Name: Con un enfoque comparativo de especies para la Investigación de Neurobiología de las respuestas Paternal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprenda un enfoque comparativo de especies para investigar la neurobiología del comportamiento paternal en roedores Peromyscus. Este método identifica correlatos conductuales y neuroquímicos usando diferencias naturales entre especies.

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Esta investigación fue financiada por la beca no. 0723341 (a KGL) de la Fundación Nacional de Ciencias. También estamos agradecidos por las contribuciones aportadas por el Programa de Becas de Pregrado Schapiro Investigación y el Departamento de Psicología de Randolph-Macon College. Finalmente, agradecemos las contribuciones de colaboración Craig Kinsley en esta investigación y ayudar a Amanda Rzucidlo en la preparación del laboratorio de I-MC para este artículo de vídeo.

1. Identificación del modelo animal <ol><li> El ratón ciervo California (Peromyscus californicus) es un modelo ideal para explorar las respuestas paternas. Como puede ver, este ratón novios a los cachorros al igual que las mamás hacer - incluso agacharse sobre ellos para que se vea como los cachorros son de enfermería. El comportamiento de los ratones en comparación con California es una especie del mismo género, el ratón ciervo común (Peromyscus maniculatus) que muestra poco interés en los cachorros, a menudo tratando de escapar o incluso atacarlas. (Ver Figura 1 para las fotos de estas especies que interactúan con los cachorros.) </li><li> Una vez que el modelo de las especies ha sido identificado entonces los distintos grupos deben ser establecidos. En este estudio, los padres biológicos, vírgenes sin experiencia en crianza de los hijos, y las vírgenes con una exposición limitada cachorro (cachorros expuestos o padres de crianza) de ambas especies se utilizan de modo que las características paternas tanto predispuesto y adquiridas pueden ser evaluados. En este estudio en particular que también están expuestos todos los grupos a un ratón de juguete cachorro para asegurar que las interacciones sociales son específicas de un cachorro y no una respuesta a la representante de cualquier cosa puesta en la jaula (ver Figura 2). </li><li> Antes de investigar los factores neurobiológicos, es importante para confirmar que las especies seleccionadas presentan claras diferencias en la conducta de interés. En este estudio, los hombres se colocan en una jaula con un cachorro de cinco minutos y un etograma conducta paterna (véase el cuadro 1, por ejemplo, de etograma) se utiliza para las conductas puntuación como la latencia de acercarse a la cría y la cantidad de tiempo pasado en contacto con el cachorro. Si se observan las respuestas agresivas, el cachorro se elimina inmediatamente. Estas sesiones suelen ser grabadas en vídeo por lo que un cuidadoso análisis de comportamiento puede ser llevado a cabo posteriormente. </li></ol> 2. Preparación de tejido cerebral <ol><li> Después de una perfusión normal de los ratones (protocolo adjunto), el cerebro se eliminan de manera que se puede seccionar en el área específica de interés (del cerebro muestran). </li><li> Un estándar de cerebro de ratón atlas (atlas muestra) se utiliza para localizar el núcleo paraventricular en el hipotálamo, un área conocida por ser rica en células que producen el neuropéptido de interés en este estudio - la vasopresina (AVP). </li><li> El cerebro es entonces bloqueada y se monta en un mandril de congelación para que el tejido se congela antes de ser seccionada con el microtomo. El cerebro está seccionado en un modo de recortar hasta puntos de referencia específicos se identifican, entonces el espesor específicas del cerebro y de 30 micrones, en este caso, se establece para las secciones de cerebro que se utilizan para el análisis. </li><li> Las secciones del cerebro son cuidadosamente colocadas en placas llenas de tampón fosfato salino (PBS); (protocolo de PBS adjunta, por favor, tenga en cuenta que esto es sólo un ejemplo de un protocolo de inmunocitoquímica estándar). </li></ol> 3. Inmunocitoquímica <ol><li> A lo largo de las distintas etapas de este proceso (véase el protocolo adjunto), es importante tener conocimientos precisos de pipeteo para asegurar mediciones precisas de los productos químicos y otros ingredientes importantes de esta técnica (pipeteado muestran los alumnos). </li><li> El primer paso en este proceso es el lavado de los cerebros que implica la sustitución de la PBS en los pocillos tres a cinco veces, entre cada lavado los platos y se colocan en un agitador durante 10 minutos (mostrar estudiante reemplazar PBS y la colocación de placas de rockeros) . </li><li> Los cortes de cerebro se exponen a la solución de anticuerpo primario y se almacenan a 4 ° C durante la noche en la mecedora (proceso de show). </li><li> Después de otro lavado, las rodajas de cerebro están expuestos a un anticuerpo secundario durante una hora en el agitador a temperatura ambiente, luego se lava de nuevo. </li><li> A continuación, el cerebro está expuesto a una solución compleja Avitin-biotina para prepararse para la visualización de las células neuroquímicos-positivo. </li><li> Para la etapa de visualización final, el cerebro