Name: Imágenes de la adhesión de leucocitos al endotelio vascular en la presión intraluminal de alta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Aprende a visualizar la adhesión de leucocitos al endotelio vascular en arterias presurizadas ex vivo. Este método permite estudiar la inflamación en condiciones de alta presión intraluminal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudio fue apoyado en parte por el Programa del Gobierno de Victoria OIS, la Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia subvenciones de programas y proyectos (JPF Chin-Quitar el polvo) y becas de postgrado (D Michell).

1. Aislamiento de las arterias carótidas <ol><li> Euthanase10 semanas de edad ratas Sprague Dawley a través de CO 2 / O 2 asfixia. </li><li> Los impuestos especiales a la izquierda y la derecha arterias carótidas comunes con la aorta y el corazón de garantizar un mínimo de estiramiento de los vasos. </li><li> En el hielo frío buffer Krebs separar las arterias carótidas de la aorta y el corazón y llevar a cabo la disección de cerca. </li><li> Mantener los vasos aislados en Krebs en el hielo antes de su montaje. </li></ol> Aprox. tiempo = 45 minutos 2. Cebado de la cámara de buques <ol><li> En los conectores proximales y distales de la cámara de recipiente tampón Krebs ras mantiene a un pH fisiológico mediante la infusión de gas carbogen (95% O 2, 5% CO 2) a través del buffer a 37 ° C. </li><li> Asegúrese de que los tubos y cánulas se vacían por completo y están alineados. </li><li> Ras buffer Krebs a través de la P1 (proximal) y transductores P2 (distal). Cerrar los grifos para asegurar que no burbujas de aire en los transductores. </li><li> Conecte los transductores a los conectores correspondientes y una vez más al ras más tampón de Krebs asegurando que no haya burbujas de aire. Cerrar los grifos de la cámara. </li></ol> Aprox. tiempo = 15 minutos 3. Presurización de la cámara de buques <ol><li> A su vez sobre equipos a presión: la presión servo, control de la presión, la bomba peristáltica (Figura 1). </li><li> Con la bomba peristáltica en la presión y el motor de la presión en automático ejecutar buffer Krebs a través del tubo de 20 mm Hg (dial a 1), asegurando que no haya burbujas de aire. </li><li> Conecte el tubo del transductor P2 cerrado. La presión será estable. </li><li> Abra el grifo P2 a la cámara de recipiente para eliminar cualquier burbuja de entonces se cierra. </li><li> Llene la bañera con buffer Krebs (5-7 ml). </li></ol> Aprox. tiempo = 10 minutos 4. Montaje de la embarcación <ol><li> Bajo un microscopio de disección lazos lugar poliéster de color negro en cada cánula (Figura 2). </li><li> Mueva las cánulas y los titulares de la cánula aparte y montar vaso ¼ (aórtica final del arco) en la cánula P1. Asegúrese de no romper el barco. </li><li> Utilizando una jeringa llena de Krebs buffer lave cuidadosamente el exceso de sangre fuera de los vasos a través de transductor P1. Cerca de P1 a la cámara. </li><li> Recipiente seguro a la cánula P1 con la corbata de poliéster. </li><li> Mueva cánulas / los titulares de la cánula más para el montaje en la cánula P2. </li><li> Montaje final distal del vaso (~ ¼ de la longitud) en la cánula distal. Seguro con corbata de poliéster. </li></ol> Aprox. tiempo = 20 minutos 5. Presurización de la nave <ol><li> Ajustar los titulares de la cánula para asegurar que no doblarse o estirarse en el vaso. </li><li> Con P1 y P2 cerrada a la cámara de cambiar el servo de la presión de automático a manual. Compruebe la presión en el servo no hay una disminución continua de la presión dentro de los 10 segundos. Si hay una fuga que está ocurriendo y las conexiones y los transductores deben ser garantizados en su lugar. </li><li> Ajustar el servo de presión de nuevo a P2 automática a continuación, abra la cámara. Bajo el microscopio observe el buque se dilatan cuando el grifo está abierto a la cámara. </li><li> Cambiar el servo a la presión manual. Una vez más compruebe continua disminución de la presión dentro de los 10 segundos. Si hay una fuga, entonces el sistema no es a prueba de presión y no es probable que sea un agujero en el barco. </li><li> Volver a abrir P1 automático de la cámara. En la configuración manual de comprobar que la presión se mantiene estable. </li><li> Si no hay fuga, en el dial de ajuste manual de aumentar a 2 (40 