Name: Estudio del citoesqueleto de actina en vivo las células endoteliales que expresan GFP-actina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a observar cambios dinámicos en el citoesqueleto de actina en células endoteliales vivas mediante imagen con GFP-actina. Esta técnica permite evaluar en tiempo real la dinámica citoesquelética y comprender los mecanismos de permeabilidad endotelial.

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El plásmido GFP-β-actina fue generosamente proporcionado por el Dr. Wayne Orr, LSUHSC-S del Departamento de Patología, y se amplificó en el laboratorio del Dr. Becky Worthylake, LSUHSC-NO Departamento de Farmacología. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (P20 RR-018766) y la Asociación Americana del Corazón (05835386N).

<ol><li>Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GTPases+in+control+of+microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Role of GTPases in control of microvascular permeability.</a> Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).</li>
<li>Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+the+regulation+of+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Vascul.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability.</a> Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).</li>
<li>Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+pathways+in+enhanced+microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability.</a> Microcirculation. 7, 395-403 (2000).</li>
<li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+GTPases+in+mechanosensitive+regulation+of+endothelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier.</a> Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).</li>
<li>Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W. Microcirculatory Exchange Function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuran%2C+WN+%22Handbook+of+Physiology%3A+Microcirculation%22">Handbook of Physiology: Microcirculation</a>. Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. , 2nd Edition, Elsevier. San Diego. 81-124 (2008).</li>
<li>Hu, Y. L., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+motion+of+paxillin+on+actin+filaments+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).</li>
<li>Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+ruffles+in+cell+migration%3A+indicators+of+inefficient+lamellipodia+adhesion+and+compartments+of+actin+filament+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization.</a> Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).</li>
<li>Hotulainen, P., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+fibers+are+generated+by+two+distinct+actin+assembly+mechanisms+in+motile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells.</a> J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).</li>
<li>Pellegrin, S., Mellor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+stress+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Actin stress fibres.</a> J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).</li>
<li>Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics in living mammalian cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).</li>
<li>Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+mechanical+strain+of+an+endogenous+cytoskeletal+network+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells.</a> Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).</li>
<li>Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Rho+GTPases+in+thrombin-induced+lung+vascular+endothelial+cells+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction.</a> Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).</li>
<li>van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+RhoA+by+thrombin+in+endothelial+hyperpermeability%3A+role+of+Rho+kinase+and+protein+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases.</a> Circ. Res. 87, 335-340 (2000).</li>
<li>Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+histamine+and+thrombin+on+endothelial+barrier+function+through+actin-myosin+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).</li>
<li>Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWittman%2C+T+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: A Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 184-204 (2005).</li>
<li>Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRabut%2C+G+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: A Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2005).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La imagen de la GFP-actina en las células endoteliales en vivo permite un análisis detallado de la dinámica del citoesqueleto de actina en respuesta a estímulos inflamatorios. Este método también puede ser útil para construir sobre los hallazgos previos que muestran que la remodelación del citoesqueleto en respuesta a las fuerzas físicas como la tensión de corte 11. Además, este método permite una evaluación detallada de la contribución de la dinámica del citoesqueleto de actina a las diversas actividades de las células endoteliales, como la migración, la mitosis, la formación de uniones intercelulares y la maduración de la unión, y el mantenimiento de la función de barrera. En los datos presentados, el comportamiento del citoesqueleto de actina endotelial se puede observar antes y después del tratamiento con trombina. Lamellipodia locales a lo largo de los bordes de las células endoteliales se observó la formación y la regresión en el tiempo en monocapas de células tanto nonconfluent y confluente. El tratamiento con trombina interrumpió brevemente la forma lamellipodiación y el volumen de ventas. La trombina también hizo que las células se contraen ligeramente, de acuerdo con los informes anteriores que la trombina hace que el estrés de actina formación de la fibra y el desarrollo de aumento de la tensión centrípeta en las células endoteliales 12-14. Sin embargo, a partir de estudios de células en vivo de imágenes de este tipo, el origen de las fibras de estrés se puede determinar. En HUVEC, la mayoría de las fibras de estrés se originan en la periferia de la célula y se asemejan a las fibras transversales del arco en la migración de las células 8, 9. Otro punto fuerte de este método sobre el uso de células fijas es que el número de fibras de estrés pueden ser cuantificados en las células antes y después del tratamiento de trombina, lo que elimina el sesgo de selección entre los grupos experimentales. Con este protocolo se evalúa el movimiento dinámico del borde de la celda y las fibras de actina estrés. Para entender la dinámica de actina monómeros en las células endoteliales, las técnicas más avanzadas como la recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) o fluorescencia moteado microscopia (FSM) se puede aplicar 15, 16. Además, debido a las células endoteliales microvasculares pueden representar un mejor modelo de la función de barrera microvascular, la optimización de los protocolos de transfección para expresar eficazmente GFP-actina en las células endoteliales microvasculares representa una futura dirección lógica. En resumen, las imágenes en vivo de las células endoteliales que expresan GFP-actina constituye un poderoso instrumento para determinar cómo el citoesqueleto de actina de células endoteliales responden a diversos tipos de estímulos. Los estudios que utilizan monocapas endoteliales confluentes bien le ayudará a determinar las funciones de las estructuras dinámicas como la actina-ricos lamellipodia y transversal las fibras de estrés de arco en función de barrera endotelial. Además, imágenes de células vivas de las células endoteliales que expresan GFP-actina y otras proteínas de fusión que permiten la visualización de otras estructuras subcelulares proporcionará información detallada espacio-temporal necesaria para comprender la señalización y los mecanismos estructurales que determine integridad de la barrera.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. Ringer 5x de archivo </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Cloruro de Potasio </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Cloruro de calcio </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Sulfato de magnesio </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> El agua filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Llevar a 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtro estéril en botellas autoclave y se almacena a 4 º C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. MOPS buffer </td></tr><tr><td> Químico </td><td>Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> El agua filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Llevar a 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtro estéril en botellas autoclave y se almacena a 4 º C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. Solución de albúmina salina fisiológica (APSS) </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> Timbre de valores (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Trapeadores Buffer </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Fosfato de sodio </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> El piruvato de sodio &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA sal sódica </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albúmina, bovina </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> El agua filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Llevar a 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Ajustar el pH de 7,4 a 37 ° C, luego de filtro estéril en botellas autoclave y se almacena a 4 º C. </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. 0,9% </td></tr><tr><td> Químico </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 9 g </td></tr><tr><td> El agua filtrada estéril </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Llevar a 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtro estéril en botellas autoclave y se almacena a 4 º C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. 1,5% solución de gelatina </td></tr><tr><td> La gelatina de piel porcina </td><td> Sigma </td><td> G2500 </td><td> 15 g </td></tr><tr><td> 0,9% </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Llevar a 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Caliente la solución a 37 ° C para disolver la gelatina suficiente. Mientras aún está caliente, filtro estéril en botellas autoclave y se almacena a 4 º C </td></tr></tbody></table>

