Name: El aislamiento de células primarias de ratón trofoblasto y ensayo de invasión trofoblasto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprende a aislar células trofoblásticas primarias de placenta de ratón mediante digestión enzimática y gradiente de densidad Percoll. Este protocolo incluye el ensayo de invasión en matrigel para estudiar la biología placentaria.

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Los autores desean dar las gracias al equipo de Servicios Creativos de la Universidad de Missouri Centro de Apoyo Académico quien produjo este video. Este trabajo fue apoyado por el Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Development Humanos y de Salud de los Institutos Nacionales de Salud, el número de concesión HD055231

1. La disección de la placenta del ratón <ol><li> Configure parejas de apareamiento de ratones. </li><li> En cada uno de los días siguientes, para comprobar la presencia de un tapón copulatorio. El día en el que se detecta un enchufe se considera 0,5 días post-coito (dpc) 7. </li><li> Placentas puede ser recogida en la etapa deseada del embarazo, con una disección limpia de la placenta principio posible con el desarrollo de la placenta madura en d 10,5. Aquí, demostramos 14,5 dpc. En los volúmenes dados, 40-60 placentas en 10,5 dpc, y 10-20 en placentas 14,5 dpc dará lugar a una capa de células del trofoblasto claramente visible. </li><li> Sacrificar al ratón embarazada, y extirpar el útero, el corte en el cuello uterino, ya lo largo de la mesometrium. </li><li> Con unas tijeras afiladas, corte entre cada embrión (Figura 1A). </li><li> Utilizando dos pares de pinzas, sujete la pared uterina en el borde cortado, y tire de ellos, la eliminación del miometrio (Figura 1B) . Un par de sierra, fórceps moderadamente finas (curvo o recto), más un par de pinzas muy finas (# 5, por ejemplo) se recomienda. </li><li> Frente a la placenta, abra la decidua con pinzas o tijeras, exponiendo placenta. Agarrando el tejido uterino con un par pinzas, fórceps deslizar otra debajo de la placenta se separe (Figura 1 C). Si el feto es necesario, independiente y membranas fetales de la placenta. No es posible eliminar todo el tejido decidual por disección sin perder también tejido de la placenta, pero el tejido decidual adicional (pálido) se puede quitar de la superficie de la placenta suavemente peeling con fórceps. Vamos a confiar en el gradiente de Percoll para una purificación adicional. </li><li> Coloque cada placenta disecado en 25 ml de hielo frío tampón de disociación en un tubo cónico de 50 ml hasta que todas las disecciones se han completado. En etapas posteriores, toscamente picada tejido de la placenta con unas tijeras o una cuchilla de afeitar antes de la transferencia en tampón de disociación. </li></ol>tle "2&gt;. Aislamiento de células trofoblásticas <ol><li> Sin apretar la tapa cónica del tubo y colocarlo en un baño a 37 ° C durante 45-60 minutos. Mezclar la solución de disociación vigorosamente pipeteando aproximadamente cada 10 min. El tiempo total de digestión deben ser monitoreados de cerca y es probable que requiera un poco de ensayo y error para lograr una recuperación óptima de la célula. Los tejidos deben ser capaces de pasar a través de una pipeta de 10 ml, pero las piezas visibles del tejido se mantendrá. Overdigestion resultará en la supervivencia celular y la pobre eficiencia de plaqueo. La supervivencia celular óptima y eficiencia de plaqueo se producirá cuando grupos de unas pocas células están presentes, en lugar de cuando se completa disociación se logra. Por el contrario, underdigestion conducirá a la pureza reducido después de la separación de Percoll. Cuando el punto de digestión se ha alcanzado, tubo lugar en hielo para detener la actividad de colagenasa. </li><li> Pasar la solución a través de un filtro de células para eliminar los materiales no digeridos, y se centrifuga a 500 xg durante 5 minutos. </li><li> Para lavar, quitarsobrenadante y resuspender las células en 10 ml de solución de lavado. Centrifugar a 500 xg durante 5 minutos. </li><li> Durante la centrifugación, preparar la solución de Percoll por mezcla de 9,6 ml de Percoll, 13,4 ml solución de lavado y 1,1 ml de medio de 10 veces en un tubo de 199 ml 50 apropiado para centrifugación de alta velocidad. </li><li> Eliminar celular sobrenadante y resuspender el pellet en 2 ml de solución de lavado. </li><li> Añadir células a Percoll solución y centrifugar @ 30.000 xg durante 