mmHg). </li><li> Ajuste automático de la nave y observar bajo el microscopio. Si es necesario, ajustar el titular de la cánula para asegurar que no se doble en el que no haya fugas vessel.Check sobre la configuración manual. </li><li> Repita los pasos 5,6 a 5,7 el aumento de la línea de 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) y así sucesivamente hasta que la presión deseada. </li></ol> Aprox. tiempo = 15 - 30 minutos 6. La incubación de la embarcación a presión <ol><li> Conecte el conjunto de control de temperatura a 37 ° C. </li><li> Con una segunda bomba peristáltica perfusión Krebs buffer (1 ml / min) en el baño de la cámara de los buques. </li><li> Conecte la cámara de aspiración para asegurar que sólo la capa superior de la bañera se ha eliminado. </li><li> Incubar recipiente presurizado a 37 ° C durante 1 hora con la presión establecida en automático. </li><li> Compruebe la presión no tiene fugas (el cambio a manual) de forma periódica. </li><li> Los efectos de diversas intervenciones farmacológicas se puede observar mediante la simple adición del compuesto al baño durante la incubación. </li></ol> Aprox. = tiempo de 1 hora 7. Perfusión del recipiente a presión con sangre entera <ol><li> Durante la incubación obtener al menos 7,5 ml de sangre humana / buque recogidos en 40 U de heparina / ml de sangre. Incubar en un falcon de 50 ml a 37 ° C. </li><li> 10 minutos antes del final de tque la sangre de incubación etiqueta con VybrantDil (1:1000) durante 10 minutos a 37 ° C en la oscuridad. </li><li> Después de 10 minutos, recoger la sangre en una jeringa claro que las burbujas y colocar en una bomba de jeringa con una chaqueta de calor a 37 ° C. </li><li> Cierre transductor P1 a la cámara / buque y conectar la jeringa y tubo de drenaje. </li><li> Purga de sangre a 1000 l / min a través del tubo de drenaje para eliminar las burbujas. </li><li> Abrir P1 a la cámara. El servo de presión se ajustará automáticamente para mantener la presión deseada. </li><li> Perfusión de sangre a 100 l / min. </li><li> Utilizando un microscopio de fluorescencia acoplado a una cámara digital de registro de dos campos de la embarcación perfusión durante 15 segundos a 1, 3, 5, 7,5 y 10 minutos. </li><li> Integridad después de la perfusión y la función endotelial se puede evaluar a través de técnicas farmacológicas, como miografía y la expresión de moléculas de adhesión se puede determinar mediante técnicas de inmunohistoquímica para validar aún más la respuesta inflamatoria. </li></ol> Aprox. tiempo = 15 minutos 8. Los resultados representativos: Un diagrama esquemático de la configuración de la cámara de presión se muestra en la Figura 1. Con una cámara digital acoplada a un microscopio de fluorescencia resultados se pueden visualizar al instante a través de grabaciones de video en vivo. Representante imágenes de vídeo se ven en la figura 3, donde los leucocitos se consideran para ser adherente al endotelio si se mantuvo estacionario durante 10 segundos. Con grabaciones de vídeo en bucle continuo células adheridas se puede contar como un campo de media por habitante. Mientras tanto baja (Figura 3) y alto (Figura 3 B) presión provocará una cierta cantidad de adhesión de un aumento significativo en la adhesión de leucocitos a la mayor presión intraluminal se ve y esto también se demuestra cuantitativamente (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Vivo a presión ex buque de la cámara de esquema. Un buque cánula conectada a una proximal (P1) y un transductor distal (P2) que permite a los transductores de presión de la sangre para ser manipulados dentro del recipiente. La perfusión es a través del transductor de presión P1 y se mantiene a través del transductor P2. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cannuala con lazos. Negro corbatas de poliéster están conectados unos con cánula. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Representante imágenes de vídeo. Adhesión celular dinámico (flecha roja) en fluorescencia a 80 mmHg (A) y mmHg 120 (B) después de 10 minutos de la perfusión. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Adhesión leucocitaria en las arterias carótidas Sprague Dawley después de 1 hora de incubación a baja (80 mmHg) y alta presión (120 mmHg). *** P &lt;0,001, según el análisis de medidas repetidas de 2 vías ANOVA utilizando el test post hoc de Bonferroni.

