Preparación de las muestras, imágenes y análisis de protocolos para la microscopía de barrido filo de la navaja

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la preparación de muestras biológicas para la sección y la obtención de imágenes bajo el microscopio de barrido de filo de cuchillo, o KESM, y la visualización de los datos de la pila de imágenes resultantes. Esto se logra fijando, tiñendo e incrustando primero el tejido para prepararlo para la obtención de imágenes bajo el KESM. El segundo paso del procedimiento es configurar el KESM y realizar el seccionamiento y la obtención de imágenes utilizando el software de control automatizado.

A continuación, las imágenes resultantes se registran y se recortan. El paso final es cargar y explorar los conjuntos de datos en un atlas basado en la web y un software de visualización 3D. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el nivel completo del cerebro, la organización neuronal y vascular con una resolución submicrométrica.

La principal ventaja de esta técnica sobre los Mesos existentes, como la electromicroscopía de barrido con base de bloque en serie, es que puede obtener imágenes de volúmenes mucho mayores, aunque a una resolución más baja. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la conectómica y la neurociencia en general. Este método puede proporcionar información sobre la organización estructural del cerebro, y también se puede aplicar a otros sistemas de órganos como el pulmón y el riñón.

Para comenzar este procedimiento, el cerebro de ratón disecado se coloca en un frasco de vidrio que contiene la solución de Golgi Cox. Coloque el frasco de vidrio en una caja hermética a temperatura ambiente durante 10 a 16 semanas. No es necesario un paso de fijación separado, ya que la solución de Golgi Cox funciona como fijador.

Después de 10 a 16 semanas, enjuague el cerebro con agua desionizada durante la noche en la oscuridad al día siguiente, sumerja el cerebro enjuagado en una solución de hidróxido de amonio al 5% en agua desionizada durante siete a 10 días en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de siete a 10 días, enjuague el cerebro nuevamente con agua desionizada a temperatura ambiente durante cuatro horas. Luego deshidrata el cerebro a través de una serie graduada de alcoholes etílicos, dejándolo en cada solución durante 24 horas, 50% de etanol y 70% de etanol a cuatro grados Celsius y 85% de etanol.

Tres cambios de etanol al 95% y cuatro o cinco cambios de etanol al 100% a temperatura ambiente. A continuación, coloque el cerebro deshidratado en acetona y realice tres o cuatro cambios cada uno durante un día. Después de esto, coloque el cerebro durante la noche en el refrigerador en cada una de estas mezclas de acetona aite con una proporción de aite a acetona de uno a dos, uno a uno y dos a uno.

Finalmente, coloque el cerebro al 100% en el refrigerador, realice tres cambios cada vez durante la noche. A continuación, el cerebro tratado se incrusta en 100% aite y se calienta a 60 grados centígrados durante tres días. Finalmente, el bloque de muestra curado se monta en el anillo de muestra de metal, usándolo epoxi y los lados del bloque recortados según sea necesario para comenzar este procedimiento.

Confirme que el ratón está profundamente anestesiado y no responde a un pellizco en el dedo del pie. A continuación, perfundió el ratón trans cordialmente utilizando solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente, seguida de formaldehído tampón con fosfato al 4% en frío. A continuación, perfundir el ratón con una solución de 0,1% de thi y teñir en agua desionizada.

Después de eso, coloque el cuerpo en un refrigerador de cuatro grados centígrados durante 24 horas. Después de 24 horas, retire el cerebro del ternero y colóquelo en una solución fresca de tionina al 0,1%. Deja el cerebro a cuatro grados centígrados durante siete días.

Después de siete días, detiene y deshidrata el cerebro a través de una serie graduada de alcoholes etílicos. Durante un período de tiempo de seis semanas, de tres a cinco días en etanol al 50%, de siete a 10 días en etanol al 70%, aproximadamente dos semanas cada uno en etanol al 85% y al 95%, y el resto del tiempo en etanol al 100%. Después de tres cambios de acetona a temperatura ambiente, el cerebro se incrusta en un plástico erudito en un horno a 60 grados centígrados.

Para comenzar el procedimiento de tinción de la red vascular con tinta china, confirme por la falta de reflejo de retirada de los dedos del pie que el ratón está profundamente anestesiado. A continuación, perfundir el ratón trans cordialmente utilizando solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente, seguido de formina tamponada neutra al 10% a temperatura ambiente. La perfusión de todo el cuerpo con solución salina y fijador es necesaria para eliminar la sangre del sistema cardiovascular y fijar los tejidos.

