Name: El aislamiento de células primarias de ratón trofoblasto y ensayo de invasión trofoblasto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprende a aislar células trofoblásticas primarias de placenta de ratón mediante digestión enzimática y gradiente de densidad Percoll. Este protocolo incluye el ensayo de invasión en matrigel para estudiar la biología placentaria.

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Los autores desean dar las gracias al equipo de Servicios Creativos de la Universidad de Missouri Centro de Apoyo Académico quien produjo este video. Este trabajo fue apoyado por el Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Development Humanos y de Salud de los Institutos Nacionales de Salud, el número de concesión HD055231

1. La disección de la placenta del ratón <ol><li> Configure parejas de apareamiento de ratones. </li><li> En cada uno de los días siguientes, para comprobar la presencia de un tapón copulatorio. El día en el que se detecta un enchufe se considera 0,5 días post-coito (dpc) 7. </li><li> Placentas puede ser recogida en la etapa deseada del embarazo, con una disección limpia de la placenta principio posible con el desarrollo de la placenta madura en d 10,5. Aquí, demostramos 14,5 dpc. En los volúmenes dados, 40-60 placentas en 10,5 dpc, y 10-20 en placentas 14,5 dpc dará lugar a una capa de células del trofoblasto claramente visible. </li><li> Sacrificar al ratón embarazada, y extirpar el útero, el corte en el cuello uterino, ya lo largo de la mesometrium. </li><li> Con unas tijeras afiladas, corte entre cada embrión (Figura 1A). </li><li> Utilizando dos pares de pinzas, sujete la pared uterina en el borde cortado, y tire de ellos, la eliminación del miometrio (Figura 1B) . Un par de sierra, fórceps moderadamente finas (curvo o recto), más un par de pinzas muy finas (# 5, por ejemplo) se recomienda. </li><li> Frente a la placenta, abra la decidua con pinzas o tijeras, exponiendo placenta. Agarrando el tejido uterino con un par pinzas, fórceps deslizar otra debajo de la placenta se separe (Figura 1 C). Si el feto es necesario, independiente y membranas fetales de la placenta. No es posible eliminar todo el tejido decidual por disección sin perder también tejido de la placenta, pero el tejido decidual adicional (pálido) se puede quitar de la superficie de la placenta suavemente peeling con fórceps. Vamos a confiar en el gradiente de Percoll para una purificación adicional. </li><li> Coloque cada placenta disecado en 25 ml de hielo frío tampón de disociación en un tubo cónico de 50 ml hasta que todas las disecciones se han completado. En etapas posteriores, toscamente picada tejido de la placenta con unas tijeras o una cuchilla de afeitar antes de la transferencia en tampón de disociación. </li></ol>tle "2&gt;. Aislamiento de células trofoblásticas <ol><li> Sin apretar la tapa cónica del tubo y colocarlo en un baño a 37 ° C durante 45-60 minutos. Mezclar la solución de disociación vigorosamente pipeteando aproximadamente cada 10 min. El tiempo total de digestión deben ser monitoreados de cerca y es probable que requiera un poco de ensayo y error para lograr una recuperación óptima de la célula. Los tejidos deben ser capaces de pasar a través de una pipeta de 10 ml, pero las piezas visibles del tejido se mantendrá. Overdigestion resultará en la supervivencia celular y la pobre eficiencia de plaqueo. La supervivencia celular óptima y eficiencia de plaqueo se producirá cuando grupos de unas pocas células están presentes, en lugar de cuando se completa disociación se logra. Por el contrario, underdigestion conducirá a la pureza reducido después de la separación de Percoll. Cuando el punto de digestión se ha alcanzado, tubo lugar en hielo para detener la actividad de colagenasa. </li><li> Pasar la solución a través de un filtro de células para eliminar los materiales no digeridos, y se centrifuga a 500 xg durante 5 minutos. </li><li> Para lavar, quitarsobrenadante y resuspender las células en 10 ml de solución de lavado. Centrifugar a 500 xg durante 5 minutos. </li><li> Durante la centrifugación, preparar la solución de Percoll por mezcla de 9,6 ml de Percoll, 13,4 ml solución de lavado y 1,1 ml de medio de 10 veces en un tubo de 199 ml 50 apropiado para centrifugación de alta velocidad. </li><li> Eliminar celular sobrenadante y resuspender el pellet en 2 ml de solución de lavado. </li><li> Añadir células a Percoll solución y centrifugar @ 30.000 xg durante 