está expuesto a DAB. Este es un producto peligroso y siempre debe ser manejado con precaución. Como se ve aquí, las rodajas de cerebro comienzan a llegar más oscuro ante sus ojos (mostrar el proceso). </li><li> Tras la exposición de DAB, el cerebro de pasar por la última serie de lavados y luego se colocan cuidadosamente en el microscopio subbed y se deja secar durante la noche (muestran la colocación de una porción del cerebro en un portaobjetos, ver archivo adjunto para el protocolo de diapositivas subbed). </li><li> Los portaobjetos se aclaró a través de una serie de lavados de agua destilada y alcohol, finalmente quedar sumergido en Citrosolv antes de ser cubreobjetos y se almacena en un Slidebox para su custodia (mostrar los distintos aspectos de este proceso, véase el documento adjunto para el proceso de compensación). </li></ol> 4. Neuroquantification <ol><li> Después de las diapositivas se han secado, pueden ser evaluados con un software especializado neuroquantification. Aquí Bioquant software se utiliza para cuantificar las células vasopresina-positivas y las fibras en el núcleo paraventricular del cerebro del ratón (mostrará el software en la pantalla ... y el microscopio). </li><li> El área específica de interés se identifica con las opciones de medicióndel software para establecer el campo visual para neuroquantification. Es importante que un tamaño uniforme del campo visual se cuantifica para cada animal (los estudiantes muestran cómo hacer esto). </li><li> Aquí la oscura manchada vasopresina-inmunorreactiva cuerpos de las células y las fibras son evidentes. Debido a que es difícil contar o rastrear este tejido, una característica especial de este software utiliza la luz de umbral para determinar la cantidad total de tejido con tinción positiva en el área específica de interés. Este umbral nos dice qué parte de la zona especificada contiene vasopresina tejido positivo (muestra el valor de los datos en la pantalla del ordenador). </li></ol> 5. Análisis del comportamiento <ol><li> Si más de un observador será anotar los videos, es importante para establecer confiabilidad entre los evaluadores para asegurar que los observadores están marcando el comportamiento de una manera consistente. Para la sesión de puntuación actual, una hoja de scoring de comportamiento debe estar preparado para permitir la fácil puntuación de la conducta durante las sesiones de observación (véase el cuadro 2, por ejemplo, la puntuación de hoja de cálculo). </li><li> Por conductas que no son rápidos respuestas episódica, un análisis de microsecuenciación puede revelar las sutilezas de la progresión de las respuestas específicas. Por ejemplo, el aseo comportamiento consiste en una cadena de respuestas muy rápidas. Aunque es una opción para grabar sólo la presencia y duración de la preparación, otro es el de documentar la cadena de acontecimientos que acompaña a esta respuesta. El uso de este software microsecuenciación, los observadores de puntuación de la presencia de un comportamiento particular en cada segundo, como lo solicite el software (software de demostración y de vídeo). </li><li> Tras la recogida de datos, los parámetros de interés se determinan y los resultados del comportamiento apropiado analizados. Ejemplos pueden ser la duración total del tiempo pasado en contacto con el cachorro, o el número de interrupciones en la secuencia de preparación (mostrar ordenador con hoja de cálculo con los datos introducidos por cada animal). </li><li> Una vez que la conducta se califica, es importante para confirmar que las dos especies exhiben diferentes estrategias de respuesta para la conducta de interés en el estudio. En este caso los ratones ciervo de California deben mostrar un comportamiento más paternal que los ratones ciervo común. Además, varias medidas del comportamiento pueden ser correlacionadas con las medidas del cerebro para obtener una visión más informada de las influencias relevantes. </li></ol> 6. Los resultados representativos: <ol><li> Para validar el modelo, los datos deben indicar claramente que las dos especies realiza de forma diferente con respecto a la conducta de interés. Aquí se ve que el P. hombres californicus pasado más tiempo de aseo y en cuclillas sobre los cachorros, dos señas de identidad de las respuestas paternas (ver Figura 4). </li><li> Con el fin de determinar si la variable de interés neurobiologial es importante en las respuestas paternas, la cantidad de vasopresina (AVP), tejido positivo se cuantificó por varias áreas cerebrales relevantes, como puede verse, el paternal P. animales californicus había tejido más inmunes positivos en varias de estas áreas del cerebro. (Ver Figura 5). </li><li> En un estudio relacionado con el análisis de microsecuenciación, se planteó la hipótesis de que los ratones paterna California se muestran menos ansiedad que sus homólogos de la Virgen, en consecuencia, cuando se expone al olor de un depredador, los padres mostraron menos interrupciones en la secuencia de preparación de los animales vírgenes (véase la Figura 6). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: (A) Hombre de California ratones con respuesta paterna hacia la misma especie alienígena cachorro. (B) ratón ciervo macho mostrando una actitud prudente (tramo de asistir) y la respuesta de evitación de la presencia de un extranjero cachorro misma especie. Nota: En estas evaluaciones la interacción social, si un varón presenta las respuestas agresivas hacia el cachorro, los experimentadores de inmediato golpeó la parte superior de la jaula para distraer a los hombres. En este momento se termina la sesión y el cachorro se retira, inspeccionada por cualquier herida y regresó a la madre. En nuestro laboratorio, esto rara vez se observa con P. californicus, pero los hombres se observa ocasionalmente con P. maniculatus, observación e intervención inmediata, sin embargo, evitar que se produzcan daños a los animales. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Un ratón California interactuar con un ratón de juguete, la mayoría trató de masticar estos estímulos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: El diseño experimental del estudio, había alrededor de 6 animales en cada grupo para cada especie. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: Gráfico del proceso de inmunocitoquímica. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> HigoUre 5 respuestas Paternal en el California y los ratones ciervo;. respuestas más paternal (el novio, agacharse, más rápido de aproximación) se observaron en los ratones California. Más tramo asiste (respuesta al estrés) se observaron en los ratones de los ciervos. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Inmunorreactividad vasopresina en distintas áreas cerebrales de ambas especies. Los ratones de California había más manchas en las células y las fibras de PVN. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7: Paternal ratones California mostraron menos interrupciones en sus secuencias de limpieza en la presencia de olor de un depredador que los grupos de títeres expuestos y virgen.

<ol><li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li>
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<li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este artículo analiza tres componentes esenciales piensa que son críticos para la ejecución exitosa de las investigaciones del comportamiento neurociencia: (1) un modelo animal representativos y válidos, (2) un protocolo de inmunocitoquímica precisos y sensibles, y (3) la mayoría de los análisis (observación y estadística ) tanto de los datos sobre el comportamiento y el cerebro. Errores en una sola categoría con toda seguridad, comprometer los resultados de todo el estudio. Por lo tanto, después de una cuidadosa selección del modelo animal adecuado, un considerable esfuerzo debe dirigirse a la prueba piloto de los procedimientos conductuales e histológicos para asegurar que el comportamiento será fiable observados en el estudio, seguido por el tratamiento con éxito de los cerebros. Como se mencionó anteriormente, el uso de especies comparativo para identificar los mecanismos neurobiológicos de una respuesta particular es un enfoque metodológico valioso porque esta técnica no requiere de la ingeniería genética o dolorosas manipulaciones quirúrgicas. Por lo tanto, este enfoque metodológico utiliza menos amenazados, los animales intactos. El uso de las variaciones naturales de los animales, sin embargo, se ve reforzado por la incorporación de los recursos naturales-como los entornos, incluso si los animales se encuentran en el laboratorio. Además, si los estudios de laboratorio se puede extender al campo para validar la autenticidad de las diferencias entre especies en la conducta de interés, el siguiente paso es recomendable. Aunque el enfoque comparativo ofrece muchas ventajas, una limitación es el carácter correlativo de los datos y, en consecuencia, las técnicas adicionales, tales como las manipulaciones farmacológicas deben ser utilizados para validar aún más la función de objetivo sistemas neurobiológicos de la conducta de interés. Una vez que los experimentadores tener confianza en los procedimientos conductuales, histológicos y estadísticos, se debe tener cuidado para que las condiciones de vida de los animales se mantienen constantes para todos los grupos excepto, por supuesto, para la manipulación experimental. Cambios en variables tales como los horarios de luz, los niveles de ruido, los cuidadores, los niveles de humedad y los olores en el laboratorio podría tener efectos significativos en las respuestas de los animales neurobiológica. En este artículo, el anticuerpo primario se utilizó para la detección de la vasopresina, pero otros anticuerpos primarios se pueden utilizar para una gran cantidad de neurotransmisores diferentes de interés. Si el experimentador está trabajando con un nuevo anticuerpo, es importante llevar a cabo estudios de valoración para determinar la dilución óptima del anticuerpo nuevo. Muchas veces los anticuerpos se utiliza demasiado (según lo sugerido por el fabricante), lo que resulta en el tejido que está demasiado oscuro para distinguir la señal, además, el uso excesivo de los anticuerpos es muy caro. Por último, si hay más de un análisis estadístico solo se puede utilizar para proporcionar puntos de vista alternativos y las interpretaciones de los datos, que deben ser utilizados. En este estudio en particular, los modelos lineales generales, correlación y análisis de escalamiento multidimensional se utiliza