luego el número de unidades infecciosas puede cuantificarse mediante QPCR.Una vez conocido el título del virus, calcule el volumen apropiado de virus para alcanzar la multiplicidad de infección deseada en otras células diana. La medición del título y el control de la MOI garantizan la consistencia entre experimentos y diferentes preparaciones virales. El virus ya está listo para su uso en experimentos adicionales.La densidad inicial de las células 2 9 3 TN fue fundamental para un empaquetamiento viral exitoso el día de la transfección. Estas células 2 9 3 TN presentaban un grado de confluencia entre el 60 y el 80 %. Veinticuatro horas después de una transfección exitosa con un vector lentiviral que expresa GFP, se observó que al menos el 90 % de las células 2 9 3 TN mostraban fluorescencia verde.72 horas posteriores a la transducción, GFP continuó expresándose en las células huésped HT 10 80. Esto indica que el constructo lentiviral se integró establemente en el genoma del huésped; transducir las mismas células huésped en una dilución diez veces menor disminuyó proporcionalmente la expresión de GFP. Debido a que la relación entre el título vírico y la expresión génica mediada por lentivirus es directamente proporcional.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un período de cinco días, con una dedicación aproximada de una a dos horas por día, si se lleva a cabo correctamente. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo empaquetar partículas virales infecciosas de forma eficiente y segura, y transducir células con éxito mediante el virus. No olvide que trabajar con lentivirus puede ser peligroso y que es necesario tomar precauciones, como trabajar en una cabina de cultivo celular de nivel de seguridad biológica dos (BSL-2).Siempre se debe usar bata de laboratorio y guantes al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Para que los lentivirus, los vectores de ADN se transfectadas en células humanas 293. Después de la cosecha y la concentración del sobrenadante, título del virus se determina mediante la expresión de fluorescencia con un citómetro de flujo.

Lentivirus de producción

Hemos desarrollado un vector lentiviral que posee, además de la LTR-Tat respuesta, el elemento de respuesta Rev (RRE) que pueden regular la expresión del gen de una forma del VIH-1 Tat y Rev-dependiente. El vector permite la detección específica de la replicación del VIH en las células vivas a través de la expresión de GFP.

Marcado específico del VIH-1 células positivas utilizando un vector lentiviral Ap-dependientes que expresan la proteína verde fluorescente

Los lentivirus son una valiosa herramienta de investigación para explorar la función del gen, sin embargo, los investigadores desean evitar la producción de la codificación de lentivirus pantropic conocidos o sospechosos oncogenes. Como alternativa, se presenta un protocolo más seguro para el uso de lentivirus ecotropic en las células humanas modificadas para expresar el receptor mSlc7a1 ecotropic.

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Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

Aquí, nosotros usamos la transducción retroviral y transfección concatemeric para crear una línea de células que pueden expresar las componentes de un vector lentiviral (VI) en ausencia de tetraciclina. Esta LV codifica GFP y se pseudotyped con una glicoproteína, SVGmu, que es específico para un receptor en las células dendríticas.

Una línea celular regulada por tetraciclina Produce lentiviral vectores de alta titulación que se dirigen específicamente a las células dendríticas

A continuación, se presenta un protocolo para la síntesis de partículas similares a virus, ya sea utilizando baculovirus o sistemas de expresión de mamíferos, y la purificación ultracentrifugación. Este enfoque altamente adaptable se usa para identificar antígenos virales como objetivos de vacunas de una manera segura y flexible.

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Un método de transposición eficiente In Vitro por un sistema de belleza durmiente transcripcionalmente regulada en un Vector lentivirales defectuosa integración

A ADN epigenoma edición representa un potente enfoque terapéutico. Este protocolo describe la producción, purificación y concentración de vectores lentivirales all-in-one que el transgén CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicaciones de edición de epigenoma en células pluripotentes inducidas humanas (hiPSC)-derivado de las neuronas.

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Preparación de vectores lentivirales para la modulación eficiente de genes y microARN de macrófagos residentes en el tejido de la cavidad peritoneal in vivo en ratones

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Embalaje VIH o FIV basados ​​en lentivirus Construcciones de expresiones y de transducción de la VSV-G partículas virales pseudotyped (Video) | JoVE Journal

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