Name: Preparación de las muestras, imágenes y análisis de protocolos para la microscopía de barrido filo de la navaja (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprende la preparación de muestras cerebrales para microscopía de barrido filo de navaja (KESM) en ratones. Este método permite visualizar redes neuronales y vasculares a resolución submicrométrica para estudios de conectómica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este proyecto fue financiado por el NIH / NINDS (# 1R01-NS54252), NSF (# 0,905,041, # 0,079,874), el Programa de Tecnología Avanzada de Texas (# ATP-000,512-0.146-2001, # ATP-000512-0261-2001), Texas A &amp; M Research Foundation, el Departamento de Ciencias de la Computación e Ingeniería de la Universidad Texas A &amp; M, y 3Scan. Nos gustaría agradecer a Bernard Mesa (Tecnologías de Micro Star) para la consulta y apoyo técnico para la instrumentación KESM. Las partes principales del diseño e implementación de la KESM fue realizado por Bruce H. McCormick, quien murió en 2007.

1. Preparación de la muestra: Golgi-Cox <ol><li> Este protocolo sigue de cerca el protocolo de Mayerich et al. 7. </li><li> El ratón C57BL/6J es profundamente anestesiados con anestesia inhalatoria con isoflurano y luego decapitado. </li><li> El cerebro es removido y colocado en una solución de fijación de Golgi-Cox (1% de cromato de potasio, dicromato de potasio al 1% y 1% de cloruro de mercurio en agua desionizada). </li><li> El cerebro es la izquierda en la solución de Golgi-Cox en la oscuridad, a temperatura ambiente, durante 10 a 16 semanas. </li><li> Los cerebros se enjuagan en agua desionizada durante la noche en la oscuridad. </li><li> El cerebro enjuagado se sumerge en una solución de amonio al 5% de hidróxido en agua desionizada durante 7 a 10 días en la oscuridad a temperatura ambiente. Esta vez fue una larga preparación para asegurar la infiltración de todo el cerebro, de manera que el precipitado negro tuvieron la oportunidad de forma completamente en el tejido. </li><li> El cerebro se aclara de nuevo con agua desionizada a temperatura ambiente durante 4 horas y tgallina deshidratados en una serie gradual de alcoholes etílico: 50% y 70% en el refrigerador (4 ° C), y el 85%, 95% (3 cambios), y el 100% (4 a 5) cambios en la temperatura ambiente. El cerebro se deja en cada solución durante 24 horas. </li><li> El cerebro deshidratado se pone entonces en acetona (3 a 4 cambios, cada uno por un día), seguido por una mezcla de acetona con Araldite Araldite a acetona proporción de 1:2, 1:1, 2:1, y finalmente en 100% araldite (3 cambios, cada vez durante la noche), en el refrigerador (4 ° C). </li><li> Finalmente, el cerebro trata está integrado en el 100% Araldite y se calienta a 60 ° C durante 3 días (cf. Protocolo de incrustación de Abbott y Sotelo 2). Si las muestras están incrustadas en LR White continuación las muestras se transfieren de la solución de etanol últimos 100% a través de tres cambios de LR solución Blanca que cada uno mantenerse en el refrigerador durante la noche, que es un procedimiento estándar antes de la polimerización. Tres cambios se realizan para garantizar la infiltración total. La muestra se tgallina transferido a un nuevo blanco LR que se polimeriza en un recipiente cerrado a 60 ° C durante 24 horas, que es la cantidad necesaria de tiempo y temperatura para la polimerización adecuada. </li><li> Fig. 1 muestra un cerebro de Golgi-Cox manchada incrustado en Araldite. </li><li> Primero la muestra curada se monta en el anillo de muestra de metal con epoxi, y los lados de la manzana recortada como sea necesario (ver fig. 2). </li></ol> 2. Preparación de la muestra: Nissl <ol><li> El ratón está profundamente anestesiados con ketamina y xilacina (1,7 mg de ketamina / xilazina 0,26 mg por cada 20 gramos de peso corporal) inyecta por vía intraperitoneal y perfundidos transcardially con 50 ml de la temperatura ambiente de buffer fosfato salino (pH 7,4), seguido por 250 ml de habitación temperatura de 10% neutral formalina tamponada (pH 7,4). y, finalmente, con 3,0 cc de pura tinta china. </li><li> Perfusión de todo el cuerpo con solución salina y fijador es necesario para limpiar la sangre del sistema