Inyección viral estereotáxica para la edición de genes neuronales dirigidos en el cerebro del ratón

Asegure un ratón anestesiado en un marco estereotáxico.

Desinfecte el cuero cabelludo afeitado, luego haga una incisión en la línea media para exponer el cráneo.

Seque el cráneo y aplique peróxido de hidrógeno para mejorar la visibilidad del bregma.

Localice bregma y lambda, luego identifique los sitios de destino.

Perfora con cuidado el cráneo en los sitios objetivo.

Conecte la jeringa llena de virus al instrumento estereotáxico.

El virus codifica Cas9 y un ARN de guía única para la edición del genoma en neuronas de circunvolución dentada, junto con un reportero fluorescente para etiquetar las neuronas infectadas.

Baje la jeringa para llegar a la circunvolución dentada, luego inyecte el virus lentamente para asegurar una distribución uniforme.

Levante gradualmente la jeringa y repita la inyección en coordenadas adicionales.

Haga una breve pausa para evitar el reflujo, luego retire la aguja lentamente.

Repita el procedimiento en el hemisferio opuesto.

Finalmente, sutura la incisión.

El modelo ahora está listo para más estudios.

Afeitar la cabeza de un ratón anestesiado para prepararse para el lugar de la inyección. Dirigir el isoflurano al 4% en el cono de la nariz. A continuación, coloque el mouse en el instrumento estereotáxico. Inserte la barra de mordida en su boca hasta que sus dientes caigan en la ranura antes de asegurar las barras para los oídos.

Asegúrese de que el cuerpo del animal esté sobre la almohadilla térmica y que la nariz esté situada en el cono de la nariz. A continuación, confirme la anestesia dando un pellizco en el pie. Luego, aplique lágrimas artificiales para lubricar los ojos. Posteriormente, frote la cabeza afeitada con povidona yodada y lidocaína.

Ahora, haga una pequeña incisión a lo largo de la línea media del cuero cabelludo. Seque el cráneo con un hisopo y aplique peróxido de hidrógeno para ayudar a visualizar el bregma. Con un visor de disección, ubique el bregma en el cráneo y coloque la broca encima. Establezca las coordenadas estereotácticas digitales de los planos x, y y z en 0.

Para asegurarse de que la cabeza esté nivelada en el eje y caudal rostral, coloque la broca en lambda y nivele la cabeza de modo que la coordenada z sea aproximadamente igual a 0 en bregma y lambda. Para asegurarse de que la cabeza esté nivelada a lo largo del eje x, coloque la broca en el punto medio entre bregma y lambda y mida las coordenadas z a 1 milímetro del punto medio en ambos lados para asegurarse de que sean iguales.

A continuación, baje el isoflurano al 2% antes de colocar el taladro sobre las coordenadas deseadas y taladre el cráneo con cuidado. Después de perforar todos los agujeros, coloque la jeringa llena de virus en el instrumento estereotáxico. Centre la jeringa sobre el orificio y establezca la coordenada z en el cráneo en 0. Baje lentamente la jeringa a la profundidad z más profunda y comience la inyección a una velocidad de 0,25 microlitros por minuto con un inyector estereotáxico.

Una vez completada la inyección en la profundidad z más profunda, espere un minuto antes de elevarla a la siguiente coordenada y comience la inyección nuevamente. Continúe este patrón hasta que se inyecten todas las coordenadas de inyección z. Después de la última inyección, espere dos minutos antes de retirar la jeringa. Luego, retire el ratón del instrumento estereotáxico y sutura el cuero cabelludo. Aplique lidocaína y crema antibacteriana en el sitio quirúrgico y administre analgésicos antes de transferir al animal a una cámara de recuperación con calefacción.