<ol><li>Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+burden+of+disease+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional burden of disease and risk factors.</a> Lancet. 367, 1747-1757 (2001).</li>
<li>Szczech, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+kidney+injury+and+cardiovascular+outcomes+in+acute+severe+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension.</a> Circulation. 121, 2183-2191 Forthcoming.</li>
<li>Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+elevated+blood+pressure+and+its+management+on+the+short-term+outcome+of+patients+with+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke.</a> Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).</li>
<li>Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progression+from+hypertension+to+congestive+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The progression from hypertension to congestive heart failure.</a> JAMA. 275, 1557-1562 (1996).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Riou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+pressure+promotes+monocyte+adhesion+to+the+vascular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall.</a> Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).</li>
<li>Ley, K., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial%2C+not+hemodynamic%2C+differences+are+responsible+for+preferential+leukocyte+rolling+in+rat+mesenteric+venules.+Circ+Res%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res.</a> 69, 1034-1041 (1991).</li>
<li>Bernhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIF+is+a+noncognate+ligand+of+CXC+chemokine+receptors+in+inflammatory+and+atherogenic+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment.</a> Nat Med. 13, 587-596 (2007).</li>
<li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).</li>
<li>Eberth, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+pulsatility+in+hypertensive+carotid+artery+growth+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling.</a> J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).</li>
<li>Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+activates+an+endothelial+potassium+channel+to+release+an+endogenous+nitrovasodilator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator.</a> J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).</li>
</ol>

El protocolo del estudio fue aprobado por la Investigación y Educación Médica Alfred Recinto Comité de Ética Animal y el Alfred Hospital del Comité de Ética.

