Preparación de las muestras, imágenes y análisis de protocolos para la microscopía de barrido filo de la navaja

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la preparación de especímenes biológicos para el corte e imagen mediante el microscopio de exploración con borde de cuchilla, o KESM, y la visualización de los datos resultantes en forma de pilas de imágenes. Esto se logra primero fijando, tiñendo e incluyendo el tejido para prepararlo para la imagen mediante el KESM. El segundo paso del procedimiento consiste en configurar el KESM y realizar el corte y la adquisición de imágenes utilizando el software de control automatizado.

Las imágenes resultantes se registran y recortan luego para eliminar el ruido. El paso final consiste en cargar y explorar los conjuntos de datos en un atlas basado en web y en un software de visualización 3D. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la organización neuronal y vascular a nivel de todo el cerebro con resolución submicrométrica.

La principal ventaja de esta técnica frente a las existentes para el meso, como la microscopía electrónica de barrido por bloques en serie, es que puede obtener imágenes de volúmenes mucho mayores, aunque con una resolución más baja. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la conectómica y en la neurociencia en general. Este método puede proporcionar información sobre la organización estructural del cerebro, y también puede aplicarse a otros sistemas de órganos, como el pulmón y el riñón.

Para comenzar este procedimiento, el cerebro de ratón diseccionado se coloca en un frasco de vidrio que contiene la solución de Golgi Cox. Coloque el frasco de vidrio en una caja opaca a la luz a temperatura ambiente durante 10 a 16 semanas. No es necesario un paso de fijación separado, ya que la solución de Golgi Cox actúa como fijador.

Después de 10 a 16 semanas, enjuague el cerebro con agua desionizada durante la noche al día siguiente, en la oscuridad; luego sumerja el cerebro enjuagado en una solución al 5 % de hidróxido de amonio en agua desionizada durante siete a 10 días, en la oscuridad y a temperatura ambiente. Después de siete a 10 días, vuelva a enjuagar el cerebro con agua desionizada a temperatura ambiente durante cuatro horas. A continuación, deshidrate el cerebro mediante una serie graduada de alcoholes etílicos, dejándolo en cada solución durante 24 horas: etanol al 50 % y etanol al 70 % a cuatro grados Celsius, y etanol al 85 %.

Tres cambios de etanol al 95 % y cuatro o cinco cambios de etanol al 100 % a temperatura ambiente. A continuación, coloque el cerebro deshidratado en acetona y realice de tres a cuatro cambios diarios durante un día. Después de esto, coloque el cerebro durante la noche en el refrigerador en cada una de estas mezclas de aite y acetona con una proporción de aite a acetona de uno a dos, uno a uno y dos a uno.

Finalmente, coloque el cerebro en aite al 100 % en el refrigerador y realice tres cambios, cada vez durante la noche. Luego, el cerebro tratado se incluye en aite al 100 % y se calienta a 60 grados Celsius durante tres días. Finalmente, el bloque de espécimen curado se monta en el anillo metálico para espécimenes utilizando epoxi, y los lados del bloque se recortan según sea necesario para comenzar este procedimiento.

Confirme que el ratón esté profundamente anestesiado y sin respuesta a un pellizco en el dedo del pie. A continuación, realice la perfusión transcardial del ratón utilizando solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente, seguida de paraformaldehído frío al 4 % en tampón fosfato. Luego, perfunda al ratón con una solución de tiodi y colorante al 0,1 % en agua desionizada.

Después de eso, coloque el cuerpo en un refrigerador de cuatro grados Celsius durante 24 horas. Después de 24 horas, retire el cerebro del cráneo y colóquelo en una solución fresca de 0,1 % Thionine. Deje el cerebro a cuatro grados Celsius durante siete días.

Después de siete días, retire y deshidrate el cerebro mediante una serie ascendente de alcoholes etílicos. Durante un período de seis semanas, tres a cinco días en etanol al 50 %, de siete a diez días en etanol al 70 %, aproximadamente dos semanas cada uno en etanol al 85 % y al 95 %, y el resto del tiempo en etanol al 100 %. Después de tres cambios de acetona a temperatura ambiente, el cerebro se incluye en plástico erudito en un horno a 60 grados Celsius.

Para comenzar el procedimiento de tinción de la red vascular con tinta china, confirme, mediante la ausencia del reflejo de retirada del dedo del pie, que el ratón está profundamente anestesiado. A continuación, realice una perfusión transcardial del ratón utilizando solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente, seguida de formalina al 10 % tamponada y neutra a temperatura ambiente. La perfusión de todo el cuerpo con solución salina y fijador es necesaria para eliminar la sangre del sistema cardiovascular y fijar los tejidos.