cardiovascular y para fijar el ti TEMAS. Perfusión con tinta china es necesaria para llenar completamente la vasculatura del sistema cardiovascular. </li><li> El cerebro resultante se deshidrata a través de una serie de alcoholes clasificado de etilo (25% -100%) y luego incorporados en plásticos araldite siguiendo el protocolo de 1,8-1,9 por encima. Si LR blanco es el medio de inclusión que el protocolo de 1,10 mencionado anteriormente. </li></ol> 4. Preparación de la muestra: las especies genéricas, los órganos de genéricos <ol><li> Para el caso genérico, la fijación se puede hacer con cualquiera de 10% neutral paraformaldehido tamponado% de formalina o 4. </li><li> Para el volumen de tejido pequeños, la difusión en lugar de la perfusión se recomienda para la fijación y la tinción. En el caso de los pequeños organismos u órganos, coloración también se puede hacer durante el proceso de deshidratación. </li><li> El protocolo de incorporación es el mismo que el anterior, aunque los tiempos para la infiltración de una solución puede ser reducido por los órganos u organismos que son mucho más pequeños que el cerebro del ratón entero. </li></ol>jove_title "KESM&gt; 5. configuración y la imagen <ol><li> Apague la bomba, a su vez en el escenario, a su vez en la cámara, a su vez en la iluminación. </li><li> Levante un cuchillo y objetiva. </li><li> Instale el anillo de la muestra. </li><li> Medir la dimensión de muestras y crear un archivo de configuración de la aplicación Etapa KESM Controller2. </li><li> Inicio KESM Controller2 etapa e iniciar la etapa. </li><li> La cuchilla inferior / objetivo, a su vez en la bomba. </li><li> Enfoque objetivo y la cámara, girando la perilla de enfoque en el tren óptico y el ajuste de campo de la cámara de vista en relación con el filo de la navaja. </li><li> Pulse en [Ir] para iniciar la formación de imágenes. </li><li> Vea las figuras. 8.3. Véase el punto 9, 7 para los detalles técnicos. </li></ol> 6. Procesamiento de imágenes y preparación de datos <ol><li> Copia de la pila de KESM ejecutable del procesador en la carpeta de datos en la carpeta de archivo de configuración (00000, 00001, etc.) </li><li> Ejecutar el procesador de la pila KESM para eliminar los artefactos de iluminación y normalizar la intensidad de fondo en todos loslas imágenes. Repita la operación para todas las subcarpetas de datos. </li><li> Prepare las baldosas de escala múltiple del conjunto de datos y cargar y configurar los archivos en el servidor web del cerebro KESM Atlas. </li><li> Ver fig. 9. </li></ol> 7. Visualización de datos y análisis <ol><li> Visualización utilizando el atlas del cerebro KESM. Ir al <a href="http://kesm.cs.tamu.edu">http://kesm.cs.tamu.edu</a> y seleccione el atlas correspondiente. <ol><li> Navegar como en los mapas de Google. </li><li> Acercar y alejar al igual que en los mapas de Google. </li><li> Para ir a una profundidad diferente, seleccione la profundidad de ir a cada paso en el menú desplegable, a continuación, haga clic en cualquiera [+] o [-] para aumentar o disminuir la profundidad z. </li><li> Ajustar el número de superposición utilizando el menú desplegable. </li><li> Ajustar el intervalo de superposición utilizando el menú desplegable. </li><li> Ver fig. 11. </li></ol></li><li> Visualización mediante MeVisLab. <ol><li> Lanzamiento MeVisLab. </li><li> Crear un nuevo proyecto. </li><li> En el siguiente, los nuevos módulos se pueden crear por tymesa de ping en el nombre del módulo en el cuadro de comandos. </li><li> Crear un módulo [Compose3Dfrom2DFiles], e ir a la carpeta deseada. Introduzca la cadena de archivo y haga clic en [GetFileList]. Asegúrese de que las imágenes seleccionadas pueden caber en la memoria. Haga clic en [Create3D] para crear volumen. </li><li> Crear un módulo [SetWorldMatrix], y establecer la "escala" en "Transforma Primaria" x, y, z con el tamaño adecuado voxel (0,6, 0,7, 1,0 para un objetivo 0.45NA 10X). Enlace [Compose3Dfrom2DFiles] a [SetWorldMatrix]. </li><li> Establecer la matriz y se transforma en "composición de la matriz" a "Ignore", "Ninguna", "Adelante". </li><li> Crear un módulo [Arithmetic1] y establecer la "función" a "Invertir (Max-IMG)". Enlace [SetWorldMatrix] a [Arithmetic1]. </li><li> Crear un módulo [View3D] y conectar [Arithmetic1]. </li><li> En View3D, mientras que el botón derecho del ratón se presiona, mueve el ratón para ajustar el umbral. Puede recortar las regiones, la orientación del cambio (movimiento de mouse botón izquierdo del ratón mientras se pulsa), iluminación de cambio (renderin volumeng o MIP), activar / desactivar el fondo, etc </li><li> Ver fig. 10. </li></ol></li></ol> 8. Los resultados representativos: A continuación, presentamos los datos de todo el cerebro y los detalles. Higos. 