Este es un método modificado para estudiar la adhesión de leucocitos con el endotelio de los vasos sanguíneos intactos aislados bajo condiciones de presión en tiempo real. La perfusión de la cámara de recipiente solo permite una rápida validación de pro-inflamatorias cepas de ratones grandes y los vasos de la rata. Permitiendo la manipulación de la presión permite interacciones dinámicas que se observan células de menor a mayor presión intraluminal muy altos, lo que mejor imitan-ción fisiológica y condiciones fisiopatológicas. Diámetro de los vasos también se puede medir con un número suficiente de células de imágenes del programa y por lo tanto, el flujo de corte y la velocidad puede ser determinada y por lo tanto, manipulado. Con sus capacidades de miografía, las intervenciones farmacológicas colocado en el baño de añadir otra dimensión a las condiciones de posibilidad de experimentación con este modelo para realizar estudios de las vías de mecánica y de señalización. Mientras que la preservación endotelial no se puede confirmar en la manipulación de la presión, las respuestas a ACh y PE puede llevarse a cabo después de la perfusión 9. Cabe señalar que esta configuración se muestran los efectos de la presión intraluminal en el no de célula a célula interacciones de los efectos del flujo sanguíneo pulsátil ni sistólica o diastólica. Por otra parte, mientras que los cambios agudos en la presión de adhesión de los leucocitos se observaron, esta configuración puede ser también utilizado para observar los efectos de la presión crónica (es decir, aumentar los tiempos de incubación y el uso de un modelo de presión de los animales crónicos). Sprague Dawley arterias carótidas comunes se muestran en esta configuración, pero otras cepas y especies se pueden utilizar con los ajustes apropiados al tamaño de la cánula. De hecho, es importante tener en cuenta que la edad y el peso de los animales afectan el tamaño del vaso y por lo tanto que la instalación tiene que ser individualizada para cada embarcación. La disección minuciosa y cuidadosa del tejido conectivo pueden mejorar la visualización de los leucocitos inmensamente.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo / equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td> SteREO Descubrimiento V.20 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 2000 Jeringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-2016 </td><td></td></tr><tr><td> Cámara digital y controlador </td><td> Hamamatsu ORCA-ER </td><td> C4742-95 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema de iluminación de fluorescencia </td><td> Lumen Dinámica </td><td> X-Cite 120 </td><td></td></tr><tr><td> Buque Cámara </td><td> Vida Instrumentación de Sistemas </td><td> CH/1/SH </td><td></td></tr><tr><td> Controlador de presión de Servo y bomba peristáltica </td><td> Vida Instrumentación de Sistemas </td><td> PS - 200 </td><td></td></tr><tr><td> Control de la Presión de Perfusión </td><td> Vida Instrumentación de Sistemas </td><td> PM - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 2 x transductor de presión </td><td> Vida Instrumentación de Sistemas </td><td> PT - F </td><td></td></tr><tr><td> Controlador de temperatura </td><td> Vida Instrumentación de Sistemas </td><td> TC-01 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba peristáltica </td><td> Instech Laboratories, Inc </td><td> P720 </td><td></td></tr><tr><td> VybrantDil células etiquetado solución </td><td> Invitrogen </td><td> V-22885 </td><td> Use 1:1000 </td></tr></tbody></table>

imágenes de la adhesión de leucocitos al endotelio vascular en la presión intraluminal de alta

