Imágenes de la dinámica subcelular del calcio en neuronas de Caenorhabditis elegans

Tome dos cepas transgénicas separadas de Caenorhabditis elegans en portaobjetos con almohadillas de agar. Las almohadillas contienen una solución de rodadura con un agente paralizante que minimiza el movimiento.

El cordón nervioso ventral de los gusanos, o VNC, contiene interneuronas excitadoras que expresan indicadores de calcio citoplasmático en una cepa e indicadores de calcio mitocondrial en la otra.

Coloque un cubreobjetos para enrollar los gusanos, orientando el VNC para su visualización, luego colóquelos bajo un microscopio de fluorescencia.

Use luz visible para localizar los gusanos, luego cambie al modo de fluorescencia.

En las neuronas en reposo, el bajo calcio intracelular mantiene los indicadores libres, lo que resulta en una fluorescencia débil.

La actividad neuronal espontánea abre canales de calcio dependientes de voltaje, lo que permite la entrada de calcio.

En la cepa con indicadores citoplasmáticos, el calcio se une a los indicadores, mejorando la fluorescencia citoplasmática.

El exceso de calcio citoplasmático ingresa a las mitocondrias a través de canales. En la cepa con indicadores mitocondriales, la unión al calcio aumenta la fluorescencia mitocondrial.

Obtener imágenes de las neuronas en ambas cepas para monitorear la dinámica subcelular del calcio.

En un tubo de cultivo de vidrio de 13 por 100 milímetros, prepare 3 mililitros de agar al 10% disolviendo agar de grado molecular en M9 y microondas durante varios segundos. Para hacer las almohadillas de agar, primero prepare dos portaobjetos agregando dos capas de cinta de laboratorio. Luego coloque un portaobjetos de microscopio entre los dos portaobjetos. Corte la punta de una punta de pipeta de 1.000 microlitros y utilícela para pipetear una pequeña gota de agar en el centro del cubreobjetos.

Aplana el agar presionando otro tobogán hacia abajo sobre el agar. Después de enfriar, corte el agar en un disco pequeño usando la abertura de un tubo de 10 mililitros y luego retire el agar circundante. A continuación, prepare la solución de rodillo de gusanos disolviendo el polvo de muscimol en M9 para crear un caldo de 30 milimolares. Diluya el material en una proporción de uno a uno con perlas de poliestireno para hacer la solución de laminación.

Para colocar el gusano para la obtención de imágenes, primero coloque 1,6 microlitros de la solución de laminación en el centro de la almohadilla de agar. Luego, usando un pico de gusano preferido, transfiera un gusano de la edad deseada a la solución de laminación en la almohadilla de agar. Espere unos cinco minutos para que el muscimol reduzca el movimiento del gusano y luego deje caer un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros sobre la almohadilla de agar.

Para obtener imágenes de neuritas en el cordón nervioso ventral, haga rodar el gusano deslizando ligeramente el cubreobjetos. Para montar el gusano en el microscopio, coloque una gota de aceite de inmersión en el cubreobjetos. Encuentre el gusano usando un objetivo de bajo aumento en campo claro. Luego cambie al objetivo 100X y localice la neurita AVA usando la iluminación del GCaMP o mito-GCaMP con el láser de imágenes de 488 nanómetros.