12-15 muestran a todo el cerebro tinta china, Golgi, Nissl y conjuntos de datos de 1, 4, 3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Cerebro de ratón fija, se tiñe y embebidos <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Muestras de cerebro de ratón integrado montado en el anillo de la muestra. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. El filo del cuchillo Microscopio de Barrido (KESM). Una foto de la KESM se muestra con sus principales componentes marcados: (1) de montaje de alta velocidad de la línea de barrido de la cámara, (2) objetivo del microscopio, (3) cuchilla de diamante y el colimador de luz, (4) de la SPECimen tanque (para obtener imágenes de la inmersión en agua), (5) de tres ejes de aire de precisión teniendo etapa, (6) blanco-luz del iluminador microscopio, (7) la bomba de agua (en la parte posterior) para la extracción de tejido seccionado, (8) PC servidor para el control de la etapa y la adquisición de imágenes (9), base de granito, y (10) puente de granito. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Principios de imágenes de la KESM. El director de operaciones de KESM se ilustra. El objetivo y el cuchillo se mantiene en su lugar, mientras que la muestra colocada en la etapa de movimientos de posicionamiento (flecha con línea continua) en la resolución de 20 nm y la velocidad de desplazamiento de 1-5, y se raspó contra la cuchilla de diamante (5 mm de ancho para el objetivo de 10X), generando una lámina delgada que fluye sobre el cuchillo (flecha con línea continua). Línea de exploración de imágenes se realiza cerca de la punta del cuchillo. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. KESM cámara y objetivo de los controles de enfoque. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Asamblea KESM cuchillo y controles. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Inicial centrado a través del puerto de observación. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Controlador KESM Etapa 2 de la aplicación (de pantalla). <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 9"> Figura 9. Pila KESM procesador de aplicaciones (screenshot). <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 10"> Figura 10. MeVisLab aplicación (captura de pantalla). <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 11"> Figura 11 KESM Atlas del Cerebro:. Web-interfaz (pantalla). <img alt="Figura 12" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig12.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 12"> Figura 12. KESM todo el cerebro de datos con tinta china. Visualizaciones volumen de datos KESM pilas se muestran para el conjunto de datos vascular. (A) Close-up de los datos vascular. Ancho ~ 100 um. (Bd) de tres vistas estándar de toda la vasculatura del cerebro del ratón (submuestras de datos de alta resolución). Ancho ~ 10mm. <img alt="Figura 13" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig13.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 13"> Figura 13. KESM todo el cerebro del ratón de datos de Golgi. <img alt="Figura 14" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig14.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 14"> Figura 14. KESM Golgi detalles de los datos. <img alt="Figura 15" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig15.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 15"> Figura 15. KESM todo el cerebro de datos Nissl. (A) Primer plano de la Ndatos ISSL. ~ 300 um 3. (Bd) de tres puntos de vista estándar de la totalidad del cerebro del ratón de datos Nissl (submuestras de datos de alta resolución). Sección transversal se muestra una visión clara de las estructuras internas.