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Retire el tubo de centrífuga sin alterar el gradiente. Para visualizar el gradiente, tubo lugar delante de una fuente de luz brillante. Localizar la banda trofoblasto (Figura 2), y aspirar con una pipeta, teniendo cuidado de no alterar la banda de glóbulos rojos por debajo. Volumen de la banda trofoblasto será 5-8 ml. </li><li> Transferir las células trofoblásticas a un tubo cónico de 50 ml. Añadir la solución de lavado a un volumen total de 45 ml. </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 minutos. Retirar el sobrenadante y resuspender en la cultura medium (NCTC-135). Las células pueden ser cultivadas sobre Matrigel de capa fina o de plástico de cultivo de tejidos a 37 º C y 5% CO 2. En el día 10.5, cada placenta produce unas 50.000 células vivas, de las cuales el 80-90% son citoqueratina positiva. </li></ol> 3. Trofoblasto invasión de ensayo <ol><li> Añadir 1-2 ml medio de cultivo (NCTC-135) a cada cámara de matrigel y se incuba a 37 °, 5% de CO 2 durante 30-90 min. </li><li> Retire medio y añadir 1,5 ml x 10 5 células recién aisladas en medio de 2 ml a la cámara superior. Añadir 1 ml de medio de la cámara baja para cubrir la superficie inferior de membrana. </li><li> Células Cultura inserta durante 18-24 horas. </li><li> Células raspar y matrigel de la inserción utilizando un hisopo de espuma. </li><li> Enjuague la parte superior e inferior de la cámara en 2 ml de PBS. </li><li> Arreglo para el 5 min en 1 ml de paraformaldehído al 4% en PBS. </li><li> Stain llenando la cámara inferior con 400 l de DAPI (300 nM) y se incuba durante 30 min. </li><li> Lavar tres veces brevemente en PBS. </li><li quitar las membranas de insertos con una hoja bistur afilado.><li> Añadir una gota de 10 ul de medio de montaje (50% de glicerol en PBS) se deslice. Utilizando pinzas, coloque la membrana en la caída. Añadir otra caída de 10 l de medio, entonces el cubreobjetos con cuidado. </li><li> Fotografía y recuento de células. Asegúrese de orientar la membrana apropiadamente (celda hacia arriba o celda lateral abajo) para el microscopio que se utiliza. Image J software (Institutos Nacionales de Salud) incluye una característica de recuento manual que se puede utilizar para este propósito, al igual que Adobe Photoshop o un contador manual. </li></ol> 4. Los resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Disección de la placenta del ratón. (A) El útero se elimina por corte a lo largo de los oviductos (amarillo), a lo largo de la superficie mesometrial, y el cuello uterino (la parte inferior). Conceptuses individuales pueden ser separados cortando con tijeras, como se muestra. (B) La uterino pared se elimina mediante la colocación de dos fórceps en la superficie uterina corte, y rasgando a lo largo del lado anti-mesometrial, cerca del feto y lejos de la placenta. (C) La placenta se aísla luego sujetando con una pinza deslizante y otro entre la placenta y el tejido uterino. El cordón umbilical y otras membranas extraembrionarias entonces se puede separar de la placenta. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Percoll separación de las células trofoblásticas. Después de la centrifugación, tres bandas principales será visible como se muestra en la historieta de la izquierda, y una fotografía de la derecha. La banda superior contiene restos celulares y fibroblastos y será más evidente. Un apretado (rojo) banda cerca de la parte inferior que contiene las células rojas de la sangre será visible justo debajo de la banda de trofoblasto difusa. Agregados celulares es probable que se ve en la banda trofoblasto, como en los dos se muestra justo a la izquierda de la flecha en la fotografía. ove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Células invasoras trofoblasto (flecha blanca) pasará a través de la capa de matrigel y los poros de la membrana, aparece en la superficie inferior de la membrana. Los poros son también visibles (negro punta de flecha). El número de células sobre la superficie de la membrana entera o un área de muestra representativa puede ser contada. Una imagen en escala de grises de fluorescencia DAPI nuclear se ha invertido para mejorar la visualización de las células. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Células Figura 4. Trofoblasto puede ser identificada, y la pureza de la población aislada evaluados, por inmunotinción para citoqueratina 7 (centro, magenta). Las células se tiñen con DAPI (arriba, azul). Imagen fusionada inferior.

