Inducción y Seguimiento de Adopción de hipersensibilidad retardada en ratas

Soy Christine Beaton. Soy investigadora asistente en el laboratorio de George Chen, del Departamento de Fisiología y Biofísica de la Universidad de California en Irvine. Y en los próximos días les mostraré el procedimiento para inducir y medir la DTH adaptativa en ratas Louis.

Este procedimiento dura cinco días y lo que voy a mostrarles es cómo activar linfocitos T específicos para un antígeno, cómo inyectarlos luego, dos días después, en ratas ingenuas. A continuación, dos días más tarde, desafiaremos a las ratas en las orejas con el antígeno para el cual esos linfocitos T son específicos. Y al día siguiente, vamos a medir el grado de inflamación en esas ratas.

Para obtener suero para mi cultivo de tejidos, necesito obtener la sangre. Para ello, realizo una punción cardíaca. Coloco mi dedo índice izquierdo sobre el plexo solar y alcanzo el corazón a través de las costillas, entre las costillas con mi aguja, y aspiro la mayor cantidad posible de sangre.

Y a partir de una extracción, dependiendo del día y de la eficiencia, podemos obtener entre dos y diez mililitros de sangre de una rata determinada. Y la razón por la que necesitamos suero en el cultivo es que deseamos cultivar células que sean células de rata Louis en suero, es decir, un suero síngeo. Por lo tanto, se tratará de suero de rata Louis.

Luego transfiero la sangre a un tubo, pero tengo cuidado de retirar la aguja de la jeringa para no provocar hemólisis, ya que quiero utilizar mi suero para el cultivo de tejidos más adelante. Ahora voy a extraer el timo, dado que el corazón ha dejado de latir y la rata está muerta.

Así que primero rocío con etanol al 70 % para asegurarme de que no haya pelo flotando y entrando en mi órgano, ya que lo necesito para el cultivo de tejidos. Y utilizo instrumentos autoclavados para realizar la disección. Primero corto la piel.

Una vez que he retirado la piel, corto cuidadosamente a cada lado de la caja torácica para asegurarme de no dañar el timo, que se encuentra justo encima del corazón. El timo puede observarse aquí como un órgano pálido, casi blanco, ubicado justo por encima del corazón. Lo retiro, asegurándome de extraer todo el órgano, aunque no soy demasiado cuidadoso en extraerlo limpiamente, ya que más adelante lo limpiaré en la cabina.

Y simplemente lo coloco en un tubo que contiene PBS al que he suplementado con penicilina y estreptomicina. Para evitar cualquier crecimiento bacteriano, ahora voy a preparar una suspensión simple de células a partir de mi citocito. Y para ello voy a utilizar un filtro celular de 70 micrones.

Y voy a utilizar, por supuesto, todo equipo estéril. Transfiero el timo a una placa de Petri. Y como pueden ver, no es muy limpia.

El timo es el órgano de color blanquecino y hay ganglios linfáticos y coágulos sanguíneos sobre él. Por lo tanto, voy a eliminarlos. Y voy a colocar aproximadamente 10 mL de PBS suplementado con antibióticos en mi tamiz celular para tenerlo listo y recibir el timo una vez que esté limpio.

Para limpiarlo, simplemente elimino todos los contaminantes de mi timo. Ahora mi timo está casi completamente limpio, así que lo tomaré con mis pinzas y lo cortaré en trocitos pequeños con mis tijeras sobre el separador celular y colocaré todos los trocitos de timo dentro del separador celular. Y después de terminar con eso, usaré el émbolo de una jeringa de un mililitro, que por supuesto está esterilizado, para obtener una suspensión simple de células presionando los trozos de timo a través del separador celular.

Y las células individuales van a pasar y quedaran en mi PBS en el exterior del entrenador de células. Así que ahora he pasado mis células a través del entrenador de células y pueden ver que el PBS ya no está claro. Está lleno con mi suspensión de células individuales que voy a transferir a un tubo de 50 ml que mantengo sobre hielo.

Y voy a repetir el procedimiento varias veces, rellenando nuevamente mi filtro celular con PBS, ejerciendo más presión con el émbolo de mi jeringa y transfiriendo al tubo hasta que tenga entre 30 y 40 mililitros de PBS en mi tubo. Así es como se ve el filtro celular una vez que he terminado. Ahora que he recolectado todas las células, voy a centrifugarlas durante aproximadamente 10 minutos a 1200 RPM.

