Microscopía fluorescente sin lentes en un chip

El objetivo general de este procedimiento es demostrar una plataforma de microscopía fluorescente sin lente en chip para obtener imágenes de objetos fluorescentes en un campo de visión ultra amplio. Para lograr esto, un filtro de absorción delgado y una placa frontal de fibra óptica se colocan suavemente sobre una matriz de sensores optoeléctricos, o musgo CCDC, y luego se coloca un chip microfluídico en la parte superior de la placa frontal. A continuación, se ensambla un prisma con el microchip mediante el uso de aceite de coincidencia de índices.

La citación fluorescente se logra a través de la faceta lateral de un prisma romboidal y la iluminación holográfica se realiza a través de la faceta superior del mismo prisma. En última instancia, se pueden obtener imágenes microscópicas de alta resolución a partir de las imágenes fluorescentes adquiridas mediante la decodificación de las imágenes en bruto a través de algoritmos digitales. Si es necesario, los objetos fluorescentes decodificados se pueden contar automáticamente utilizando una interfaz desarrollada a medida.

Lente en chip. La imagen en general tiene como objetivo reemplazar los voluminosos microscopios ópticos basados en lentes con diseños más simples y compactos. Esta plataforma tecnológica emergente tiene el potencial de eliminar la necesidad de componentes voluminosos y costosos a través de la ayuda de teorías novedosas y los algoritmos de reconstrucción digital.

La lista de lentes en la plataforma de imágenes en chip comprende varios componentes ópticos, incluido un conjunto de sensores digitales, una fuente de iluminación incoherente, un prisma, un filtro de absorción y una placa frontal de fibra óptica o un cono de fibra óptica. En esta plataforma, se pueden utilizar diferentes tipos de matrices de sensores para la detección de la señal fluorescente de los microobjetos objetivo. Para los fines de este video, se utilizará un dispositivo de carga acoplada, se usa una fuente de luz incoherente, como un diodo emisor de luz simple para la excitación de fluorescencia.

Se utilizan dos métodos diferentes de filtrado de excitación en paralelo para crear el fondo de campo oscuro requerido, como se muestra en este diagrama. En primer lugar, se utiliza un prisma de vidrio o una semiesfera de vidrio para crear una reflexión interna total o TIR en la superficie inferior del chip microfluídico que alberga las muestras de interés. Paralelamente a esto, se utiliza un filtro de absorción económico para eliminar las luces de excitación dispersas semanales que no obedecen al proceso TIR.

Tras el rechazo exitoso de la excitación utilizando estos dos mecanismos, solo se adquiere la emisión fluorescente de las muestras en el plano del detector. A pesar de una apertura numérica de detección tan grande, los puntos fluorescentes en bruto en el conjunto de sensores se vuelven bastante amplios para diseñar y controlar mejor la propagación espacial de esta señal fluorescente. Se colocará una placa frontal de fibra óptica entre el objeto y los planos del sensor como alternativa a una placa frontal normal.

Una placa frontal de fibra óptica cónica, que tiene una densidad significativamente mayor de cables de fibra óptica en su faceta superior en comparación con la inferior, se puede utilizar para obtener imágenes de mayor resolución mediante aumento. Los chips microfluídicos que se utilizan en esta plataforma se fabrican utilizando paredes de polidimetil Sloane colocadas en portaobjetos de vidrio para crear los microcanales que se necesitan para que las imágenes en chip comiencen el ensamblaje de la plataforma de imágenes en chip sin tierra. Primero, retire la cubierta de vidrio del conjunto de sensores optoelectrónicos con un bolígrafo de vacío, coloque suavemente un filtro de absorción delgado en la parte superior del área activa del detector.

Coloque una placa frontal de fibra óptica encima de este filtro de absorción. A continuación, coloque el chip microfluídico fabricado directamente encima de la matriz de fibra óptica. A continuación, se ensambla un prisma de vidrio sobre el aceite de coincidencia del índice de uso del chip microfluídico de modo que el índice de refracción de la interfaz coincida con el índice de refracción del vidrio.

Conecte las fuentes de luz a los cables de fibra óptica mediante el uso de conectores FC. Uno de los aspectos más difíciles de este procedimiento es la alineación de los componentes. Alinee cuidadosamente las distancias entre los componentes, la posición y el ángulo de la iluminación.

Finalmente, acerque la fibra de iluminación lateral al prisma y ajuste su ángulo para garantizar que se produzca una reflexión interna total en la interfaz de vidrio y aire correspondiente a los chips microfluídicos. Se pueden obtener imágenes del sustrato inferior, varias células o modelos de animales pequeños utilizando esta plataforma en chip, pero se tomarán imágenes de glóbulos blancos para los fines de esta demostración. Para etiquetar los glóbulos blancos con un tinte fluorescente, primero mezcle alrededor de 100 microlitros de sangre entera con alrededor de un mililitro de tampón ascendente de glóbulos rojos, incube durante unos tres minutos a temperatura ambiente, luego centrifugue la solución de sangre de mentiras.