<ol><li>Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbbott%2C+LC+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 504.2, Society for Neuroscience. Washington, DC. (2008).</li>
<li>Abbott, L. C., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+catecholaminergic+innervation+in+weaver+and+normal+mouse+cerebellar+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices.</a> Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 516.3, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
<li>Choe, Y., Han, D., Huang, P. -S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+submicrometer+scans+of+mouse+brain+microstructure%3A+Neurons+and+vasculatures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22%5BJournal%5D)">Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, Society for Neuroscience Program. Chicago, IL. (2009).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22High-Throughput+Image+Reconstruction+and+Analysis%3A+Intelligent+Microscopy+Applications%22">High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications</a>. Ravi Rao, A., Cecchi, G. , Artech House. Boston, MA. 11-37 (2008).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+out+the+octopus+connectome+at+submicron+resolution+using+the+knife-edge+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope.</a> BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).</li>
<li>Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).</li>
<li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+macro-scale+Transmission+Imaging+of+Microvascular+Networks+Using+KESM%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM.</a> Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).</li>
<li>McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. , Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).</li>
<li>Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+connectome%3A+A+structural+description+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">The human connectome: A structural description of the human brain.</a> PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).</li>
</ol>

Todd Huffman es con 3Scan, una empresa comercial que fabrica y comercializa la tecnología KESM (patente de EE.UU. 6.744.572 #).

El KESM permite un estudio submicrométricas a nivel de grandes volúmenes de muestras biológicas (~ 1 cm 3). Este tipo de volumen es suficiente para almacenar toda órganos de animales pequeños, como el cerebro, pulmones, corazón, riñones, etc escaneadas las imágenes de los órganos pueden proporcionar información sin precedentes cuantitativa sobre la organización estructural de estos órganos, y permitir el modelado computacional de diversos funcionales aspectos de estos órganos, incluyendo la dinámica del circuito y de la red, propiedades eléctricas, de fluidos y la dinámica del flujo de aire, y la dinámica muscular. El protocolo de preparación de muestras y el protocolo de post-análisis detallados en este artículo se espera para ayudar a grupos al margen de la investigación para tener un acceso más fácil a la KESM y los datos resultantes. El protocolo de operación KESM ayudará a los investigadores externos a apreciar los beneficios y limitaciones de esta técnica de imagen única.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

preparación de las muestras, imágenes y análisis de protocolos para la microscopía de barrido filo de la navaja