Aquí están las células que saqué del centrífugo y el sedimento es bastante grande, lo cual es esperado tras una centrifugación. Ahora voy a eliminar el sobrenadante. Por supuesto, el sedimento permanece en el fondo del tubo. Y para facilitar la suspensión, voy a resuspender el sedimento mientras aún esté casi seco.

Y para ello, simplemente lo golpeo con el dedo bastante fuerte hasta que vea que el PT está completamente desagregado y hemos vuelto a una suspensión de células individuales. Ahora voy a resuspender mis células en PBS estéril y estoy añadiendo cinco mililitros de PBS por timer. Y como solo tengo un timer, simplemente estoy añadiendo cinco mililitros.

Y esta es la suspensión que voy a llevar al irrigador para su origen. Y el nivel de irrigación que utilizo es de 30 grados para asegurarme de que las células aún estén vivas, pero van a morir dentro de unas pocas horas. De este modo, aún pueden procesar el antígeno, pero no contaminarán mi cultivo.

Si observamos las células T que deseamos activar, vemos que no tienen un aspecto saludable en absoluto. Algunas ya han comenzado a morir. Tienen formas extrañas y ya no se encuentran presentes.

Entonces, esas células están listas para ser activadas. De hecho, están muy necesitadas de antígeno tras los sitios de tiempo. Es extremadamente importante lavarlas rápidamente porque algunas de ellas habrán muerto y liberarán compuestos tóxicos en la solución.

Añado, completo el tubo hasta 50 mililitros con mi solución de PBS. Y al mismo tiempo, voy a transferir las células T que están esperando la estimulación. Las voy a transferir a otro tubo de 50 mililitros para poder centrifugar ambos tubos al mismo tiempo.

Así que aquí está la sangre que recogí hace un rato, la dejé durante 10 minutos a 37 grados y luego la puse sobre hielo. Y como pueden ver, ha coagulado completamente. Por lo tanto, necesito el suero de esa sangre.

Entonces, para recogerlo en el primer paso utilizando una pipeta de pasta estéril, voy a despegar el coágulo del tubo y voy a recoger todo el líquido, que contendrá el suero en el que estoy interesado. También algunas células que no quedaron atrapadas en el coágulo. Y este líquido lo voy a transferir a otro tubo; durante la transferencia, a veces pequeños fragmentos de coágulo pueden acompañarlo, pero eso no representa un problema mayor, ya que de todos modos necesito eliminar las células que aún se encuentran en ese líquido.

Así que voy a centrifugar mi pequeño tubo con el líquido dentro. Eso eliminará las células y cualquier fragmento de coágulo que venga junto. Ahora voy a centrifugar la parte líquida de la sangre simplemente para separar las células del suero. De modo que centrifugar durante dos minutos será suficiente.

Ahora el suero ha sido centrifugado, así que voy a retirar el suero de las células. Este no es un ejemplo perfecto porque el suero debería ser amarillento y este es rojizo, lo que indica que tuve hemólisis. Entonces, esto no es absolutamente perfecto, pero de todos modos les mostraré cómo lo filtro.

Utilizo una jeringa con filtro adaptado de 0,2 micrones y voy a filtrar mi suero para asegurarme de que esté estéril. Pero dado que tuve hemólisis, no usaré esta muestra de suero para mi estimulación. En su lugar, usaré suero de rata de Louis que fue congelado durante un experimento previo.

Aquí están los PT de las células T a la izquierda y las células presentadoras de antígenos a la derecha. Ahora voy a eliminar el sobrenadante de ambos tubos. Y como antes, voy a resuspender los pellet golpeando ligeramente con el dedo para asegurarme de que las células vuelvan a una suspensión de células individuales.

Y voy a hacerlo para ambos grupos de células, las células T y las células presentadoras de antígenos. Después de eso, las voy a suspender y voy a contarlas. Luego, voy a mezclar 3 millones de células T con 150 millones de células presentadoras de antígenos, y las voy a colocar en placas de Petri de 10 centímetros de diámetro.

