Aislamiento y cultivo de células troncales de la cresta neural de los folículos del cabello humano

El objetivo general de este procedimiento es aislar y cultivar células madre primarias de la cresta neural, o N CSC, a partir de tejidos del cuero cabelludo humano. Esto se logra primero maldiciendo la piel del cuero cabelludo humano en tiras de un centímetro de ancho e incubándolas en medios que contienen dis bays. A continuación, la piel se coloca en los medios frescos y se taponan los folículos pilosos.

El segundo paso del procedimiento es tratar los folículos pilosos con tripsina y se obtienen suspensiones unicelulares. El paso final del procedimiento es clasificar CD 2 71 HNK un ncsc doble positivo mediante citometría de flujo y colocar placas de cultivo. En última instancia, la microscopía de contraste de fase se utiliza para estudiar la formación y el crecimiento de la neurosfera, donde la demostración de estos métodos es fundamental, ya que los pasos verticales de extracción y aislamiento de la salud son difíciles de aprender porque es muy difícil diseccionar la piel y las partículas de salud bajo el microscopio.

Para prepararse para el cultivo, las células madre cubren el fondo de cada pocillo de una placa de seis pocillos con poli licina, deje que las placas se sequen en la campana. Una vez que los pozos estén secos, enjuague con agua estéril y aspire, luego deje que los pozos se sequen nuevamente. Cubra las placas con la solución de 0,17 miligramos por mililitro de fibronectina.

Luego, antes de que la fibronectina se seque en la placa en el medio de cultivo NCSC, prepare y tenga a mano los siguientes medios y reactivos. 97%D-M-E-M-F 12 2%B 27 suplemento 1%y dos suplementos B-F-G-F-E-G-F IGF uno y diss. Recoja piel fresca de cuero cabelludo humano adulto de procedimientos de estiramiento facial o tejido fetal del cuero cabelludo y lávela con PBS que contiene penicilina estreptomicina.

Transfiera la piel a tubos de 50 mililitros y se incube en DMEM con 10 miligramos por mililitro de espacio DIS a 37 grados Celsius durante dos a cuatro horas o toda la noche a cuatro grados Celsius. A continuación, transfiera la piel a una placa de Petri esterilizada y retire los pelos de la piel agarrando el tallo del cabello cerca de la superficie de la piel y tirando firme y suavemente. Los folículos pilosos mostrarán una morfología de orgen de antígenos, incubarán los fragmentos de folículos aislados en viajes al 0,05% en EDTA durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente con agitación ocasional.

A continuación, añade cuatro mililitros de DMEM con un 10%FBS para detener la reacción. A continuación, pase el epitelio folicular a través de un filtro de 40 micras para obtener una suspensión unicelular que contenga células de diferentes tamaños y formas. A continuación, gire la suspensión a 200 veces G durante cinco minutos.

Deseche con cuidado el sobrenadante S y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS con 2% de FBS Para aislar N CSC utilizando primero los hechos, etiquete las células con anticuerpos contra una integrina alfa cuatro conjugada conjugada con PC CD 2 71 FE C hnk one o CD 2 71 PE conjugada incubando en hielo durante 40 minutos en la centrífuga oscura a 200 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente y aspire el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en PBS que contengan 2%FBS y dos microgramos por mililitro. Yoduro de propidio para expulsar las células muertas.

Realice la clasificación celular por citometría de flujo y recoja el cultivo de células CD 2 71 H y K un doble positivo o CD 2 71 alfa cuatro integrinas doble positivas. Las células en placas de fijación ultra bajas en medio NCSC, cambiando el medio una vez al día. Revise el cultivo celular todos los días bajo el microscopio.

NCSC comenzará a formar pequeños agregados flotantes después de varios días y esferas bien formadas en dos a cinco semanas en el cultivo, dependiendo de la edad de los donantes. El crecimiento aparecerá en unos pocos días en la región de protuberancia y las esferas bien formadas in situ en varias semanas cuando se cultiven folículos pilosos completos en el medio NCSC. Para expandir los cultivos de NCSC, lave las células una vez con PBS precalentado dos veces en EDTA a 37 grados Celsius.

Luego agréguelo a las células durante siete a 15 minutos para que la célula madre del folículo del granizo se desprenda. Para detener los disparos, AGREGUE DMEM con 10%FBS, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para dispersar las células. A continuación, gire a 200 veces G durante cinco minutos.

Re suspender las células en medio NCSC y placas recubiertas de cultivo y fibronectina a 37 grados centígrados. Cultura NCSC. El medio es suficiente para mantener el NCSC humano en un estado indiferenciado.

Sin la necesidad de células alimentadoras, los queratinocitos no proliferarán y morirán gradualmente en el medio. Algunas pequeñas células redondas proliferarán y formarán pequeños agregados en suspensión. Después de tres a cinco días, estos agregados flotantes aumentan lentamente de tamaño generando estructuras tridimensionales similares a esferas, denominadas esferas de cabello.

Cuando se cultivan placas codificadas, las N CSC se adhieren a la superficie y crecen más rápido que las células formadoras de esferas en suspensión, tanto las células madre formadoras de esferas como las células madre adheridas. Exprese los marcadores NCSC: cuando se cultivan folículos pilosos completos, se forman esferas en el área correspondiente a la región de la protuberancia. Después de ver el video, debe tener una buena comprensión de cómo aislarse y cultivar.

Célula madre neuro primaria de los tejidos del cuero cabelludo del herma.