para proporcionar los puntos de vista más informativo de los datos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Microscopio compuesto binocular </td><td> Motic </td><td> BA400 </td><td></td></tr><tr><td> La vida Bioquant Software Ciencia </td><td> Imagen Bioquant Analysis Corporation </td><td> Versión 8.40.20 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Microm </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflex consola Easy Drive de carga L / S (bomba de perfusión) </td><td> Cole-Parmer Instrumento Empresa </td><td> 7518-00 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Celular Bueno Grupo Cultura (cultivo de tejidos tratados, apirógena poliestireno, estéril) </td><td> Corning Costar </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> Diapositivas 25x75x1mm microscopio </td><td> Globo de la Ciencia, Inc. </td><td> 1324W </td><td></td></tr><tr><td> 22x50mm No.1 cubreobjetos </td><td> Globo de la Ciencia, Inc. </td><td> 1414-1410 </td><td></td></tr><tr><td> No estéril 3 ml Graduado grandes pipetas de transferencia Bombilla </td><td> Microscopía electrónica de Ciencias </td><td> 70962-9 </td><td> &amp;nbps; </td></tr><tr><td> Alconox detergente en polvo </td><td> Alconox </td><td> 1104 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9888-1kg </td><td> CAS 7647-14-5 </td></tr><tr><td> Fosfato de sodio monobásico </td><td> Espectro </td><td> SO130 </td><td> CAS 10049-21-5 </td></tr><tr><td> Fosfato sódico dibásico dihidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 30412 </td><td> CAS 10028-24-7 </td></tr><tr><td> Triton X </td><td> Espectro </td><td> TR135 </td><td> CAS 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Permount </td><td> Pescador </td><td> SP15-500 </td><td> CAS 108-88-3 </td></tr><tr><td> El cromo sulfato de potasio </td><td> Sigma </td><td> C-5926 </td><td> CAS 7788-99-0 </td></tr><tr><td> CitriSolv </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-143975 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol, Botellas Den.Poly alta, 200 pruebas, 24 x 1 litro </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200CSPP </td><td></td></tr><tr><td> Suero normal de cabra </td><td> Vector </td><td> S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Conejo contra la vasopresina analito reactivos específicos </td><td> Immunostar, Inc. </td><td> 20069 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinilado anti-conejo IgG (H + L) purificado por afinidad </td><td> Vector </td><td> BA-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Elite estándar Vectastain ABC Kit </td><td> Vector </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> Peroxidasa DAB sustrato Kit </td><td> Vector </td><td> SK-4100 </td><td></td></tr><tr><td> Original de gelatina sin sabor (4-contar sobres) 1-oz caja </td><td> Knox </td><td></td><td> Compra en la tienda de comestibles </td></tr><tr><td> 3% de peróxido de hidrógeno </td><td> CareOne </td><td></td><td> Compra en farmacia local </td></tr><tr><td> Blanqueador </td><td> Clorox </td><td></td><td> Compra en la tienda de comestibles </td></tr></tbody></table>

con un enfoque comparativo de especies para la investigación de neurobiología de las respuestas paternal

Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

Uno de los objetivos de la neurociencia del comportamiento es identificar los factores neurobiológicos subyacentes que regulan los comportamientos específicos. El uso de modelos animales para lograr este objetivo, muchas de las estrategias metodológicas requieren técnicas invasivas para manipular la intensidad de la conducta de interés (por ejemplo, los métodos de la lesión, las manipulaciones farmacológicas, técnicas de microdiálisis, por ingeniería genética, modelos animales). La utilización de un enfoque comparativo de las especies permite a los investigadores para aprovechar de forma natural las diferencias en las estrategias de respuesta que existen en especies estrechamente relacionadas. En nuestro laboratorio, se utilizan dos especies del género Peromyscus que difieren en las respuestas paternas. El macho del ratón California ciervos (Peromyscus californicus) presenta las mismas respuestas los padres como de la hembra, mientras que su primo, el ratón ciervo común (Peromyscus maniculatus) presenta prácticamente ninguna respuesta crianza / padres en la presencia de las crías. De especial interés en este artículo es una exploración de los factores neurobiológicos asociados a las respuestas de afiliación social, exhibidas por el ratón venado paterna California. Debido a que el comportamiento enfoque de la neurociencia es multifacético, los siguientes componentes clave del estudio va a tratar brevemente: la identificación de especies apropiadas para este tipo de investigación, recopilación de datos para el análisis del comportamiento, la preparación y la sección del cerebro, los pasos básicos que intervienen en inmunocitoquímica para la cuantificación de la vasopresina-inmunoreactividad, el uso de la neuroimagen software para cuantificar el tejido cerebral, el uso de un análisis de vídeo microsecuenciación de puntuación de la conducta y, por último, los análisis estadísticos adecuados para proporcionar las interpretaciones más informado de los resultados de la investigación.