estudio del citoesqueleto de actina en vivo las células endoteliales que expresan gfp-actina

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

El endotelio microvascular juega un papel importante como una barrera selectivamente permeable a los líquidos y solutos. Las uniones adhesivas entre las células endoteliales regulan la permeabilidad del endotelio, y muchos estudios han indicado la importante contribución del citoesqueleto de actina a la determinación de la integridad de la unión 1-5. Una banda de actina cortical se cree que es importante para el mantenimiento de la estabilidad uniones 1, 2, 4, 5. Por el contrario, las fibras de actina estrés se cree que generan tensión centrípeta dentro de las células endoteliales, que debilita las uniones 2-5. Gran parte de esta teoría se ha basado en estudios en los que las células endoteliales son tratados con mediadores inflamatorios que aumentan la permeabilidad endotelial, y la fijación de las células y el etiquetado de F-actina para la observación microscópica. Sin embargo, estos estudios proporcionan una comprensión muy limitada de la función del citoesqueleto de actina de las células ya que las imágenes fijas proporcionan instantáneas sólo entiempo que no tienen información sobre la dinámica de las estructuras de actina 5. Imágenes de células vivas, permite la incorporación de la naturaleza dinámica del citoesqueleto de actina en los estudios de los mecanismos que determinan la integridad de la barrera endotelial. Una gran ventaja de este método es que el impacto de los diversos estímulos inflamatorios en las estructuras de actina en las células endoteliales puede ser evaluada en el mismo conjunto de células vivas, antes y después del tratamiento, la eliminación de los posibles sesgos que pueden ocurrir al observar las muestras fijadas. Humanos vena umbilical células endoteliales (HUVEC) se transfectaron con GFP-β-actina de plásmidos y crecido a la confluencia en cubreobjetos de vidrio. Time-lapse imágenes de GFP-actina en HUVEC confluentes son capturados antes y después de la adición de mediadores inflamatorios que provocan cambios dependientes del tiempo en la integridad de la barrera endotelial. Estos estudios permiten la observación visual de la secuencia fluida de los cambios en el citoesqueleto de actina que contribuyen al endoteliol alteración de la barrera y la restauración. Nuestros resultados muestran de forma consistente local, rica en actina formación lamellipodia y la rotación en las células endoteliales. La formación y el movimiento de las fibras de actina estrés también puede ser observado. Un análisis de la frecuencia de formación y la rotación de los locales lamellipodia, antes y después del tratamiento con estímulos inflamatorios pueden ser documentados por los análisis quimógrafo. Estos estudios proporcionan información importante sobre la naturaleza dinámica del citoesqueleto de actina en las células endoteliales que pueden utilizarse para descubrir los mecanismos moleculares previamente no identificado importante para el mantenimiento de la integridad de la barrera endotelial.