Y en un volumen total de 10 ml, aquí hay dos tubos de suero. El de la derecha es el que preparé hoy y es rojizo debido a la hemólisis, mientras que el de la izquierda es un tubo que preparé hace unos días y que mantuve congelado. Es amarillento, no tiene hemólisis y es mucho mejor.

Ese es el que voy a usar para mi cultivo de tejidos hoy. Tengo suficientes células para estimular seis placas de Petri, así que voy a añadir 30 ml de medio en las células presentadoras de antígenos y 30 ml del mismo medio en las células T. Luego, en el tubo de las células presentadoras de antígenos, voy a añadir el antígeno, que es albúmina.

Mi stock está a un miligramo por ml y deseo una concentración final en mis placas de Petri de 10 microgramos por ml. Y en el medio de linfocitos T voy a añadir suero de rata Louis. Voy a añadir una cantidad suficiente para que al final, en mis placas de Petri, tenga un 1% de suero de rata.

Voy a homogeneizar mi suspensión de células presentadoras de antígenos y luego transferiré cinco mililitros de esta suspensión celular a cada una de mis placas de Petri. Cuando saque su suspensión de células presentadoras de antígenos, siempre notará un pequeño agregado de grasa y tejido fibroso. Es completamente normal.

Está presente en todo nuestro tiempo de preparación del sitio. No es algo de qué preocuparse. Así que simplemente lo elimino si puedo, o de lo contrario lo dejo en la placa de Petri.

No afecta en absoluto a mi cultivo celular. Y una vez que haya transferido todas las APC a mis placas de Petri, voy a repetir el procedimiento con la célula T. Así que voy a colocar cinco mililitros de suspensión de células T en cada una de esas placas de Petri.

Ahora todas mis células están en las placas de Petri y es muy importante mezclarlas bien para que todas las células T tengan la oportunidad de entrar en contacto con una célula presentadora de antígenos. Para ello, apilo mis placas de Petri y voy a mezclarlas dibujando ochos invisibles con las placas. Lo hago varias veces para asegurarme de que todas las células queden bien mezcladas.

Y una vez que haya terminado con toda la mezcla, voy a colocar esos recipientes en un incubador con una atmósfera húmeda a 37 grados C y 5 %CO₂. He mantenido el cultivo en el incubador durante 48 horas. El medio ha cambiado ligeramente de color, ahora es más anaranjado, y las células se han activado adecuadamente.

Entonces, reviso todos los platos de Petri uno por uno bajo el microscopio. Las células muy grandes son los linfocitos T activados y las muy pequeñas son las células presentadoras de antígenos muertas. Y la estimulación es muy buena porque se puede observar que los linfocitos T son enormes.

Y si muevo un poco la placa de Petri, ups, pueden ver en el lado izquierdo aquí, ahora está en el centro, hay un gran grupo de células y esas son células que se están dividiendo activamente. Así que ahora voy a colocar todas las células en tubos de centrífuga para poder centrifugarlas, contarlas y luego inyectar 10 millones en ratas. De modo que la estimulación fue tan buena que no necesito todas esas células T para inyectar en una sola rata.

Entonces, lo que voy a hacer es utilizar solo células de dos placas de Petri. Voy a centrifugarlas por separado para inyectar 10 millones en la rata y el resto de las células lo voy a poner en cultivo para congelarlo en unos días.

Y el medio de cultivo es el medio habitual de cultivo de linfocitos T al que se añade el factor de crecimiento de linfocitos T y suero de caballo. Bueno, las células T son no adherentes, así que no necesito hacer mucho. Solo me aseguro de que la mayoría de las células pasen junto con el medio.

Y luego, al final, enjuagaré todos los pocillos con medio nuevo para asegurarme de que elimino todas las células. Diez mililitros de medio, el mismo que utilicé para la estimulación, y luego pienso en cada pocillo, aunque las células T ya hayan salido la primera vez que extraje el medio. Normalmente el medio sale del pocillo aquí, no es absolutamente necesario, pero dado que esas células son valiosas, no quiero perder ninguna.

Así que voy a centrifugarlos. Eso eliminará algunas de las células muertas y comenzaré principalmente con esas células. Y quiero proporcionarles un medio fresco.