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Retire el tubo de centrífuga sin alterar el gradiente. Para visualizar el gradiente, tubo lugar delante de una fuente de luz brillante. Localizar la banda trofoblasto (Figura 2), y aspirar con una pipeta, teniendo cuidado de no alterar la banda de glóbulos rojos por debajo. Volumen de la banda trofoblasto será 5-8 ml. </li><li> Transferir las células trofoblásticas a un tubo cónico de 50 ml. Añadir la solución de lavado a un volumen total de 45 ml. </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 minutos. Retirar el sobrenadante y resuspender en la cultura medium (NCTC-135). Las células pueden ser cultivadas sobre Matrigel de capa fina o de plástico de cultivo de tejidos a 37 º C y 5% CO 2. En el día 10.5, cada placenta produce unas 50.000 células vivas, de las cuales el 80-90% son citoqueratina positiva. </li></ol> 3. Trofoblasto invasión de ensayo <ol><li> Añadir 1-2 ml medio de cultivo (NCTC-135) a cada cámara de matrigel y se incuba a 37 °, 5% de CO 2 durante 30-90 min. </li><li> Retire medio y añadir 1,5 ml x 10 5 células recién aisladas en medio de 2 ml a la cámara superior. Añadir 1 ml de medio de la cámara baja para cubrir la superficie inferior de membrana. </li><li> Células Cultura inserta durante 18-24 horas. </li><li> Células raspar y matrigel de la inserción utilizando un hisopo de espuma. </li><li> Enjuague la parte superior e inferior de la cámara en 2 ml de PBS. </li><li> Arreglo para el 5 min en 1 ml de paraformaldehído al 4% en PBS. </li><li> Stain llenando la cámara inferior con 400 l de DAPI (300 nM) y se incuba durante 30 min. </li><li> Lavar tres veces brevemente en PBS. </li><li quitar las membranas de insertos con una hoja bistur afilado.><li> Añadir una gota de 10 ul de medio de montaje (50% de glicerol en PBS) se deslice. Utilizando pinzas, coloque la membrana en la caída. Añadir otra caída de 10 l de medio, entonces el cubreobjetos con cuidado. </li><li> Fotografía y recuento de células. Asegúrese de orientar la membrana apropiadamente (celda hacia arriba o celda lateral abajo) para el microscopio que se utiliza. Image J software (Institutos Nacionales de Salud) incluye una característica de recuento manual que se puede utilizar para este propósito, al igual que Adobe Photoshop o un contador manual. </li></ol> 4. Los resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Disección de la placenta del ratón. (A) El útero se elimina por corte a lo largo de los oviductos (amarillo), a lo largo de la superficie mesometrial, y el cuello uterino (la parte inferior). Conceptuses individuales pueden ser separados cortando con tijeras, como se muestra. (B) La uterino pared se elimina mediante la colocación de dos fórceps en la superficie uterina corte, y rasgando a lo largo del lado anti-mesometrial, cerca del feto y lejos de la placenta. (C) La placenta se aísla luego sujetando con una pinza deslizante y otro entre la placenta y el tejido uterino. El cordón umbilical y otras membranas extraembrionarias entonces se puede separar de la placenta. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Percoll separación de las células trofoblásticas. Después de la centrifugación, tres bandas principales será visible como se muestra en la historieta de la izquierda, y una fotografía de la derecha. La banda superior contiene restos celulares y fibroblastos y será más evidente. Un apretado (rojo) banda cerca de la parte inferior que contiene las células rojas de la sangre será visible justo debajo de la banda de trofoblasto difusa. Agregados celulares es probable que se ve en la banda trofoblasto, como en los dos se muestra justo a la izquierda de la flecha en la fotografía. ove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Células invasoras trofoblasto (flecha blanca) pasará a través de la capa de matrigel y los poros de la membrana, aparece en la superficie inferior de la membrana. Los poros son también visibles (negro punta de flecha). El número de células sobre la superficie de la membrana entera o un área de muestra representativa puede ser contada. Una imagen en escala de grises de fluorescencia DAPI nuclear se ha invertido para mejorar la visualización de las células. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Células Figura 4. Trofoblasto puede ser identificada, y la pureza de la población aislada evaluados, por inmunotinción para citoqueratina 7 (centro, magenta). Las células se tiñen con DAPI (arriba, azul). Imagen fusionada inferior.