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Hipertensión en todo el mundo, se informó que en aproximadamente una cuarta parte de la población y es el principal factor de riesgo biomédicos de mortalidad a nivel mundial. En la hipertensión vascular se asocia con la disfunción endotelial y el aumento de la inflamación que conduce a la aterosclerosis y la enfermedad de varios estados, tales como la enfermedad renal crónica 2, 3 accidente cerebrovascular y la insuficiencia cardiaca 4. Un paso inicial en la inflamación vascular que conduce a la aterogénesis es la cascada de la adhesión, que consiste en el balanceo, la inmovilización, la adhesión y la transmigración de leucocitos posterior a través del endotelio. La contratación y la acumulación de leucocitos con el endotelio está mediada por una regulación al alza de las moléculas de adhesión, tales como moléculas de adhesión celular vascular-1 (VCAM-1) molécula de adhesión celular intracelular-1 (ICAM-1) y E-selectina, así como el aumento de la liberación de citoquinas y quimioquinas y una regulación al alza de las especies reactivas de oxígeno 5. Los métodos in vitro tales como ensayos de adherencia estática ayudan a determinar los mecanismos implicados en la célula a célula de adhesión, así como el análisis de moléculas de adhesión celular. Los métodos empleados en anteriores estudios in vitro han demostrado que el aumento agudo de la presión sobre el endotelio puede conducir a la adhesión de los monocitos, una regulación al alza de las moléculas de adhesión y marcadores de inflamación 6 Sin embargo, al igual que muchos ensayos in vitro, estos hallazgos no se han realizado en tiempo real bajo condiciones de flujo fisiológico, ni con toda la sangre. Por lo tanto, los ensayos in vivo son cada vez más utilizado en los modelos animales para demostrar la inflamación vascular y desarrollo de la placa. Microscopia intravital es ahora ampliamente utilizado para evaluar la adhesión de los leucocitos, la migración de rodadura, y la transmigración 7-9. Cuando se combinan los efectos de la presión en los leucocitos de adhesión endotelial los estudios in vivo son menos extensas. Uno de estos estudios examina los efectos en tiempo real del flujo y de corte en el crecimiento arterial y marcadores de remodelado, pero inflamatoria sólo se evaluaron a través de inmunohistoquímica 10. Aquí se presenta un modelo para el registro de adhesión de los leucocitos en tiempo real en los vasos sanguíneos intactos a presión con la perfusión de sangre entera. La metodología es una modificación de una ex modelo in vivo barco perfusión cámara 9, que permite en tiempo real, análisis de las interacciones adhesivas de leucocitos del endotelio de los vasos intactos. Nuestra modificación permite la manipulación de la presión intraluminal de hasta 200 mmHg permiten estudiar no sólo bajo condiciones de flujo fisiológico, sino también las condiciones de presión. Mientras que los sistemas de presión miografía han demostrado previamente para observar la pared del vaso y la luz de diámetro 11, así como la contracción del recipiente esta es la primera vez que demuestra los leucocitos del endotelio interacción en tiempo real. Aquí se demuestra la técnica que utiliza las arterias carótidas cosecha de ratas y se canuló a una cámara de flujo a medida acoplado a un microscopio de fluorescencia. La cámara de buque está equipado con un cubreobjetos fondo grande que permite una lente objetivo de gran diámetro con una distancia corta de trabajo a la imagen de la nave. Por otra parte, el agonista seleccionados y / o antagonistas pueden ser utilizados para investigar más a fondo los mecanismos que controlan la adhesión celular. Las ventajas de este método sobre microscopía intravital no incluyen la participación de la cirugía invasiva y por lo tanto un mayor rendimiento se puede obtener. Este método también permite el uso de tratamiento con inhibidores localizados en la embarcación deseada, mientras que sólo permite intravital tratamiento con inhibidores sistémicos.

