Obtención de imágenes de liberación de neurotransmisores mediante reporteros de ingeniería fluorescente de neurotransmisores basados en células

Tome un ratón con una ventana craneal que contiene una capa delgada del cráneo para permitir la visualización del cerebro.

El movimiento de la cabeza se restringe mediante una barra de cabeza adjunta.

La corteza está preinyectada con reporteros de ingeniería fluorescente de neurotransmisores basados en células, o CNiFER, que son células reporteras que permiten la detección en tiempo real de la liberación de neurotransmisores.

Los CNiFER expresan un receptor de neurotransmisores acoplado a proteína G y un detector de calcio citoplasmático, que consiste en un dominio de unión al calcio fusionado con fluoróforos donantes y aceptores.

Usando un microscopio de dos fotones, excite el detector para causar la emisión de fluorescencia del donante y permita la visualización de CNiFER.

La actividad neuronal que llega a la corteza provoca la liberación de neurotransmisores.

Estos neurotransmisores se unen a los receptores CNiFER y activan las vías de señalización que inducen la liberación de calcio del retículo endoplásmico.

El aumento del calcio citoplasmático se une al detector, provocando un cambio conformacional que acerca los fluoróforos.

El donante transfiere energía al aceptor para estimular la emisión de fluorescencia del aceptor, lo que indica la liberación de neurotransmisores.

Coloque la plataforma de imágenes con el mouse con la cabeza restringida debajo de un objetivo de inmersión en agua de 10x en un microscopio de imágenes de dos fotones. Inserte el cubo de filtro para imágenes de trastes que tenga un espejo dicroico a 505 nanómetros y filtros de paso de banda que abarquen de 460 nanómetros a 500 nanómetros para medir ECFP y de 520 nanómetros a 560 nanómetros para medir Citron.

Luego agregue ACSF al pozo, que contiene la ventana del cráneo adelgazada, y baje el objetivo de inmersión en agua 10x en el ACSF. Utilice el ocular, junto con la lámpara de mercurio y el cubo de filtro GFP para localizar los cNIFER. Ahora, cambie al objetivo de inmersión en agua de 40x.

A continuación, seleccione la trayectoria de luz adecuada para la obtención de imágenes de dos fotones. Encienda el láser pulsado de femtosegundo de infrarrojo cercano. Seleccione la longitud de onda de 820 nanómetros y un ajuste de potencia del 5 al 15%. Establezca el voltaje PMT1 y PMT2 en un valor submáximo, generalmente de 500 a 1000 voltios, según el PMT.

Luego establezca la ganancia en 1 para cada canal y 0 la posición Z para el objetivo. Baje el objetivo aproximadamente de 100 a 200 micrómetros de la superficie cortical e inicie el escaneo x, y. Ajuste la ganancia de potencia del láser y el voltaje PMT para cada canal para optimizar la relación señal / ruido de la fluorescencia de cNIFER.

A continuación, use el software para restringir las imágenes a una región que contenga las células cNIFER, así como a una región de fondo. Seleccione el promedio de línea de Kalman para dos para obtener una relación señal-ruido adecuada y utilice una velocidad de escaneo de 0,3 a 1 hercios a 4 microsegundos por píxel. Después de eso, dibuje un ROI alrededor de las células cNIFER, rodeando aproximadamente de tres a cuatro células por plano.

Configure un análisis en tiempo real de las intensidades promedio de ROI. Luego comience la adquisición para monitorear la fluorescencia de cNIFER a lo largo del tiempo y comience la estimulación eléctrica o un experimento de comportamiento mientras monitorea el traste.