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Los principales avances en alto rendimiento, de alta resolución, técnicas de microscopía 3D han permitido la adquisición de grandes volúmenes de datos neuroanatómicos a una resolución de submicrométricas. Uno de los primeros instrumentos como la producción de todo el cerebro escala de datos es el microscopio de filo de la navaja (KESM) 7, 5, 9, desarrollada y alojada en el laboratorio de los autores. KESM se ha utilizado para la sección y el cerebro de toda la imagen del ratón con una resolución de submicrométricas, revelando los detalles intrincados de las redes neuronales (Golgi) 1, 4, 8, redes vasculares (tinta china) 1, 4, y la distribución de las células del cuerpo (Nissl) 3 . El uso de KESM no se limita al ratón ni el cerebro. Hemos logrado imágenes del cerebro del pulpo 6, pulmón de ratón, y el cerebro de la rata. En estos momentos estamos trabajando en conjunto embriones de peces cebra. Datos como estos pueden contribuir enormemente a la investigación conectómica 10, de la micro y la investigación hemodinámica, y la investigación estereología por disposicionesDing an. exacta verdad-terreno En este artículo vamos a describir la tubería, incluyendo la preparación de muestras (fijación, tinción, y la inclusión), configuración y puesta en marcha KESM, la sección y la imagen con la KESM, procesamiento de imágenes, preparación de datos, y visualización de datos y análisis. Se hará hincapié en la preparación de muestras y la visualización / análisis de los datos obtenidos KESM. Esperamos que el protocolo detallado que se presenta en este artículo para ayudar a ampliar el acceso a KESM y aumentar su utilización.

El proceso completo, desde la preparación del cerebro muestra de imágenes en serie de seccionamiento con el microscopio de filo de la navaja, a la visualización y análisis de datos se describe. Esta técnica se utiliza actualmente para obtener datos del cerebro del ratón, pero es aplicable a otros órganos, otras especies.

Preparación de las muestras, imágenes y análisis de protocolos para la microscopía de barrido filo de la navaja

