Imágenes de la dinámica subcelular del calcio en neuronas de Caenorhabditis elegans
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociencia
0 vistas • 3:17 min • June 17th, 2025
Tome dos cepas transgénicas separadas de Caenorhabditis elegans en portaobjetos con almohadillas de agar. Las almohadillas contienen una solución de rodadura con un agente paralizante que minimiza el movimiento.
El cordón nervioso ventral de los gusanos, o VNC, contiene interneuronas excitadoras que expresan indicadores de calcio citoplasmático en una cepa e indicadores de calcio mitocondrial en la otra.
Coloque un cubreobjetos para enrollar los gusanos, orientando el VNC para su visualización, luego colóquelos bajo un microscopio de fluorescencia.
Use luz visible para localizar los gusanos, luego cambie al modo de fluorescencia.
En las neuronas en reposo, el bajo calcio intracelular mantiene los indicadores libres, lo que resulta en una fluorescencia débil.
La actividad neuronal espontánea abre canales de calcio dependientes de voltaje, lo que permite la entrada de calcio.
En la cepa con indicadores citoplasmáticos, el calcio se une a los indicadores, mejorando la fluorescencia citoplasmática.
El exceso de calcio citoplasmático ingresa a las mitocondrias a través de canales. En la cepa con indicadores mitocondriales, la unión al calcio aumenta la fluorescencia mitocondrial.
Obtener imágenes de las neuronas en ambas cepas para monitorear la dinámica subcelular del calcio.
En un tubo de cultivo de vidrio de 13 por 100 milímetros, prepare 3 mililitros de agar al 10% disolviendo agar de grado molecular en M9 y microondas durante varios segundos. Para hacer las almohadillas de agar, primero prepare dos portaobjetos agregando dos capas de cinta de laboratorio. Luego coloque un portaobjetos de microscopio entre los dos portaobjetos. Corte la punta de una punta de pipeta de 1.000 microlitros y utilícela para pipetear una pequeña gota de agar en el centro del cubreobjetos.
Aplana el agar presionando otro tobogán hacia abajo sobre el agar. Después de enfriar, corte el agar en un disco pequeño usando la abertura de un tubo de 10 mililitros y luego retire el agar circundante. A continuación, prepare la solución de rodillo de gusanos disolviendo el polvo de muscimol en M9 para crear un caldo de 30 milimolares. Diluya el material en una proporción de uno a uno con perlas de poliestireno para hacer la solución de laminación.
Para colocar el gusano para la obtención de imágenes, primero coloque 1,6 microlitros de la solución de laminación en el centro de la almohadilla de agar. Luego, usando un pico de gusano preferido, transfiera un gusano de la edad deseada a la solución de laminación en la almohadilla de agar. Espere unos cinco minutos para que el muscimol reduzca el movimiento del gusano y luego deje caer un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros sobre la almohadilla de agar.
Para obtener imágenes de neuritas en el cordón nervioso ventral, haga rodar el gusano deslizando ligeramente el cubreobjetos. Para montar el gusano en el microscopio, coloque una gota de aceite de inmersión en el cubreobjetos. Encuentre el gusano usando un objetivo de bajo aumento en campo claro. Luego cambie al objetivo 100X y localice la neurita AVA usando la iluminación del GCaMP o mito-GCaMP con el láser de imágenes de 488 nanómetros.
Descripción general
Este estudio investiga la dinámica del calcio en cepas transgénicas de Caenorhabditis elegans utilizando microscopía de fluorescencia. El enfoque se centra en la cuerda nerviosa ventral, donde las interneuronas excitadoras expresan diferentes indicadores de calcio.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biología Celular
- Microscopía de Fluorescencia
Antecedentes
- La señalización de calcio es fundamental para la función neuronal.
- Los modelos transgénicos permiten la visualización específica de la dinámica del calcio.
- Comprender la entrada de calcio puede proporcionar información sobre la actividad neuronal.
- La microscopía de fluorescencia es una herramienta poderosa para la obtención de imágenes de procesos celulares.
Objetivo del estudio
- Visualizar y comparar la dinámica del calcio citoplasmático y mitocondrial en C. elegans.