Imágenes microscópicas de vida las células endoteliales que expresan GFP-actina permite la caracterización de los cambios dinámicos en las estructuras del citoesqueleto. A diferencia de las técnicas que utilizan las muestras fijadas, este método proporciona una evaluación detallada de los cambios temporales en el citoesqueleto de actina en las células del mismo, antes, durante y después de diversos estímulos físicos, farmacológicos o inflamatorios.

Estudio del citoesqueleto de actina en vivo las células endoteliales que expresan GFP-actina

El endotelio microvascular desempeña un papel importante como barrera selectivamente permeable a fluidos y solutos. Las uniones adhesivas entre el endotelio...

El objetivo de este procedimiento es observar los cambios dinámicos en el citoesqueleto de actina de células endoteliales vivas. Primero, transfecte células endoteliales de vena umbilical humana con un plásmido de actina beta GFP y cultívelas hasta confluencia sobre cubreobjetos. Luego, coloque los cubreobjetos en una cámara de imagenología de células vivas con una platina calentada y una infusión de solución fisiológica de albúmina.El paso final consiste en la adquisición de datos de un área seleccionada de células mediante la captura de imágenes con lapso de tiempo antes y después del tratamiento con un agente farmacológico. El análisis del gráfico de campana con software de imágenes como Image J puede proporcionar información sobre las protrusiones locales de los láminas podiales, tales como la distancia, el tiempo y la velocidad de las protrusiones, así como el movimiento de las fibras actuantes a lo largo del tiempo. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la imagen de inmunofluorescencia es que el estudio de células vivas permite incorporar la naturaleza dinámica del citoesqueleto actino en investigaciones sobre los mecanismos que determinan la permeabilidad endotelial.Mientras que las células teñidas fijadas representan instantáneas en el tiempo y proporcionan poca información sobre la dinámica del acto y el citoesqueleto antes y después del tratamiento con un mediador inflamatorio en una campana de seguridad biológica. Esterilice las laminillas con etanol al 70 % durante dos minutos y luego séquelas al aire. Coloque cada laminilla en una placa de cultivo de 10 centímetros y añada 300 microlitros de solución tibia de gelatina al centro sin tocar los bordes de la laminilla. Después de cinco minutos, aspire el líquido.Ahora, recolecte un cultivo confluyente de células endoteliales de vena umbilical humana o VE con tripsina-EDTA al 0,25 %. Cuente las células y céntrelas mediante centrifugación. Aspire la mayor cantidad posible del medio SUP natum para una reacción de transfección con el kit de efector nuclear VE.Re-suspenda los pellet celulares en la solución básica de efector nuclear y agregue de 0,2 a dos microgramos de plásmido del vector GFP beta actina. Transfiera 100 microlitros de la suspensión celular a un qve de efector nuclear. Toque varias veces el vete tapado para asegurar que no haya burbujas entre el fondo del Q vet y la muestra de transfección.Coloque el Q VET en el dispositivo nuclear efector dos y ejecute el programa A 0 3 4 utilizando una pipeta de transferencia del kit nuclear efector para transferir un cuarto calentado de 500 microlitros de medio EGM dos MV al qve. Luego, transfiera la mezcla de regreso al tubo microfuga e incube durante 15 minutos. Mezcle suavemente la suspensión de VE transfectada una vez y siembre 300 microlitros de la suspensión sobre un cubreobjetos recubierto con gelatina sin tocar los bordes.Luego, incubar durante una a cuatro horas. Inspeccionar las células transfectadas para confirmar la adhesión al cubreobjetos. A continuación, añadir 10 mililitros de medio E GM two MV a la placa y continuar la incubación para la expresión de GFP.Primero, agregue un medio de solución salina fisiológica con albúmina o una solución salina tamponada (PSS) al sistema de flujo por gravedad y conéctelo al calentador en línea. Ahora, ajuste el regulador de flujo para lograr un caudal de aproximadamente 40 mililitros por hora. Luego, detenga el flujo cerrando la llave de paso con un aplicador de algodón.Aplique grasa para vacío al borde externo de la parte inferior del baño de diamante. A continuación, retire un cultivo transfectado del incubador. Levante suavemente la cubeta con pinzas.Luego, con una toalla Kim, absorba el exceso de medio EGM two MV en la lámina inferior, colocando la cara de las células hacia arriba. Coloque el baño de diamante sobre el cubreobjetos para formar una