Estudio del citoesqueleto de actina en vivo las células endoteliales que expresan GFP-actina

El objetivo de este procedimiento es observar los cambios dinámicos en el citoesqueleto de actina de células endoteliales vivas. Primero, transfecte células endoteliales de vena umbilical humana con un plásmido de actina beta GFP y cultívelas hasta confluencia sobre cubreobjetos. Luego, coloque los cubreobjetos en una cámara de imagenología de células vivas con una platina calentada y una infusión de solución fisiológica de albúmina.

El paso final consiste en la adquisición de datos de un área seleccionada de células mediante la captura de imágenes con lapso de tiempo antes y después del tratamiento con un agente farmacológico. El análisis del gráfico de campana con software de imágenes como Image J puede proporcionar información sobre las protrusiones locales de los láminas podiales, tales como la distancia, el tiempo y la velocidad de las protrusiones, así como el movimiento de las fibras contráctiles a lo largo del tiempo. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la imagen de inmunofluorescencia es que el estudio de células vivas permite incorporar la naturaleza dinámica del citoesqueleto actínico en investigaciones sobre los mecanismos que determinan la permeabilidad endotelial.

Mientras que las células teñidas fijadas representan instantáneas en el tiempo y proporcionan poca información sobre la dinámica del acto y el citoesqueleto antes y después del tratamiento con un mediador inflamatorio en una campana de seguridad biológica. Esterilice las laminillas con etanol al 70 % durante dos minutos y luego séquelas al aire. Coloque cada laminilla en una placa de cultivo de 10 centímetros y añada 300 microlitros de solución tibia de gelatina al centro sin tocar los bordes de la laminilla. Después de cinco minutos, aspire el líquido.

Ahora, coseche una cultura confluyente de células endoteliales de vena umbilical humana o VE con tripsina-EDTA al 0.25 %. Cuente las células y pélalelas mediante centrifugación. Aspire la mayor cantidad posible del medio SUP natum para una reacción de transfección con el kit de efector nuclear VE.

Re-suspender los pellet celulares en solución básica de efector nuclear y añadir de 0,2 a dos microgramos del plásmido del vector GFP beta actina. Transferir 100 microlitros de la suspensión celular a un vial de efector nuclear. Golpear suavemente el vial tapado varias veces para asegurarse de que no haya burbujas entre el fondo del vial Q y la muestra de transfección.

Coloque el Q VET en el dispositivo nuclear efector dos y ejecute el programa A 0 3 4 utilizando una pipeta de transferencia del kit nuclear efector para transferir un cuarto calentado de 500 microlitros de medio EGM dos MV al qve. Luego, transfiera la mezcla de regreso al tubo microfuga e incube durante 15 minutos. Mezcle suavemente la suspensión de VE transfectada una vez y siembre 300 microlitros de la suspensión sobre un cubreobjetos recubierto con gelatina sin tocar los bordes.

Luego, incubar durante una a cuatro horas. Inspeccionar las células transfectadas para confirmar la adhesión al cubreobjetos. A continuación, añadir 10 mililitros de medio E GM two MV a la placa y continuar la incubación para la expresión de GFP.

Primero, agregue un medio de solución salina fisiológica con albúmina o una PSS al sistema de flujo por gravedad y conéctelo al calentador en línea. Ahora ajuste el regulador de flujo para lograr un flujo de aproximadamente 40 mililitros por hora. Luego detenga el flujo cerrando la llave de paso con un aplicador con punta de algodón.

Aplique grasa para vacío al borde exterior del lado inferior del baño de diamante. Ahora retire una cultura transfectada del incubador. Levante suavemente la cubeta utilizando pinzas.

Luego, con una toalla absorbente Kim, absorba el exceso de medio EGM two MV en la lámina inferior, colocando la cara celular hacia arriba. Coloque el baño de diamante sobre el cubreobjetos para formar una cámara. Coloque rápidamente la cámara en el calentador del microscopio.