<ol><li>Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+placental+cell+culture+system+for+studying+the+control+of+mouse+placental+lactogen+II+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion.</a> Placenta. 8, 573-585 (1987).</li>
<li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li>
<li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+characterization%2C+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).</li>
<li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta%3A+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li>
<li>Librach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((92-kD+type+IV+collagenase+mediates+invasion+of+human+cytotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts.</a> J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).</li>
<li>Schulz, L. C., Widmaier, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+leptin+on+mouse+trophoblast+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion.</a> Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

En este video se demuestra el aislamiento de las células trofoblásticas de la placenta del ratón. Luego mostramos un ensayo in vitro para la invasión del trofoblasto. Usando este procedimiento, una gran parte, pero no totalmente, la población pura de células trofoblásticas se puede conseguir. Si se requiere mayor pureza, separación magnética perla o citometría de flujo se pudo realizar, como se ha descrito para las células trofoblásticas humanas primarias. La longitud adecuada de la etapa de colagenasa disociación debe ...

el aislamiento de células primarias de ratón trofoblasto y ensayo de invasión trofoblasto

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

La placenta es responsable del transporte de nutrientes, gases y factores de crecimiento para el feto, así como la eliminación de los desechos. Por lo tanto, los defectos en el desarrollo placentario tienen importantes consecuencias para el feto y la madre, y son una causa principal de la letalidad embrionaria. El principal tipo de células de la parte fetal de la placenta es el trofoblasto. Las células primarias de ratón trofoblasto placentario son una herramienta útil para el estudio de desarrollo de la placenta normal y anormal, y a diferencia de las líneas celulares, se pueden aislar y utilizar para estudiar trofoblasto en etapas específicas del embarazo. Además, los cultivos primarios de trofoblasto de ratones transgénicos pueden ser utilizados para estudiar la función de genes particulares en células de la placenta. El protocolo presentado aquí se basa en la descripción por Thordarson et al. 1, en ​​el que se utiliza un gradiente de Percoll para obtener una población de células relativamente puro trofoblasto de la placenta aislados de ratón. Es similar a utilizar el más ampliamentemétodos para 2-3 d aislamiento humano trofoblasto celular. Pureza puede ser evaluada por tinción inmunocitoquímica de las células aisladas para la citoqueratina 7 4. Aquí, las células aisladas se analizan entonces usando un ensayo de invasión de Matrigel para evaluar la invasividad del trofoblasto in vitro 5-6. Las células invadidas se analizaron mediante inmunocitoquímica y se tiñeron para el recuento.

En este protocolo, se describe la disección de placenta de ratón en el embarazo D10.5, seguido por el aislamiento de las células trofoblásticas utilizando un gradiente de Percoll. A continuación, demostrar el uso de las células aisladas en un ensayo de invasión de Matrigel.

El aislamiento de células primarias de ratón trofoblasto y ensayo de invasión trofoblasto

La placenta es responsable del transporte de nutrientes, gases y factores de crecimiento hacia el feto, así como de la eliminación de desechos.
Por lo tanto, los defectos...