Así que voy a volver a centrifugar a 1.500 RPM durante unos ocho minutos. Sigo dejando el freno puesto porque solo estoy sedimentando las células. Así que depositamos suavemente ambos tubos, y en uno tengo los pequeños pellets.

Esto proviene de los dos platos de Petri. Y aquí está el precipitado de los cuatro platos de Petri. Los precipitados son grandes porque no contienen solo las células T activadas, sino que también contienen las células presentadoras de antígenos.

Ahora voy a vaciar el sobrenadante y, en las células que voy a inyectar aquí, voy a añadir un mililitro de medio, que es lo que voy a usar para inyectar directamente. Y las otras células las voy a suspender en cien mililitros de medio de cultivo con factor de crecimiento de linfocitos T y suero de caballo. Esas son las células que voy a inyectar.

Y para estas células, voy a colocarlas en dos frascos de 50 ml cada uno. En cada frasco voy a añadir un 10 % de factor de crecimiento de linfocitos T, que es hueso fabricado. También añado un 10 % de suero de caballo activado por calor.

Luego voy a añadir la mayor parte del medio que necesito. No los pipeteo arriba y abajo porque a las células T no les gusta ser pipeteadas en exceso. Así que solo les añado la cantidad mínima absolutamente necesaria, ya que no les gusta, y simplemente completo hasta el volumen final y ya están listas.

Están listos para entrar en la incubadora; los reviso todos los días. Probablemente necesite dividirlos después de 24 horas, o si no, después de 40 a 48 horas con seguridad. Pero los revisaré cada día.

Tienen tendencia a crecer muy rápido en el factor de crecimiento de células T. Por lo tanto, deben dividirse al menos cada 48 horas, probablemente antes. También verificaré el color del medio de cultivo.

Ahora están activadas, por lo tanto están completamente activadas. Ese es el mejor momento para inyectarlas en la rata. Y en dos días desafiaremos a la rata en la oreja.

Si esperamos a que las células, si esperamos un par de días a que las células regresen al reposo, desean regresar rápidamente al sitio de inflamación. Ahora voy a colocarlas en la incubadora a 37 grados centígrados con 5%CO2, y voy a usar una aguja de calibre 25 para inyectar la rata por vía intravenosa. Ahora que las células han sido inyectadas, voy a dejar a la rata aquí y voy a desafiarla en las orejas dentro de 48 horas.

Hace varios días, inyecté células T específicas para albúmina marcadas con GFP en una rata anestesiada. Y hoy voy a desafiar a la misma rata en la oreja. Así que en la oreja derecha voy a inyectar albúmina.

Y en el oído izquierdo voy a inyectar algo de PBS. La dosis de volin que estoy inyectando es de 20 microgramos en 20 microlitros. Y la albúmina que estoy utilizando es una mezcla uno a uno de albúmina marcada con Texas red y albúmina no marcada.

Entonces, este es el inodoro sobre el cual voy a mostrarles cómo voy a inyectar. Tengo mi mano izquierda, soy diestro. Con mi mano izquierda, me quité el guante para poder colocar un dedo debajo de la oreja y el otro por encima, estirando así la piel para poder ver exactamente dónde estoy con la aguja y penetrar entre las dos capas de piel en el aire, que es muy delgada.

Para ello, utilizo agujas de calibre 27 para tener algo extremadamente delgado que pueda introducirse allí. Si lo giro, definitivamente pueden ver hacia dónde fue el Texas red y hacia dónde fue el PBS. Ahora estamos a 42 horas después de la exposición en el año, y voy a usar un micrómetro con resorte para medir el grosor de la oreja.

Así que voy a medir ambas orejas, la oreja derecha que fue expuesta al albúmina y la oreja izquierda que no fue expuesta. Y la diferencia en el grosor de las orejas nos dará una idea de la intensidad de la inflamación. Lo que les he mostrado aquí es todo el procedimiento para realizar una DTH adaptativa en ratas.

Así que les mostré cómo activar linfocitos T específicos para antígenos in vitro, cómo transferirlos adoptivamente a ratas, y luego cómo desafiar a esas ratas y medir el grado de inflamación. En el laboratorio de Chand utilizamos este procedimiento rutinariamente para evaluar el efecto de los bloqueadores de canales de potasio en la inflamación en ratas.