Este es un método para visualizar adhesión de los leucocitos con el endotelio en cosechados recipientes a presión. La técnica permite el estudio de adhesión vascular en el flujo de corte con diferentes presiones intraluminales hasta 200 mmHg por lo tanto imitan-ción de las condiciones fisiopatológicas de la hipertensión arterial.

Imágenes de la adhesión de leucocitos al endotelio vascular en la presión intraluminal de alta

A nivel mundial, se informa que la hipertensión afecta aproximadamente a una cuarta parte de la población y constituye el principal factor de riesgo biomédico de mortalidad en todo el mundo. ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la adhesión de los leucocitos al endotelio en vasos extraídos y presurizados. Esto se logra primero aislando una arteria carótida de una rata o un ratón. A continuación, el vaso se monta en una cámara presurizada.A continuación, se presuriza el vaso y se incuba durante una hora a una presión deseada. Finalmente, se perfunde sangre total marcada a través del vaso presurizado. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la adhesión en tiempo real de los leucocitos al endotelio mediante una cámara ex vivo personalizada para vasos, acoplada a un sistema preciso, servo y un microscopio fluorescente.Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como los ensayos de adhesión estática es que la adhesión de los leucocitos puede observarse en arterias funcionales intactas utilizando sangre completa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de la hipertensión, como el efecto de la alta presión intraluminal sobre la inflamación y cómo puede contribuir a la aterosclerosis. Tras aislar las arterias carótidas de ratas Sprague-Dawley de 10 semanas de edad y preparar y presurizar la cámara de perfusión, monte el vaso sanguíneo bajo un microscopio estereoscópico colocando primero lazos negros de poliéster en cada cánula, traslade el vaso a la cámara, y luego monte un extremo del vaso en la cánula P1.Tenga cuidado de no romper el vaso sanguíneo utilizando una jeringa llena con tampón de Krebs. Lave suavemente la sangre excesiva fuera del vaso a través del transductor P uno. Cierre el paso de P uno hacia la cámara.Con la cinta de poliéster, asegure el vaso a la cánula P uno. Acerque las cánulas y los soportes de cánula para montarlos en la cánula P dos. Monte el extremo distal del cuarto del vaso en la cánula P dos.Fíjelo con una brida de poliéster para comenzar a presurizar el vaso. Ajuste los soportes de la cánula para asegurar que no haya dobleces o estiramientos en el vaso con P uno y P dos cerrados hacia la cámara. Cambie el servopresor de automático a manual.Verifique el servo de presión para asegurarse de que no haya una caída de presión en 10 segundos. Una disminución de la presión indica la presencia de una fuga, por lo que es necesario asegurar las conexiones y el transductor para garantizar que sean herméticas a la presión. Ajuste el servo de presión nuevamente a automático, luego abra P dos hacia la cámara bajo el microscopio y observe la dilatación del vaso.Cuando la llave esté abierta hacia la cámara, cambie el servopresor a modo manual. Nuevamente, verifique si hay alguna disminución de presión.Si la presión sigue disminuyendo, entonces el sistema no es hermético a la presión y probablemente exista un orificio en el recipiente. Cambie nuevamente al modo automático y abra P uno hacia la cámara. En la configuración manual, verifique que la presión permanezca estable.Si es estable, aumente el dial a dos, lo que presuriza el recipiente a 40 milímetros de mercurio. Cambie a automático y observe el recipiente bajo el microscopio. Si es necesario, ajuste el soporte de la cánula para asegurar que no haya ninguna curvatura en el recipiente en la configuración manual.Verifique las fugas. Luego aumente los incrementos del dial, alternando uno a automático intermedio para observar el vaso bajo el microscopio hasta alcanzar la presión deseada. Una vez alcanzada la presión deseada, traslade la cámara al microscopio estereoscópico.Conecte el controlador de temperatura ajustado a 37 grados Celsius. Luego conecte la bomba peristáltica y el aspirador para mantener el tampón de Krebs en el baño fresco. Incube el vaso presurizado a 37 grados Celsius durante una hora.Compruebe periódicamente si hay fugas. Etiquete 7,5 mililitros de sangre entera recolectada con tinte vibrante en la oscuridad. Luego incube durante 10 minutos a 37 grados Celsius.Recolecte la sangre en una jeringa, eliminando cualquier burbuja, y colóquela en una bomba de jeringa con una chaqueta térmica ajustada a 37 grados Celsius. Cierre el transductor P uno hacia la cámara y conecte la jeringa y los tubos de desecho. Purgue la sangre a 1000 microlitros por minuto a través del tubo de desecho para eliminar cualquier burbuja de aire; abra P uno hacia la cámara.El servo de presión se ajustará automáticamente para mantener la presión deseada, perfundiendo la sangre a 100 microlitros por minuto; utilizando un microscopio fluorescente acoplado a una cámara digital, registre dos campos del vaso perfundido durante 15 segundos en varios puntos temporales. Aquí se muestran imágenes representativas de leucocitos, considerándose que los leucocitos están adheridos al endotelio si permanecen estacionarios durante 10 segundos. Con grabaciones de video en bucle continuo, las células pueden contarse como un promedio por campo, mientras que tanto la presión baja como la alta provocarán cierta cantidad de adhesión.Se observa un aumento significativo del anión de leucocitos a la presión intraluminal más alta. Esto se demuestra cuantitativamente en esta gráfica, donde un mayor número de células por campo se adhieren a 120 frente a 80 milímetros de mercurio de presión. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la PCR e inmunohistoquímica, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como la expresión génica y proteica de las moléculas de adhesión.

imaging-leukocyte-adhesion-to-vascular-endothelium-at-high

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí se describe una manera no invasiva de dos fotones (2P), microscopía de enfoque para el estudio de leucocitos de recalada en la almohadilla plantar del ratón. Se discuten los aspectos técnicos de la preparación de imágenes de tejidos y caminar al lector a través de un experimento típico de la configuración inicial a la colección de ejecución y los datos.

De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Se describe un protocolo de la microscopía de campo claro intravital para medir la dinámica de los neutrófilos interacciones célula endotelial durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la fuente de un quimioatrayente de neutrófilos en vivo. Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración y la quimiotaxis transendotelial en tejido de ratón músculo cremáster se visualizan con la fotografía de vídeo de tiempo transcurrido y el seguimiento con ImageJ.

Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

Este video muestra un ensayo basado en flujo laminar para caracterizar la interacción de leucocitos y socios celulares como las células endoteliales. Este método proporciona información dinámica sobre la adhesión, la muerte y la transmigración de los leucocitos cuando se perfunden sobre una capa intacta y confluente de células vasculares.

Ensayo basado en flujo laminar para estudiar las interacciones entre los leucocitos y las células endoteliales

El reclutamiento de leucocitos en el hígado se produce dentro de los canales especializados de los sinusoides hepáticos que se alinean por las células endoteliales sinusoidales hepáticas únicas. Microscopía de contraste de fase de reclutamiento de leucocitos a través del endotelio sinusoidal hepático humano en condiciones de tensión de cizallamiento fisiológica puede facilitar la elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a este proceso.

Un ensayo de adhesión de flujo para estudiar Leucocyte Reclutamiento para hepático humano sinusoidales endotelio en condiciones de estrés de cizalla

Los leucocitos atraviesan la monocapa endotelial usando el paracelular o la ruta transcelular. Hemos desarrollado un ensayo sencillo para seguir la distribución de la unión endógena VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración de leucocitos transendotelial bajo flujo fisiológico de discriminar entre las dos vías de transmigración.

Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica

A continuación, presentamos un protocolo que permite al investigador evaluar la dinámica de reclutamiento de leucocitos ex vivo mediante la conexión de una cámara recubierta con moléculas de adhesión endoteliales derivado al sistema circulatorio de un ratón. Este método ofrece ventajas significativas ya que permite la evaluación de leucocitos en condiciones biológicas relativas.

La evaluación de las interacciones leucocito-endotelio en condiciones de flujo en un Ex Vivo Ensayo Autoperfused Cámara Microflow

Esta aplicación simplificada de la microscopía intravital de las venas del mesenterio en ratones se puede utilizar en diferentes modelos de inflamación para observar las interacciones leucocito-endotelial y plaqueta-leucocito.

Interacciones intravital microscopía de leucocitos endoteliales y plaquetas de leucocitos en mesenterial venas en ratones

Este manuscrito describe el uso de ratones transgénicos reportero y vías de administración diferentes de colorantes fluorescentes en angiotensina II-hipertensión inducida por usando microscopia intravital video de vasos sanguíneos para evaluar la activación de células inmunes y sus capacidad de rollo y se adhieren al endotelio.

Visualizar leucocitos del balanceo y adherencia en angiotensina II-infundido ratones: técnicas y trampas

Leucocitos con avidez interactúan con las células vasculares y las plaquetas después de lesión de pared del recipiente o durante la inflamación. Aquí, describimos un análisis sencillo basado en el flujo laminar para caracterizar los mecanismos moleculares que subyacen a las interacciones entre los leucocitos y sus socios celulares.

Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes

Este protocolo paso a paso proporciona una descripción detallada de la disposición experimental y análisis de datos para la evaluación de las respuestas inflamatorias en hiPSC-ECs y el análisis de la adherencia del leucocito bajo flujo fisiológico.

Ensayo de microfluidos para la evaluación de la adherencia del leucocito a células endoteliales derivado de célula de vástago de Pluripotent inducidas humanas (hiPSC-ECs)

En este protocolo, se emplea un ensayo biomimético de microfluidos, que puede reproducir un entorno microvascular fisiológicamente relevante y reproducir toda la cascada de adhesión/migración de leucocitos, para estudiar las interacciones leucocitarios-células endoteliales en la enfermedad inflamatoria.

Un sistema microfisiológico para estudiar la interacción leucocitario-endotelial durante la inflamación

Aprende a visualizar la adhesión de leucocitos al endotelio vascular en arterias presurizadas ex vivo. Este método permite estudiar la inflamación en condiciones de alta presión intraluminal.

Imágenes de la adhesión de leucocitos al endotelio vascular en la presión intraluminal de alta

Explorar más videos