El objetivo general de este procedimiento es aislar células trofoblásticas primarias de placenta de ratones para cultivo celular. También demostraremos un uso de estas células: un ensayo de invasión en matri gel. Se extraerá el útero de la rata preñada y se diseccionará la placenta.El tejido placentario será digerido enzimáticamente para obtener células individuales o pequeños agregados celulares; las células se separarán mediante un gradiente de densidad según el protocolo. Se aspirará la banda que contiene las células trofoblásticas y la población celular resultante podrá lavarse y sembrarse. A continuación, demostraremos el ensayo de invasión: las células se siembran sobre una capa de matrigel que recubre una membrana delgada.Las células invasoras digerirán la capa de matrigel y atravesarán los poros de ocho micrómetros en la membrana. Luego, las células se fijan en su lugar y se retira la membrana. Las células invadidas pueden entonces teñirse y contarse.Hola, soy Kathleen Pennington del Laboratorio Schultz en el Departamento de Obstetricia, Ginecología y Salud de la Mujer de la Universidad de Missouri en Columbia, Missouri. Hoy les mostraremos el procedimiento que utilizamos para aislar células trofoblásticas primarias de ratones preñados. Luego, demostraremos el ensayo de invasión que usamos para probar las células.Utilizamos estos procedimientos para estudiar los factores que influyen en el desarrollo de las células trofoblásticas placentarias y su capacidad para invadir una matriz extracelular. Comencemos. Primero, prepare parejas de apareamiento de ratones en cada uno de los siguientes días.Verifique la presencia de un tapón copulador. El día en que se detecta un tapón se considera el día 0,5.La placenta poscoito puede recolectarse en la etapa deseada del embarazo. Aquí demostraremos la disección de una placenta de día 14,5 sobre la mesa de trabajo. Sin embargo, puede requerirse un microscopio para visualizar los tejidos. En etapas más tempranas, localice el útero y luego corte en la unión uterotubárica.Continúe eliminando la grasa y los vasos sanguíneos, cortando en el cuello uterino y en la otra unión de túbulos. Para extraer el útero, transfiera el útero a una placa de Petri limpia utilizando tijeras afiladas. Separe cada concepto. Una vez separado, transfiera cada concepto a un recipiente limpio.El feto se encuentra hacia el lado anti-miometrial desde la placenta. La placenta se sitúa a lo largo del lado meso del útero. Utilice un par de fórceps para sujetar el útero cerca de la cara cortada.Retire cuidadosamente los dos pares de pinzas en direcciones opuestas, rasgando la pared uterina a lo largo del lado anti-miometrial. Esto generalmente también romperá las membranas. Deje al feto claramente visible en la parte superior, con la placenta roja debajo y el tejido uterino blanco.Debajo de eso, use pinzas finas para separar el cordón fetal y el tejido amniótico de la placenta. Sujete el tejido uterino con un par de pinzas y pase el otro par entre la placenta y el tejido uterino subyacente. En este momento, se puede eliminar el tejido decidual excesivo de la placenta.Sin embargo, es probable que algunas células decidual permanezcan. Coloque cada placenta diseccionada en un tampón de disociación frío con hielo hasta que se completen todos los disecciones. Cuando las disecciones estén completas, tape ligeramente el tubo cónico que contiene la placenta y la solución de disociación y colóquelo en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 45 a 60 minutos.Después de 10 minutos, mezcle la solución de disociación pipeteando vigorosamente hacia arriba y hacia abajo, y supervise cuidadosamente el progreso de la digestión. La duración adecuada del paso de disociación con colagenasa debe determinarse en cada experimento y se aprenderá con la experiencia. Una sobredigestión reducirá severamente la recuperación celular, mientras que una digestión insuficiente puede provocar una pureza reducida, así como un menor número de células.Detenga la reacción cuando queden pocos fragmentos de tejido sin digerir. Pase la solución a través de un filtro para células para eliminar los materiales no digeridos y centrifugue a 500 veces G durante cinco minutos para obtener el sedimento de células placentarias. A continuación, lave las células.Para eliminar la solución de disociación. Retire el snat y resuspenda las células en 10 ml de solución de lavado; centrifugue a 500 ×g durante cinco minutos. Mientras tanto, prepare la solución