- Evaluar los efectos de un agente paralizante sobre la actividad neuronal.
- Profundizar en el entendimiento de la señalización por calcio en neuronas.
Métodos Utilizados
- Preparación de cepas transgénicas de C. elegans que expresan diferentes indicadores de calcio.
- Uso de almohadillas de agar y una solución rodante para inmovilizar gusanos durante la obtención de imágenes.
- Microscopía de fluorescencia para monitorear la dinámica del calcio en neuronas en reposo y activas.
- Análisis de imágenes para cuantificar los cambios de fluorescencia en respuesta a la actividad neuronal.
Resultados Principales
- Un aumento de la fluorescencia citoplasmática se correlaciona con la entrada de calcio durante la actividad neuronal.
- La fluorescencia mitocondrial también aumenta con niveles elevados de calcio citoplasmático.
- El método visualiza eficazmente la dinámica del calcio a nivel subcelular en neuronas vivas.
- Los resultados demuestran la utilidad de los C. elegans transgénicos para estudiar la señalización por calcio.
Conclusiones
- Este estudio proporciona información sobre el papel del calcio en la función neuronal.
- Los C. elegans transgénicos son útiles para investigar la dinámica del calcio.
- Los hallazgos podrían tener implicaciones para comprender los mecanismos de señalización neuronal.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La obtención de imágenes cuantitativas de la dinámica del calcio a nivel subcelular en neuronas de C. elegans permite una interrogación precisa de las vías de señalización neuronal tanto a nivel citoplasmático como mitocondrial. Esta capacidad apoya la reducción de riesgos mecanicistas y la confianza predictiva en el descubrimiento temprano de fármacos centrado en neurobiología. El enfoque fortalece la validación de dianas e informa sobre la continuidad traslacional de los activos en carteras del SNC.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la visualización directa del flujo de calcio para aclarar la función de las vías neuronales.
- Apoya la validación funcional de objetivos al distinguir el manejo del calcio citoplasmático frente al mitocondrial.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al vincular la actividad neuronal con respuestas subcelulares de calcio.
- Proporciona confianza predictiva para priorizar objetivos neuronales en programas del sistema nervioso central.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Establece modelos transgénicos validados para ensayos reproducibles de imagen de calcio.
- Proporciona lecturas cuantitativas de fluorescencia para una estandarización robusta de ensayos.
- Permite escalabilidad y reutilización de plataformas para cribado de compuestos dirigidos a la dinámica del calcio neuronal.
- Posibilita la evaluación confiable de moduladores que afectan el manejo subcelular del calcio.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea mediciones de calcio subcelular con la actividad neuronal relevante para la enfermedad.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de la función neuronal.
- Informa decisiones de avance ajustadas al riesgo para activos dirigidos al sistema nervioso central.
- Refuerza las estrategias traslacionales de biomarcadores al vincular los resultados de imágenes con puntos finales funcionales.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este flujo de trabajo de imágenes integra desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de compuestos prometedores y la validación preclínica en líneas de investigación de neurociencia.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al cuantificar el flujo de calcio subcelular en neuronas vivas.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos reproductibles de fluorescencia para la preparación de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Ofrece mediciones en tiempo real del calcio citoplasmático y mitocondrial para análisis comparativo entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta las etapas de descubrimiento y preclínica al alinear los resultados de imágenes con la función neuronal.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma de imagenología reutilizable para diversos programas de investigación en neurobiología y sistema nervioso central.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos neuronales.
- Valor operativo: Estandariza los protocolos de imagen para lograr reproductibilidad y escalabilidad entre equipos.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción del proyecto y una gestión eficiente del capital en el descubrimiento del SNC.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de activos en neurobiología.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía de fluorescencia y manejo de modelos transgénicos.
- Exige acceso a instrumentación de imágenes de alta resolución y herramientas de análisis cuantitativo.
- Necesita estandarización entre equipos de trabajo en los protocolos de adquisición de imágenes e interpretación de datos.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes subtipos neuronales o indicadores de calcio.
- Debe considerarse el rendimiento de la adquisición de imágenes y las limitaciones del sistema modelo en estudios a gran escala.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
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Última actualización: 22 agosto 2026