A continuación, realice la perfusión del ratón con 3,0 ccs de tinta de la India sin diluir. Es necesario utilizar tinta de la India para llenar completamente la vasculatura del sistema cardiovascular. Después de su extracción del ratón, el cerebro resultante se deshidrata mediante una serie de alcoholes etílicos de concentración creciente y luego se incluye en plástico erudito.

Después de seguir el protocolo mostrado anteriormente para configurar el KESM para la obtención de imágenes, encienda la cámara, el iluminador y la platina, y eleve el cuchillo y el objetivo. A continuación, instale el anillo de la muestra. Luego, baje el objetivo y el cuchillo.

Mida las dimensiones de la muestra. Luego cree un archivo de configuración para el controlador de la etapa de KESM. En dos aplicaciones, eleve la cuchilla y el objetivo de la KESM antes de inicializar la etapa.

Inicie el controlador de la etapa KESM dos e inicialice la etapa. Luego, baje el cuchillo y el objetivo y encienda la bomba. Enfoque el objetivo y la cámara girando el botón de enfoque en el tren óptico y ajustando el campo de visión de la cámara con respecto al borde del cuchillo.

Haga clic paso a paso para verificar los primeros pasos de la adquisición de imágenes y el corte. Luego haga clic en continuar. Para iniciar la adquisición de imágenes y el corte para el procesamiento de imágenes.

Ejecute el procesador de la pila KESM para eliminar el artefacto de iluminación y normalizar la intensidad del fondo en todas las imágenes. Repita este paso para todas las subcarpetas de datos. Para visualizar los datos utilizando el atlas cerebral KESM, visite este sitio web y seleccione el atlas adecuado para acceder a una profundidad diferente.

Seleccione en el menú desplegable la profundidad a alcanzar en cada paso, y luego haga clic en más para aumentar o en menos para disminuir la profundidad en Z. Otras opciones incluyen acercar la imagen o navegar utilizando el atlas cerebral KESM. Utilice el menú desplegable para ajustar el número de superposición y el intervalo de superposición para visualizar los datos mediante el laboratorio VIS.

Abra la aplicación y cree un nuevo proyecto. El proyecto debe incluir componer 3D a partir de archivos 2D, establecer la matriz mundial, realizar operaciones aritméticas y visualizar el 3D conectado. En ese orden, se deben configurar los parámetros adecuados como se muestra en la vista 3D mientras se mantiene presionado el botón derecho del ratón.

Mueva el ratón para ajustar las regiones de umbral que se pueden recortar. La orientación cambió, la iluminación cambió o el fondo se encendió o apagó. Los resultados representativos de KESM se ilustran mediante los siguientes clips de video que se muestran primero: visualizaciones volumétricas de KESM, pilas completas de datos de tinta India en el cerebro para el conjunto de datos vasculares, comenzando con una vista ampliada de los datos vasculares con un ancho de aproximadamente 100 micrones.

Este segundo clip de KESM, datos de tinta India del cerebro completo, muestra tres vistas estándar de la vasculatura completa del cerebro de ratón, submuestreadas a partir de datos de alta resolución con un ancho de aproximadamente 10 milímetros. La vista sagital, la vista coronal y la vista horizontal, así como un recorrido a través de la sección coronal. KESM. Los datos de Golgi del cerebro completo de ratón se ilustran en este clip de video, que muestra un recorrido a lo largo de los tres planos de corte diferentes, comenzando con la vista del bloque, seguida por la vista sagital, la vista coronal y la vista horizontal.

A continuación se muestran más detalles de los datos del cerebro completo de ratón GoGy obtenidos mediante KESM. Este primer clip muestra el cerebelo y las células de Purkinje. Este segundo clip muestra la corteza y las células parametales.

Por último, KESM. En estos dos clips de video se ilustran los datos nle de todo el cerebro. Primero se muestra un acercamiento de los datos NLE.

Este segundo clip muestra tres vistas estándar de los datos Nle del cerebro completo del ratón, submuestreados a partir de datos de alta resolución. También se muestra una sección transversal para una visión clara de las estructuras internas tras este desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran las redes neuronales y vasculares en el cerebro del ratón.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de la preparación de muestras, la obtención de imágenes y el análisis de datos para el microscopio de exploración con borde de cuchilla.