El enfoque comparativo permite neurocientíficos especie de comportamiento para explorar diversos factores neurobiológicos asociados con comportamientos específicos vistos como característica de un modelo animal específico. Aprovechando naturales diferencias de comportamiento entre especies estrechamente relacionadas, esta técnica no requiere técnicas invasivas para manipular la expresión de la conducta.

Con un enfoque comparativo de especies para la Investigación de Neurobiología de las respuestas Paternal

Un objetivo de la neurociencia conductual es identificar los factores neurobiológicos subyacentes que regulan comportamientos específicos. Mediante el uso de modelos animales para lograr...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar un enfoque comparativo entre especies. Para obtener más información sobre las áreas cerebrales y los neuroquímicos asociados con el comportamiento paternal, el primer paso consiste en identificar dos especies estrechamente relacionadas que difieran significativamente en la expresión del comportamiento de interés. A continuación, se permite que ambas especies interactúen con las crías y se observa su comportamiento dentro de la respuesta parental.Ecograma etológico. Estos comportamientos se graban en video para su posterior análisis. El siguiente paso del procedimiento consiste en recolectar muestras cerebrales y analizarlas para detectar la presencia de tejido inmunorreactivo a vasopresina en la zona objetivo.El software de neuroimagen se utiliza entonces para determinar diferencias específicas entre especies en áreas cerebrales específicas. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren diferencias relacionadas con la especie en las respuestas paternales y en la inmunorreactividad a la vasopresina en áreas cerebrales específicas. La ventaja principal de utilizar el enfoque comparativo entre especies, en contraposición con otros métodos existentes, como especies manipuladas farmacológicamente o especies modificadas genéticamente, es que permite aprovechar las diferencias que ocurren naturalmente entre especies estrechamente relacionadas, en lugar de recurrir a comportamientos inducidos artificialmente.Aunque este método puede proporcionar información sobre los comportamientos paternos, también puede aplicarse a otros comportamientos, como la agresión, el comportamiento sexual o el aseo. Antes de la prueba, los ratones de dos especies estrechamente relacionadas se separan en grupos experimentales de padres biológicos, vírgenes sin experiencia parental y vírgenes con exposición limitada a crías.Primero, prepare la jaula y el sistema de grabación de video. A continuación, coloque un cachorro en el centro de la jaula. Una vez que todo esté preparado, introduzca el macho de prueba en la jaula con el cachorro y registre el comportamiento durante cinco minutos.Si se observan respuestas agresivas, retire inmediatamente a la cría. El ratón de venado de California asea a las crías tal como lo hacen las madres, agachándose sobre ellas de modo que parece que las crías están amamantando. En contraste, el ratón de venado común muestra poco interés en las crías y con frecuencia intenta escapar o atacarlas.Todos los grupos también se exponen a un ratón de juguete para asegurar que las interacciones sociales observadas sean específicas hacia una cría y no una respuesta general. Después del período de observación, prepare las hojas de puntuación del comportamiento. Si más de un observador va a puntuar las videocintas.Es importante establecer la fiabilidad entre observadores. El programa de comportamiento paterno que se muestra aquí se utiliza para puntuar los comportamientos. Ejemplos incluyen agacharse sobre las crías, asear a las crías o exhibir comportamientos de ansiedad, como las respuestas de estiramiento atento.El software de microsecuenciación puede utilizarse para revelar las sutilezas entre ciertos comportamientos. Aquí, se utiliza como ejemplo datos de ratones cacus expuestos a un olor de depredador. Primero, combine el comportamiento en estados binarios, es decir, aseo frente a no aseo, y luego genere una serie temporal.Finalmente, calcule el grado de fluctuación. Mediante una fórmula predeterminada, muchos comportamientos importantes pueden pasarse por alto. Utilizando técnicas comunes de observación, lo mejor es grabar en video los comportamientos para poder ver las respuestas a cámara lenta.Para una visualización más precisa, un software especializado permite a los investigadores analizar microsecuencias de comportamientos, proporcionando datos que pasarían desapercibidos con una observación humana en tiempo real. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia del comportamiento, como qué sistemas neuroquímicos median los comportamientos específicos observados en los animales tras la exposición a las crías. Utilice un protocolo estándar de perfusión para aislar el cerebro y congélelo antes de seccionarlo, cortando el cerebro en modo de recorte hasta identificar puntos de referencia específicos.Se utiliza un atlas estándar del cerebro de ratón para localizar el núcleo paraventricular en el hipotálamo, una zona conocida por ser rica en células que producen el neuropéptido vasopresina o VP. Una vez alcanzado el par de núcleos paraventriculares, tome secciones de 30 micrones para su posterior análisis. Coloque cuidadosamente las secciones cerebrales en placas con pocillos llenos de solución salina tamponada con fosfato o PBS. Lave las secciones cerebrales con PBS de tres a cinco veces, colocando las placas sobre un agitador durante 10 minutos tras la adición de PBS fresco.A continuación, agregue una solución que contenga la solución de anticuerpo primario a las placas y almacénelas a cuatro grados Celsius durante la noche con agitación al día siguiente. Lave las secciones antes de agregar el anticuerpo secundario. Deje que las muestras agiten durante una hora a temperatura ambiente. Después de un lavado final, exponga las secciones cerebrales a una solución compleja de biotina Aden, que ayuda en la visualización de las células positivas neuroquímicas.El último paso en el procedimiento de visualización consiste en agregar cuidadosamente DAB tras la exposición a DAB. Somete las secciones cerebrales a una última serie de lavados. Colócalas cuidadosamente sobre portaobjetos tratados y déjalas secar durante la noche.Una vez secos, limpie los portaobjetos mediante una serie de lavados con agua destilada y alcohol; después del lavado, sumerja la sección en citrus solve. Finalmente, coloque cubreobjetos y guarde los portaobjetos en una caja para su conservación. Existen muchos métodos para el proceso de inmunoquímica.La clave del éxito consiste en crear y seguir un protocolo claro. Ahora las láminas están listas para ser analizadas utilizando un software especializado de neurocuantificación. Aquí, se utiliza el software BioQuant para cuantificar las células y fibras positivas para vasopresina en el núcleo paraventricular de los cerebros de ratón.Utilice la opción de medición para identificar el área específica de interés y establecer el campo visual para la cuantificación neurológica. Aquí, los cuerpos celulares y fibras inmunorreactivos, que son intensamente teñidos como supresores de VA, son evidentes. Utilice la función de umbral de claridad del software para determinar la cantidad total de tejido positivamente teñido dentro de un área específica.Este umbral nos indica la cantidad de tejido positivo para vasopresina presente. Como se observa aquí, los machos de Californicus pasaron más tiempo acicalándose y agachándose sobre las crías, dos características distintivas de las respuestas paternas en comparación con una especie similar. El análisis de microsecuenciación revela que los ratones paternales de California presentan menos interrupciones en su secuencia de acicalado en comparación con los animales vírgenes.Cuando se expusieron a olores de depredadores para determinar si las variables neurobiológicas son importantes en las respuestas paternas, se cuantificó la cantidad de tejido positivo para vasopresina en varias áreas cerebrales relevantes. Como se observa aquí, los animales paternos de la especie californicus presentan mayor cantidad de tejido inmunopositivo en varias de estas áreas cerebrales. En conclusión, el enfoque comparativo entre especies permite identificar sistemas neurobiológicos clave asociados con un comportamiento de interés determinado.Sin embargo, la naturaleza de los datos es correlacional, por lo que es importante añadir técnicas metodológicas adicionales para confirmar aún más el papel del sistema neurobiológico y el comportamiento de interés.

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