Los avances significativos en las técnicas de microscopía tridimensional de alta resolución y alto rendimiento han permitido la adquisición de grandes volúmenes de datos neuroanatómicos en...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la preparación de especímenes biológicos para el corte e imagen mediante el microscopio de exploración con borde de cuchilla, o KESM, y la visualización de los datos resultantes en forma de pilas de imágenes. Esto se logra primero fijando, tiñendo e incluyendo el tejido para prepararlo para la imagen mediante el KESM. El segundo paso del procedimiento consiste en configurar el KESM y realizar el corte y la adquisición de imágenes utilizando el software de control automatizado.Las imágenes resultantes se registran y recortan luego para eliminar el ruido. El paso final consiste en cargar y explorar los conjuntos de datos en un atlas basado en web y en un software de visualización 3D. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la organización neuronal y vascular a nivel de todo el cerebro con resolución submicrométrica.La principal ventaja de esta técnica frente a las existentes para el meso, como la microscopía electrónica de barrido por bloques en serie, es que puede obtener imágenes de volúmenes mucho mayores, aunque con una resolución más baja. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la conectómica y en la neurociencia en general. Este método puede proporcionar información sobre la organización estructural del cerebro, y también puede aplicarse a otros sistemas de órganos, como el pulmón y el riñón.Para comenzar este procedimiento, el cerebro de ratón diseccionado se coloca en un frasco de vidrio que contiene la solución de Golgi Cox. Coloque el frasco de vidrio en una caja opaca a la luz a temperatura ambiente durante 10 a 16 semanas. No es necesario un paso de fijación separado, ya que la solución de Golgi Cox actúa como fijador.Después de 10 a 16 semanas, enjuague el cerebro con agua desionizada durante la noche al día siguiente, en la oscuridad; luego sumerja el cerebro enjuagado en una solución al 5 % de hidróxido de amonio en agua desionizada durante siete a 10 días, en la oscuridad y a temperatura ambiente. Después de siete a 10 días, vuelva a enjuagar el cerebro con agua desionizada a temperatura ambiente durante cuatro horas. A continuación, deshidrate el cerebro mediante una serie graduada de alcoholes etílicos, dejándolo en cada solución durante 24 horas: etanol al 50 % y etanol al 70 % a cuatro grados Celsius, y etanol al 85 %.Tres cambios de etanol al 95 % y cuatro o cinco cambios de etanol al 100 % a temperatura ambiente. A continuación, coloque el cerebro deshidratado en acetona y realice de tres a cuatro cambios diarios durante un día. Después de esto, coloque el cerebro durante la noche en el refrigerador en cada una de estas mezclas de aite y acetona con una proporción de aite a acetona de uno a dos, uno a uno y dos a uno.Finalmente, coloque el cerebro en aite al 100 % en el refrigerador y realice tres cambios, cada vez durante la noche. Luego, el cerebro tratado se incluye en aite al 100 % y se calienta a 60 grados Celsius durante tres días. Finalmente, el bloque de espécimen curado se monta en el anillo metálico para espécimenes utilizando epoxi, y los lados del bloque se recortan según sea necesario para comenzar este procedimiento.Confirme que el ratón esté profundamente anestesiado y sin respuesta a un pellizco en el dedo del pie. A continuación, realice la perfusión transcardial del ratón utilizando solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente, seguida de paraformaldehído frío al 4 % en tampón fosfato. Luego, perfunda al ratón con una solución de tiodi y colorante al 0,1 % en agua desionizada.Después de eso, coloque el cuerpo en un refrigerador de cuatro grados Celsius durante 24 horas. Después de 24 horas, retire el cerebro del cráneo y colóquelo en una solución fresca de 0,1 % Thionine. Deje el cerebro a cuatro grados Celsius durante siete días.Después de siete días, retire y deshidrate el cerebro mediante una serie ascendente de alcoholes etílicos. Durante un período de seis semanas, tres a cinco días en etanol al 50 %, de siete a diez días en etanol al 70 %, aproximadamente dos semanas cada uno en etanol al 85 % y al 95 %, y el resto del tiempo en etanol al 100 %. Después de tres cambios de acetona a temperatura ambiente, el cerebro se incluye en plástico erudito en un horno a 60 grados Celsius.Para comenzar el procedimiento de tinción de la red vascular con tinta china, confirme, mediante la ausencia del reflejo de retirada del dedo del pie, que el ratón está profundamente anestesiado. A continuación, realice una perfusión transcardial del ratón utilizando solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente, seguida de formalina al 10 % tamponada y neutra a temperatura ambiente. La perfusión de todo el cuerpo con solución salina y fijador es necesaria para eliminar la sangre del sistema cardiovascular y fijar los tejidos.A continuación, realice la perfusión del ratón con 3,0 ccs de tinta de la India sin diluir. Es necesario utilizar tinta de la India para llenar completamente la vasculatura del sistema cardiovascular. Después de su extracción del ratón, el cerebro resultante se deshidrata mediante una serie de alcoholes etílicos de concentración creciente y luego se incluye en plástico erudito.Después de seguir el protocolo mostrado anteriormente para configurar el KESM para la obtención de imágenes, encienda la cámara, el iluminador y la platina, y eleve el cuchillo y el objetivo. A continuación, instale el anillo de la muestra. Luego, baje el objetivo y el cuchillo.Mida las dimensiones de la muestra. Luego cree un archivo de configuración para el controlador de la etapa de KESM. En dos aplicaciones, eleve la cuchilla y el objetivo de la KESM antes de inicializar la etapa.Inicie el controlador de la etapa KESM dos e inicialice la etapa. Luego, baje el cuchillo y el objetivo y encienda la bomba. Enfoque el objetivo y la cámara girando el botón de enfoque en el tren óptico y ajustando el campo de visión de la cámara con respecto al borde del cuchillo.Haga clic paso a paso para verificar los primeros pasos de la adquisición de imágenes y el corte. Luego haga clic en continuar. Para iniciar la adquisición de imágenes y el corte para el procesamiento de imágenes.Ejecute el procesador de la pila KESM para eliminar el artefacto de iluminación y normalizar la intensidad del fondo en todas las imágenes. Repita este paso para todas las subcarpetas de datos. Para visualizar los datos utilizando el atlas cerebral KESM, visite este sitio web y seleccione el atlas adecuado para acceder a una profundidad diferente.Seleccione en el menú desplegable la profundidad a alcanzar en cada paso, y luego haga clic en más para aumentar o en menos para disminuir la profundidad en Z. Otras opciones incluyen acercar la imagen o navegar utilizando el atlas cerebral KESM. Utilice el menú desplegable para ajustar el número de superposición y el intervalo de superposición para visualizar los datos mediante el laboratorio VIS.Abra la aplicación y cree un nuevo proyecto. El proyecto debe incluir componer 3D a partir de archivos 2D, establecer la matriz mundial, realizar operaciones aritméticas y visualizar el 3D conectado. En ese orden, se deben configurar los parámetros adecuados como se muestra en la vista 3D mientras se mantiene presionado el botón derecho del ratón.Mueva el ratón para ajustar las regiones de umbral que se pueden recortar. La orientación cambió, la iluminación cambió o el fondo se encendió o apagó. Los resultados representativos de KESM se ilustran mediante los siguientes clips de video que se muestran primero: visualizaciones volumétricas de KESM, pilas completas de datos de tinta India en el cerebro para el conjunto de datos vasculares, comenzando con una vista ampliada de los datos vasculares con un ancho de aproximadamente 100 micrones.Este segundo clip de KESM, datos de tinta India del cerebro completo, muestra tres vistas estándar de la vasculatura completa del cerebro de ratón, submuestreadas a partir de datos de alta resolución con un ancho de aproximadamente 10 milímetros. La vista sagital, la vista coronal y la vista horizontal, así como un recorrido a través de la sección coronal. KESM. Los datos de Golgi del cerebro completo de ratón se ilustran en este clip de video, que muestra un recorrido a lo largo de los tres planos de corte diferentes, comenzando con la vista del bloque, seguida por la vista sagital, la vista coronal y la vista horizontal.A continuación se muestran más detalles de los datos del cerebro completo de ratón GoGy obtenidos mediante KESM. Este primer clip muestra el cerebelo y las células de Purkinje. Este segundo clip muestra la corteza y las células parametales.Por último, KESM. En estos dos clips de video se ilustran los datos nle de todo el cerebro. Primero se muestra un acercamiento de los datos NLE.Este segundo clip muestra tres vistas estándar de los datos Nle del cerebro completo del ratón, submuestreados a partir de datos de alta resolución. También se muestra una sección transversal para una visión clara de las estructuras internas tras este desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran las redes neuronales y vasculares en el cerebro del ratón.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de la preparación de muestras, la obtención de imágenes y el análisis de datos para el microscopio de exploración con borde de cuchilla.