Ajuste las abrazaderas sobre la cámara y pipetee aproximadamente un mililitro de medio EGM two MV desde la placa hacia la cámara. Ahora conecte la manguera de vacío a su soporte en el lado izquierdo de la cámara y la línea de A PSS desde el calentador en línea hacia el canal en el lado derecho de la cámara. Luego encienda el vacío y abra la línea de A PSS para permitir la perfusión del baño sobre las células transfectadas.

Asimismo, encienda el calentador en línea a 37 grados Celsius. A continuación, coloque la sonda termistor del platillo calefactado en el baño, en el borde, y encienda el calentador del platillo a 37 grados Celsius. Para eliminar cualquier resto de medio EGM-2 MV y acumulación, limpie cuidadosamente la cara inferior del cubreobjetos utilizando una toallita Kim empapada con etanol al 70%, seguida de una toallita Kim seca. Equilibre las células HU transfectadas durante 30 minutos.

Bloquee el enfoque. Enfóquese en el área seleccionada de las células cultivadas para su estudio. Ajuste el tiempo de exposición de la cámara entre 0,5 y dos segundos, dependiendo de la intensidad de la señal de GFP Act en las células.

Asimismo, configure los tiempos de intervalo y duración para el experimento. Ahora, con las luces del cuarto apagadas, capture una sola imagen para evaluar los ajustes. Capture la serie de imágenes de lapso de tiempo, monitoreando las imágenes según sean necesarias.

En un protocolo típico, obtenga imágenes basales durante 20 a 30 minutos antes de añadir un agente de prueba, seguidas de 0,5 a cuatro horas adicionales de adquisición de imágenes. Finalmente, como se detalla en el texto adjunto, evalúe la distancia de protrusión de los lámelopodios, la persistencia y la velocidad mediante el análisis de gráficos CH. En un experimento típico, la actina GFP se expresa en más del 50 % de las VE transfectadas de manera aleatoria.

Estas imágenes adquiridas una vez por minuto capturaron la actina GFP en todo el citoplasma, así como en estructuras filamentosas y en protrusiones locales de filopodios a lo largo del borde celular. La persistencia de la distancia y la velocidad de las protrusiones celulares se cuantifican a partir de conjuntos de imágenes de lapso de tiempo. Mediante el análisis de gráficos chm, primero se traza una línea de un solo píxel aproximadamente perpendicular al borde de la célula.

Esta región se extrae de cada imagen del conjunto de imágenes de lapso de tiempo para generar un mosaico de la región a lo largo del tiempo o un gráfico quimio, aquí desde una perspectiva de izquierda a derecha en el gráfico quimio, las protrusiones se representan como movimientos ascendentes en el borde de la célula. Cuando se superpone una línea sobre el borde de una de estas protrusiones, pueden recopilarse los datos de píxeles asociados a esa línea para cuantificar la dinámica de las protrusiones. El número total de protrusiones en un gráfico quimio puede utilizarse para estimar la frecuencia de protrusiones.

Este análisis muestra los movimientos de las fibras de estrés formadas cerca de la periferia celular que se desplazan hacia el centro de la célula, donde finalmente se desensamblan. En el gráfico chio, las fibras de estrés aparecen como líneas continuas en el área citoplasmática, moviéndose frecuentemente hacia abajo y hacia la derecha en dirección al centro celular. Cuando las fibras son difíciles de ver en el gráfico chio original, el filtro de máscara de realce mejora la nitidez de las líneas; las líneas dibujadas sobre las fibras de estrés facilitan la recopilación de datos de píxeles mediante la función de medición. Alternativamente, se trazan líneas desde el inicio hasta el final de la fibra de estrés identificada, obteniéndose un promedio ponderado de los datos de píxeles durante el tiempo que se observó la fibra.

Esta presentación demostró cómo analizar datos provenientes del conjunto de imágenes de lapso de tiempo mediante análisis de gráficos con software como Image J. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar la dinámica del citoesqueleto de actina en respuesta a mediadores inflamatorios utilizando imágenes de células endoteliales transfectadas vivas.