<ol><li>Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+placental+cell+culture+system+for+studying+the+control+of+mouse+placental+lactogen+II+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion.</a> Placenta. 8, 573-585 (1987).</li>
<li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li>
<li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+characterization%2C+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).</li>
<li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta%3A+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li>
<li>Librach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((92-kD+type+IV+collagenase+mediates+invasion+of+human+cytotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts.</a> J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).</li>
<li>Schulz, L. C., Widmaier, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+leptin+on+mouse+trophoblast+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion.</a> Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

En este video se demuestra el aislamiento de las células trofoblásticas de la placenta del ratón. Luego mostramos un ensayo in vitro para la invasión del trofoblasto. Usando este procedimiento, una gran parte, pero no totalmente, la población pura de células trofoblásticas se puede conseguir. Si se requiere mayor pureza, separación magnética perla o citometría de flujo se pudo realizar, como se ha descrito para las células trofoblásticas humanas primarias. La longitud adecuada de la etapa de colagenasa disociación debe ...

el aislamiento de células primarias de ratón trofoblasto y ensayo de invasión trofoblasto

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

La placenta es responsable del transporte de nutrientes, gases y factores de crecimiento para el feto, así como la eliminación de los desechos. Por lo tanto, los defectos en el desarrollo placentario tienen importantes consecuencias para el feto y la madre, y son una causa principal de la letalidad embrionaria. El principal tipo de células de la parte fetal de la placenta es el trofoblasto. Las células primarias de ratón trofoblasto placentario son una herramienta útil para el estudio de desarrollo de la placenta normal y anormal, y a diferencia de las líneas celulares, se pueden aislar y utilizar para estudiar trofoblasto en etapas específicas del embarazo. Además, los cultivos primarios de trofoblasto de ratones transgénicos pueden ser utilizados para estudiar la función de genes particulares en células de la placenta. El protocolo presentado aquí se basa en la descripción por Thordarson et al. 1, en ​​el que se utiliza un gradiente de Percoll para obtener una población de células relativamente puro trofoblasto de la placenta aislados de ratón. Es similar a utilizar el más ampliamentemétodos para 2-3 d aislamiento humano trofoblasto celular. Pureza puede ser evaluada por tinción inmunocitoquímica de las células aisladas para la citoqueratina 7 4. Aquí, las células aisladas se analizan entonces usando un ensayo de invasión de Matrigel para evaluar la invasividad del trofoblasto in vitro 5-6. Las células invadidas se analizaron mediante inmunocitoquímica y se tiñeron para el recuento.

En este protocolo, se describe la disección de placenta de ratón en el embarazo D10.5, seguido por el aislamiento de las células trofoblásticas utilizando un gradiente de Percoll. A continuación, demostrar el uso de las células aisladas en un ensayo de invasión de Matrigel.

El aislamiento de células primarias de ratón trofoblasto y ensayo de invasión trofoblasto

La placenta es responsable del transporte de nutrientes, gases y factores de crecimiento hacia el feto, así como de la eliminación de desechos.
Por lo tanto, los defectos...

El objetivo general de este procedimiento es aislar células trofoblásticas primarias de placenta de ratones para cultivo celular. También demostraremos un uso de estas células: un ensayo de invasión en matri gel. Se extraerá el útero de la rata preñada y se diseccionará la placenta.El tejido placentario será digerido enzimáticamente para obtener células individuales o pequeños agregados celulares; las células se separarán mediante un gradiente de densidad según el protocolo. Se aspirará la banda que contiene las células trofoblásticas y la población celular resultante podrá lavarse y sembrarse. A continuación, demostraremos el ensayo de invasión: las células se siembran sobre una capa de matrigel que recubre una membrana delgada.Las células invasoras digerirán la capa de matrigel y atravesarán los poros de ocho micrómetros en la membrana. Luego, las células se fijan en su lugar y se retira la membrana. Las células invadidas pueden entonces teñirse y contarse.Hola, soy Kathleen Pennington del Laboratorio Schultz en el Departamento de Obstetricia, Ginecología y Salud de la Mujer de la Universidad de Missouri en Columbia, Missouri. Hoy les mostraremos el procedimiento que utilizamos p

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este vídeo, se demuestra el aislamiento de los blastocistos de ratón y la derivación de células madre del trofoblasto de los blastocistos. También describe las condiciones para el mantenimiento de la propiedad de células madre, así como la inducción de diferenciación en la cultura.

Derivación de células madre de ratón a partir de blastocistos Trofoblasto

Este protocolo describe un método para la transfección eficiente siRNA en recién aisladas citotrofoblastos vellosos humanos usando formación de microporos y la identificación de complejos de ADN-proteína en estas células. Las células transfectadas pueden ser monitoreados por Western blot y análisis EMSA durante el tiempo de cultivo de 4 días.