A continuación, perfu el ratón con 3.0 ccs de perfusión de tinta china sin diluir. Con la tinta china es necesario rellenar completamente la vasculatura del sistema cardiovascular. Después de su extracción del ratón, el cerebro resultante se deshidrata a través de una serie de alcoholes etílicos graduados y luego se incrusta en plástico erudito.

Siguiendo el protocolo mostrado anteriormente para configurar el KESM para la imagen, encienda la cámara, el iluminador y el escenario, levante el cuchillo y el objetivo. A continuación, instale el anillo de muestra. Luego baje el objetivo y el cuchillo.

Mida las dimensiones de la muestra. A continuación, cree un archivo de configuración para el controlador de etapa KESM. Dos aplicaciones, levantar la cuchilla y el objetivo del KESM antes de iniciar la etapa.

Inicie el controlador de etapa KESM dos e inicialice la etapa. Luego baje la cuchilla y el objetivo y encienda la bomba. Enfoque el objetivo y la cámara girando la perilla de enfoque en el tren óptico y ajustando el campo de visión de la cámara en relación con el filo de la navaja.

Haga clic paso a paso para comprobar los primeros pasos de la imagen y el seccionamiento. A continuación, haga clic en Ir. Para iniciar la adquisición de imágenes y la sección para el procesamiento de imágenes.

Ejecute el procesador de pila KESM para eliminar el artefacto de iluminación y normalizar la intensidad del fondo en todas las imágenes. Repita el procedimiento para todas las subcarpetas de datos. Para visualizar los datos utilizando el atlas cerebral de KESM, vaya a este sitio web y seleccione el atlas apropiado para ir a una profundidad diferente.

Seleccione en el menú desplegable, la profundidad a la que debe ir en cada paso y, a continuación, haga clic en más para aumentar o menos para disminuir la profundidad Z. Otras opciones incluyen acercar o navegar usando el atlas cerebral KESM. Utilice el menú desplegable para ajustar el número de superposición y el intervalo de superposición para visualizar los datos mediante VIS lab.

Inicie la aplicación, cree un nuevo proyecto. El proyecto debe incluir componer 3D a partir de archivos 2D, establecer una matriz aritmética mundial y ver 3D conectado. En ese orden, se deben establecer los parámetros apropiados como se muestra en la vista 3D mientras se presiona el botón derecho del mouse.

Mueva el ratón para ajustar las regiones de umbral que se pueden recortar. La orientación cambió, la iluminación cambió o el fondo se encendió o apagó. Los resultados representativos de KESM se ilustran con los siguientes clips de video que se muestran primero son visualizaciones de volumen de KESM, pilas de datos de tinta india de cerebro completo para el conjunto de datos vasculares, comenzando con un primer plano de los datos vasculares con un ancho de aproximadamente 100 micras.

Este segundo clip de KESM, datos de tinta china de todo el cerebro muestra tres vistas estándar de toda la vasculatura del cerebro del ratón, subs muestreados a partir de datos de alta resolución con un ancho de aproximadamente 10 milímetros. La vista sagital, la vista coronal y la vista horizontal, así como un sobrevuelo de la sección coronal. KESM. Los datos de Golgi de todo el cerebro del ratón se ilustran en este clip de vídeo que muestra un vuelo a lo largo de los tres planos de sección diferentes, comenzando con la vista de bloque, seguida de la vista sagital, la vista coronal y la vista horizontal.

A continuación se muestran los detalles de los datos GoGy del ratón de cerebro completo KESM. Este primer videoclip es de las células del cerebelo y de Purkinje. Este segundo clip muestra la corteza y las células parametálicas.

Por último, KESM. Los datos de NLE de todo el cerebro se ilustran en estos dos videoclips. Primero se muestra un primer plano de los datos de NLE.

Este segundo clip muestra tres vistas estándar de todo el cerebro del ratón Nle subs de datos muestreados a partir de datos de alta resolución. También se muestra una sección transversal para una visión clara de las estructuras internas después de este desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran las redes neuronales y vasculares en el cerebro del ratón.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de la preparación de muestras, imágenes y análisis de datos para el microscopio de escaneo de borde de cuchilla.