para célula agregando 9,6 ml de per call y 13,4 ml de solución de lavado en un tubo adecuado para centrifugación de alta velocidad.Añada 1,1 mL de medio 10x, 1 99 para preparar la solución por célula, invierta el tubo para mezclar. Después de la centrifugación y la solución de lavado, retire el sobrenadante y re suspenda el botón celular. En dos mL de solución de lavado, añada las células a la solución del protocolo y mezcle para crear el gradiente. Centrifugue a 20.000 × g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius, retire el tubo de la centrífuga sin perturbar el gradiente.El gradiente puede visualizarse más fácilmente sosteniendo el tubo frente a una fuente de luz. Una banda blanca que contiene principalmente restos celulares será visible cerca de la parte superior del tubo y una banda de glóbulos rojos probablemente será visible cerca de la parte inferior del tubo. Justo encima.Esta es la banda de trofoblasto. Aspire el medio hasta justo por encima de la banda de trofoblasto y deseche. Luego, utilizando una pipeta, transfiera la Banda de Trofoblasto a un tubo de centrífuga limpio que contenga 35 ml de solución de lavado y centrifugue a 500 veces G durante cinco minutos.Para obtener el sedimento de las células trofoblásticas, re-suspenda el pellet en medio de cultivo para trofoblastos. Aquí, las células se cultivarán en cámaras de invasión en una placa de seis pocillos. Las cámaras de Matrigel se han lavado previamente según las instrucciones del fabricante; agregue mediante pipeta de 0,5 a 1 ml de medio de cultivo en el pocillo debajo de cada inserto.Luego, agregue 1,5 veces 10 a la quinta células en una cantidad de medio al compartimiento. Incube a 37 grados Celsius y 5 %CO2. Retire los compartimientos de invasión del incubador después de 18 a 24 horas.Elimine el medio de cultivo y enjuague las cámaras tres veces con PBS durante cinco minutos cada vez, suavemente pero a fondo. Raspe las células y el gel principal de la superficie superior del inserto. Utilizando un hisopo de algodón, fije las células invadidas en la superficie inferior de la membrana llenando el pocillo con solución de paraformaldehído al 4% e incubando durante cinco minutos.Lave tres veces con PBS. Tiña las células invadidas llenando el pocillo con un colorante nuclear como dappy. Incube durante 20 minutos.Vuelva a lavar tres veces con PBS. Añada una gota de medio de montaje a un portaobjetos utilizando una hoja de bisturí y retire cuidadosamente la membrana de la cámara de invasión usando pinzas. Transfiera la membrana al portaobjetos con las células orientadas hacia arriba.Coloque la membrana sobre la gota. Tenga cuidado de evitar burbujas de aire. Añada otra gota de medio de montaje y luego la cubreobjetos.Observe con cuidado y fotografíe las células invadidas sobre la superficie de la membrana. En la figura, se observa que las células trofoblásticas invasivas atravesarán la capa de matrigel y los poros de la membrana, apareciendo en la superficie inferior de esta. Los poros también pueden ser visibles.El número de células invadidas se puede contar y comparar entre grupos de tratamiento manualmente o mediante el uso de software informático. Además de las tinciones nucleares, puede utilizarse inmunocitoquímica para caracterizar las células invadidas. Aquí hemos utilizado un anticuerpo contra la citoqueratina 7 para confirmar que las células son trofoblastos.Hemos demostrado el aislamiento de células trofoblásticas a partir de la placenta de ratón. Luego mostramos un ensayo in vitro para la invasión trofoblástica. Mediante este procedimiento, se pueden obtener poblaciones de células trofoblásticas en gran parte, aunque no completamente, puras.Si se requiere una mayor pureza, se podría realizar la separación con perlas magnéticas o la citometría de flujo, tal como se ha descrito para células trofoblásticas humanas primarias. Aunque mostramos el uso de cámaras de invasión con matri gel preparadas comercialmente, también se pueden preparar agregando matri gel a cámaras transwell sin recubrir, en el grosor deseado. Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Aprende a aislar células trofoblásticas primarias de placenta de ratón mediante digestión enzimática y gradiente de densidad Percoll. Este protocolo incluye el ensayo de invasión en matrigel para estudiar la biología placentaria.

El aislamiento de células primarias de ratón trofoblasto y ensayo de invasión trofoblasto

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