Los análisis de siRNA transfección y EMSA en recién aisladas vellosos citotrofoblastos Humanos

Este manuscrito presenta un modelo in vitro único de células de citotrofoblasto velloso humano inmunopurificadas cultivadas bajo hipoxia/reoxigenación. Este modelo es adecuado para estudiar los efectos protectores de tratamientos prometedores, como la melatonina, sobre las complicaciones del embarazo asociadas con el aumento del estrés oxidativo y la alteración de la función placentaria.

Trofoblasto humana primaria cultivo celular modelo para estudiar los efectos protectores de la melatonina contra la hipoxia / reoxigenación interrupción inducida

Aquí presentamos un protocolo para la conversión directa de fibroblastos embrionarios murinos en células madre trofoblásticas completamente funcionales y estables mediante la sobreexpresión de diez días de Tfap2c, Gata3, Eomes y Ets2.

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Presentamos es un protocolo para el muestreo de tejido velloso placentario humano seguido por el aislamiento de citotrofoblastos para el cultivo celular primario. Tratamiento de trofoblastos con TNFα recapitula la inflamación en el ambiente intrauterino obeso y facilita el descubrimiento de dianas moleculares regulados por inflamación en placentas con obesidad materna.

Un modelo de trofoblasto humano primario para estudiar el efecto de la inflamación asociado con obesidad materna sobre la regulación de la autofagia en la Placenta

Este protocolo muestra un método para el aislamiento de las células decidual humanas primarias recogidas de las membranas fetales de la placenta de término que puede ser utilizada para una variedad de aplicaciones (es decir, inmunocitoquímica, citometría de flujo, etc.) con el objetivo de para estudiar el papel de diferentes poblaciones celulares en complicaciones del embarazo.

Aislamiento de células Decidual humanas primarias de las membranas fetales de la placenta de término

Aquí, presentamos un protocolo altamente accesible para evaluar el movimiento de la célula en células de trofoblasto humano mediante tres ensayos in vitro: el ensayo de rayado, el ensayo de invasión transwell y el ensayo de proliferación celular.

En los ensayos de Vitro para evaluar la migración, invasión y proliferación de las líneas de células inmortalizadas trofoblasto humano de primer trimestre

El ensayo de invasión celular in vitro se utiliza para medir el potencial de la metástasis del cáncer mediante la cuantificación del potencial celular de invasión y migración utilizando inserciones de cultivo celular que contienen matriz proteica. Las células tienen el desafío de migrar a través de la matriz proteica y una membrana porosa, hacia un quimioatractor, y luego cuantificadas por microscopía ligera.

El uso de células tumorales mamarias de ratón en un ensayo de invasión in vitro como medida del comportamiento de las células oncogénicas

Aquí, describimos un método para calentar blastocistos humanos vitrificados, cultivarlos a través del período de implantación in vitro, digerirlos en células individuales y recoger las células trofoblastas tempranas para su posterior investigación.

Colección de células únicas de células trofoblastas en embriones humanos en fase de implantación

El presente protocolo permite la recuperación de estructuras en forma de tubo formadas en el ensayo clásico de formación de tubos de angiogénesis in vitro , donde las células, como las células trofoblásticas, se organizan en estructuras similares a capilares sobre una capa de matriz de membrana basal extracelular. Las estructuras recuperadas se utilizan para el aislamiento de ARN y proteínas para diversos análisis bioquímicos.

Ensayo de recuperación de células trofoblásticas de angiogénesis y formación de tubos para el análisis de la expresión de marcadores de diferenciación

Este protocolo permite la purificación, caracterización y cultivo de trofoblastos extravillosos primarios de HLA-G+ (EVT) de la decidua basal y la membrana coriónica de placentas humanas a término. Los cultivos primarios de EVT mantienen la viabilidad durante 96 horas, permitiendo el cocultivo con células inmunitarias maternas emparejadas por muestras y el posterior análisis citométrico y molecular de flujo de sus interacciones.

Purificación de trofoblastos extravillosos HLA-G+ de tejidos placentarios humanos para fenotipado y análisis funcional

Aprende a aislar células trofoblásticas primarias de placenta de ratón mediante digestión enzimática y gradiente de densidad Percoll. Este protocolo incluye el ensayo de invasión en matrigel para estudiar la biología placentaria.

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