Después de retirar la capa superior con una micropipeta, vuelva a suspender la capa de pellets en solución salina tamponada con fosfato para marcar el ácido nucleico de las células con colorante fluorescente, agregue SYTO 16 a la suspensión de resina y luego incube la muestra durante unos 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, centrifugar la muestra etiquetada. Retire el supinato para disminuir el ruido de fondo debido a la emisión fluorescente de los tintes no unidos.

Reese ha doblado la capa de gránulos de glóbulos blancos en alrededor de cinco mililitros de PBS. La muestra ya está lista para ser cargada en el chip microfluídico para la obtención de imágenes fluorescentes sin cristalino. Antes de obtener imágenes de los glóbulos blancos, la plataforma de imágenes debe calibrarse utilizando microperlas fluorescentes.

Prepare la muestra de microperlas diluida con agua desionizada y solución de perlas crudas. Usando una jeringa de aguja afilada. Inyecte esta muestra inicial en el chip microfluídico desde el lado de las paredes del PDMS.

Después de ensamblar los componentes para lograr imágenes fluorescentes en el chip, adquiera imágenes sin procesar de perlas fluorescentes utilizando la interfaz de vista de laboratorio desarrollada a medida a través de una computadora. Asegúrese de comprobar que hay al menos 20 imágenes de perlas fluorescentes aisladas en todo el campo de visión. Guarde los datos de calibración, que se utilizarán más adelante para calibrar y extraer la función de dispersión de puntos de la plataforma de microscopía fluorescente sin lente.

Retire el chip microfluídico que contiene la muestra de perlas fluorescentes y separe el prisma de este chip. Inyecte la muestra de glóbulos blancos previamente preparada en otro chip microfluídico no utilizado desde el lado de las paredes del PDMS. A ensamblar los componentes una vez más con las mismas condiciones experimentales, especialmente en lo que respecta a las distancias y la potencia de excitación.

Adquiera las imágenes sin procesar de los glóbulos blancos utilizando la vista de laboratorio personalizada con los mismos parámetros de software que se utilizan para las microperlas fluorescentes. Los datos de calibración y las imágenes de glóbulos blancos sin procesar se utilizan para crear imágenes de mayor resolución en MATLAB mediante el procesamiento digital. Los resultados representativos de las imágenes fluorescentes en chip de lente de campo amplio de una mezcla que contiene partículas fluorescentes verdes de cuatro micras y 10 micras se muestran aquí con fines de comparación, microscopio de 10 x.

También se proporcionan imágenes objetivas, que concuerdan bien con las imágenes sin fluorescentes que se muestran. A continuación, los resultados de una lente de campo amplio, imágenes menos fluorescentes de una mezcla que contiene partículas fluorescentes de 10 micras verdes y 10 micras rojas. Las imágenes fluorescentes sin lente proporcionan una coincidencia decente con las imágenes de objetivo de microscopio de 10 x de las mismas muestras.

Esta figura proporciona una comparación de rendimiento de la deconvolución de Lucy Richardson y el muestreo compresivo basado en algoritmos de decodificación para la obtención de imágenes de varios pares de cuentas de 10 micras. La fila superior ilustra las imágenes fluorescentes sin procesar sin lente en las que las imágenes insertadas muestran las comparaciones del microscopio de las mismas partículas que se requieren con una lente de objetivo de 10x. La fila central muestra los resultados de la decodificación compresiva, mientras que la fila inferior ilustra los resultados de la deconvolución de Lucy Richardson, DDCS y DLR, se refieren a las distancias de centro a centro y a las imágenes del microscopio, las imágenes de lentes decodificadas CS y las imágenes sin lentes enrevesadas LR, respectivamente.

A continuación, se ilustra el procesamiento digital de imágenes en bruto de lentes, menos fluorescentes. Se utiliza un algoritmo basado en muestreo compresivo para lograr una resolución espacial de menos de cuatro micras mediante la resolución de pares de cuentas de dos micras de diámetro muy juntas. Los recuadros muestran comparaciones de objetivos de 40 microscopios, que concuerdan muy bien con las imágenes fluorescentes decodificadas.

Aquí, D se refiere a las distancias de centro a centro en las imágenes de microscopio. Mientras que DCS se refiere a las distancias de centro a centro en la lente decodificada CS, menos imágenes fluorescentes. Esta figura muestra los resultados de la obtención de imágenes sin lente de glóbulos blancos marcados con fluorescencia.

Las imágenes sin lente en bruto se decodifican rápidamente utilizando un decodificador basado en CS, que concuerda muy bien con una imagen de microscopio convencional de la misma muestra que se adquiere con una lente de objetivo de 10x. Además de la obtención de imágenes si es necesario, los objetos fluorescentes decodificados también se pueden contar automáticamente mediante una interfaz desarrollada a medida para aplicaciones de citometría en chip. Aquí se ilustra una interfaz de recuento de objetos fluorescentes automatizada y diseñada a medida en matlab. Acabamos de demostrar el procedimiento para la microscopía fluorescente sin tierra de células marcadas y microlatidos en un campo de visión de ocho centímetros cuadrados.

Una plataforma de imágenes de barcos tan comparada con el decodificador compresivo rápido que hay detrás. Será bastante variable para aplicaciones de citometría de alto rendimiento, análisis micro raros y aplicaciones de investigación con células reales.