specimen-preparation-imaging-analysis-protocols-for-knife-edge

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Fuente: Mukherjee, K., et. al. Análisis de mitocondrias cerebrales mediante microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie. J. Vis. Exp. (2016)Este video muestra la preparación,  imágenes y análisis del tejido cerebral de ratón utilizando un microscopio electrónico de barrido de cara de bloque en serie (SBFSEM) para visualizar la ultraestructura mitocondrial, lo que permite un mapeo preciso de su morfología y distribución espacial en compartimentos neuronales axonales y...

 Obtención de imágenes de mitocondrias neuronales mediante un microscopio electrónico de barrido de cara de bloque en serie

Aquí se muestra un método para visualizar la ultraestructura de la matriz extracelular en tejidos cardíacos descelularizados.

Microscopía Electrónica de Barrido de tejido macerado para visualizar la matriz extracelular

Se describe un método mediante el cual se pueden utilizar nanopartículas de puntos cuánticos (QD) para estudios inmunocitoquímicos correlativos de tejido de patología humana incrustado en epoxi. Empleamos QDs conjugados con fragmentos de anticuerpos comerciales que se visualizan mediante microscopía de luz de fluorescencia de campo amplio y microscopía electrónica de transmisión.

Correlativa a la luz y microscopía electrónica de Uso de Quantum Dot nanopartículas

Este informe describe un protocolo de preparación de muestras y condiciones de imagen específicas para realizar tomografía electrónica de transmisión de barrido de muestras biológicas gruesas.

Preparación y observación de muestras biológicas mediante el escaneo de grueso Electrónica de Transmisión de Positrones

Este estudio presenta procedimientos confiables y fáciles para la obtención de secciones ultrafinas seriales de un microorganismo sin equipo costoso en microscopía electrónica de transmisión.

Un método para la obtención de secciones seriadas ultrafinas de microorganismos en microscopía electrónica de transmisión

Este protocolo está dirigido a células específicas en el tejido para la proyección de imagen en resolución de nanoescala utilizando un microscopio electrónico de barrido (SEM). Gran número de secciones seriadas del material biológico embebido en resina es primero reflejada en un microscopio de luz para identificar el destino y luego de manera jerárquica en la SEM.

Proyección de imagen multimodal jerárquica de secciones seriadas para encontrar dianas celulares específicas dentro de grandes volúmenes

Aquí presentamos un protocolo para la combinación de dos técnicas de procesamiento de muestra, alta presión de congelación y procesamiento de las muestras asistida por microondas, seguido por la resina mínima inclusión para la adquisición de datos con un ion enfocado viga microscopio electrónico (FIB-SEM). Así lo demuestran con una muestra de nervio tibial de ratón y elegans de Caenorhabditis.

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

Presentamos un protocolo para estudiar la distribución de mitocondrias y retículo endoplasmático en células enteras después de la modificación genética utilizando microscopía electrónica correlativa de luz y volumen incluyendo ascorbato peroxidasa 2 y tinción de peroxidasa de rábano picante, seccionamiento en serie de células con y sin el gen objetivo en la misma sección, y la toma de imágenes en serie a través de microscopía electrónica.

Mitocondrias y endoplasmática retícula imagen por microscopía electrónica de luz y volumen correlativa

Aquí, presentamos protocolos de procesamiento detallados para la toma de imágenes de muestras de tejido delicadas utilizando microscopía electrónica de barrido (SEM). Tres métodos de procesamiento diferentes, a saber, el secado químico de hexametil disilazana (HMDS), el secado simple al aire y el secado de puntocrítico se describen para preparar cáscaras de huevo rígidas, embriones en etapas tempranas del desarrollo y cultivos de hongos, respectivamente.

Procesamiento de embriones, cáscara de huevo y cultivo de hongos para escanear microscopía electrónica

Este protocolo delinea un método rutinario para usar la microscopia electrónica serial de la exploración de la bloque-cara (SBF-SEM), una técnica de proyección de imagen 3D potente. El uso acertado de SBF-SEM depende de técnicas apropiadas de la fijación y de la coloración del tejido, así como de la consideración cuidadosa de los ajustes de la proyección de imagen. Este protocolo contiene consideraciones prácticas para la totalidad de este proceso.

Microscopía Electrónica De Barrido Bloque-Cara Serial (SBF-SEM) De Muestras De Tejido Biológico

Introdujimos una técnica de imagen novedosa llamada Tomografía de Interferencia Óptica Multicapa (OMLIT), que permite la imagen imparcial de todas las células en muestras cerebrales a mesoescala y puede integrarse perfectamente en el flujo de trabajo de imagen de la microscopía electrónica de barrido serial basada en cinta en la misma muestra.

Un método de imagen óptica compatible con microscopía electrónica de barrido para el mapeo cerebral mesoscópico de todas las células

Aprende la preparación de muestras cerebrales para microscopía de barrido filo de navaja (KESM) en ratones. Este método permite visualizar redes neuronales y vasculares a resolución submicrométrica para estudios de conectómica.

Preparación de las muestras, imágenes y análisis de protocolos para la microscopía de barrido filo de la navaja

Explorar más videos