cámara. Coloque rápidamente la cámara en el calentador del microscopio.Ajuste las abrazaderas sobre la cámara y pipetee aproximadamente un mililitro de medio EGM two MV desde la placa hacia la cámara. Ahora, conecte la manguera de vacío a su soporte en el lado izquierdo de la cámara y la línea de A PSS desde el calentador en línea al canal en el lado derecho de la cámara. Luego, encienda el vacío y abra la línea de A PSS para permitir la perfusión del baño sobre las células transfectadas.Asimismo, encienda el calentador en línea a 37 grados Celsius. A continuación, coloque la sonda termistora del portaobjetos calefaccionado en el baño situado en el borde y encienda el calentador del portaobjetos a 37 grados Celsius. Para eliminar cualquier residuo restante del medio EGM dos MV y la acumulación, limpie cuidadosamente el reverso del cubreobjetos utilizando una toallita Kim empapada con etanol al 70 %, seguida de una toallita Kim seca. Equilibre las células HU transfectadas durante 30 minutos.Bloquee el enfoque. Enfóquese en el área seleccionada de las células en cultivo para su estudio. Ajuste el tiempo de exposición de la cámara entre 0,5 y dos segundos, dependiendo de la intensidad de la señal GFP Act en las células.Asimismo, configure los tiempos de intervalo y duración para el experimento. Ahora, con las luces del cuarto apagadas, capture una sola imagen para evaluar los ajustes. Capture la serie de lapsos de tiempo, monitoreando las imágenes según sean necesarias.En un protocolo típico, obtenga imágenes basales durante 20 a 30 minutos antes de añadir un agente de prueba, seguidas de 0,5 a cuatro horas adicionales de adquisición de imágenes. Finalmente, como se detalla en el texto adjunto, evalúe la distancia de protrusión de los lámelopodios, la persistencia y la velocidad mediante el análisis de gráficos de CH. En un experimento típico, la actina GFP se expresa en más del 50 % de las VE transfectadas de manera aleatoria.Estas imágenes adquiridas una vez por minuto capturaron la actina GFP en todo el citoplasma, así como en estructuras filamentosas y en protrusiones locales de lamelipodios a lo largo del borde celular. La persistencia de la distancia y la velocidad de las protrusiones celulares se cuantifican a partir de conjuntos de imágenes de lapso de tiempo. Mediante el análisis de gráficos chm, primero se traza una línea de un solo píxel aproximadamente perpendicular al borde de la célula.Esta región se extrae de cada imagen del conjunto de lapsos de tiempo para generar un mosaico de la región a lo largo del tiempo o un gráfico de campana, en el que, desde una perspectiva de izquierda a derecha, las protrusiones se representan como movimientos ascendentes en el borde de la célula. Cuando se superpone una línea al borde de una de estas protrusiones, pueden recopilarse los datos de píxeles asociados a esa línea para cuantificar la dinámica de las protrusiones. El número total de protrusiones en un gráfico de campana puede utilizarse para estimar la frecuencia de protrusiones.Este análisis muestra los movimientos de las fibras de estrés formadas cerca de la periferia celular que se desplazan hacia el centro de la célula, donde finalmente se desensamblan. En el gráfico chio, las fibras de estrés aparecen como líneas continuas en el área citoplasmática, moviéndose frecuentemente hacia abajo y hacia la derecha en dirección al centro celular. Cuando las fibras son difíciles de observar en el gráfico chio original, el filtro de máscara de realce mejora la nitidez de las líneas. Las líneas trazadas sobre las fibras de estrés facilitan la recolección de datos de píxeles mediante la función de medición. Alternativamente, se trazan líneas desde el inicio hasta el final de la fibra de estrés identificada, obteniéndose un promedio ponderado de los datos de píxeles durante el tiempo que se observó la fibra.Esta presentación demostró cómo analizar datos provenientes del conjunto de imágenes de lapso de tiempo mediante análisis de gráficos con software como Image J. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo estudiar la dinámica del citoesqueleto de actina en respuesta a mediadores inflamatorios utilizando imágenes de células endoteliales transfectadas en tiempo real.

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Aprende a observar cambios dinámicos en el citoesqueleto de actina en células endoteliales vivas mediante imagen con GFP-actina. Esta técnica permite evaluar en tiempo real la dinámica citoesquelética y comprender los mecanismos de permeabilidad endotelial.

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