Name: Inducción y Seguimiento de Adopción de hipersensibilidad retardada en ratas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 6 s
Description: Aprende a inducir hipersensibilidad retardada adoptiva en ratas Lewis mediante la activación de células T efectoras de memoria específicas de antígeno. Este método permite monitorear la respuesta inflamatoria durante cinco días en modelos de inmunología.

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Agradecemos al Dr. Alexander Flugel (Martinsried, Alemania) para darnos la GFP-etiquetados, ovoalbúmina línea de células T específicas utilizadas en este protocolo.

1. La estimulación de los linfocitos T específicos ovoalbúmina Descanso específicos ovoalbúmina las células T son estimulados con ovoalbúmina en la presencia de ratas Lewis timocitos irradiados (30 Gy) como células presentadoras de antígeno (APC), en medio de estimulación (Preparar en DMEM + penicilina / estreptomicina / L + GLUT-AANE RPMI + Vitaminas + + 2ME suero de rata + ovoalbúmina, a las concentraciones finales se señala en la lista de materiales.) Suero de rata preparación <ol><li> Tomamos el suero de las ratas que el sacrificio como donantes timo. </li><li> Las ratas son profundamente anestesiados por inhalación de halotano y tanta sangre como sea posible es dibujado por la perfusión cardiaca (5-10 ml por rata) con jeringas de 10 ml y 23 G 1 &quot;agujas, después de que las ratas son decapitados inmediatamente para asegurar la muerte. </li><li> La sangre se deja coagular durante 10 minutos a 37 ° C seguido por 10 min en hielo. </li><li> El coágulo se extrae y se dio el resto del líquido. </li><li> El suero se recoge, filtra de manera estéril y almacenadas a -20 ° C. </li></ol> Preparación de las células presentadoras de antígeno <ol><li> Tome el timo de una rata decapitado con instrumentos estériles y colocarlo en PBS con penicilina y estreptomicina (PBS-PS), sobre el hielo. </li><li> Tome el timo a una campana de cultivo de tejidos, lo limpia de coágulos sanguíneos y otros tejidos contaminantes y cortar en trozos pequeños en un colador de la célula (Fisher # 08-771-2) colocada en una placa de Petri de 10 cm con 10 ml de PBS- PS. </li><li> Cada pieza se presiona a través del filtro de células usando la parte de atrás de un estéril de 1 ml émbolo de la jeringa. Recoger la única suspensión de células en un tubo de 50 ml en hielo. </li><li> Enjuague el filtro celular con 20-40 ml más de PBS-PS. Centrifugar la suspensión a 1250g y resuspender el precipitado en PBS-PS, 5 ml / timo, en el hielo. </li><li> Irradiar esta suspensión (30 Gy) en un irradiador gamma e inmediatamente lavar dos veces con 50 ml de PBS-PS. Nota: Los mejores donantes del timo son las ratas jóvenes adultos, de 5-7 semanas de edad. Las ratas de hasta 10 semanas puede ser utilizado, pero el número de células disminuye con el tiempo. El género no es importante, aunque algunas personas dicen que los hombres son mejores donantes del timo. Siempre usamos las mujeres, porque todos nuestros animales están alojados en la misma habitación y no queremos que hombres y mujeres en la misma habitación. </li></ol> Estímulo <ol><li> Lave los linfocitos T una vez y contar con ellos. </li><li> Contar las células presentadoras de antígeno. </li><li> Mezcle 3 x 10 6 ovoalbúmina específicos de las células T de 150 x 10 6 vehículos blindados en una placa de Petri de 10 cm con 10 ml de medio de estimulación. </li><li> Incubar durante 48 horas a 37 ° C. </li></ol> 2. La transferencia adoptiva de los linfocitos T específicos ovoalbúmina <ol><li> Las ratas que utilizamos como receptores son mujeres 70-10 semanas de edad. </li><li> Contar con los linfocitos T, que debe ser grande y redondo. Las células presentadoras de antígeno estará muerto. </li><li> Centrifugar los linfocitos T y volver a suspender las de 10 x 10 6 células / ml en PBS. </li><li> Inyectar 1 ml por vía intraperitoneal con jeringas de 3 ml y 23 G 1 agujas &quot;. </li></ol> 3. Desafío con el antígeno en el oído <ol><li> Dos días después de la transferencia adoptiva, se inyectan 20 l de una solución de 1 mg / ml ovoalbúmina (= antígeno relevante) por un oído y solución salina (o antígeno irrelevante) en el otro oído. No filtrar la solución de antígeno, ya que puede perder los agregados que potencian la reacción inflamatoria. Nota: Las ratas deben ser anestesiados para evitar movimientos. Si usted es diestro, mantenga la oreja entre el dedo pulgar izquierdo y el dedo índice, el dedo índice está dentro del oído y de la rata frente a usted. </li><li> Se inyecta la solución en el pabellón auricular de la oreja utilizando 27G ½ &quot;agujas. Trate de inyectarse a todas las ratas exactamente en el mismo lugar. </li></ol> 4. La medición de DTH <ol><li> El oído comenzará a girar roja e hinchada como un signo de inflamación. Medir el grosor de cada oído con un micrómetro de resorte (por ejemplo modelo PK-0505 de Mitutoyo). </li><li> Tome 5-6 mediciones para cada oído en cada punto del tiempo y calcular la media. </li><li> La inflamación máximo debe ocurrir entre 24 y 72 horas. </li></ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. , 166-936 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+monitoring+of+active+delayed+type+hypersensitivity+%28DTH%29in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats.</a> J Vis Exp. (5), (2007).</li>
</ol>

El desafío antigénico también se puede realizar en otros sitios, por ejemplo en la piel de la espalda (2). Sin embargo nos encontramos que un reto. Usando el pabellón de la oreja, como se muestra en este video, permite la medición más precisa de la reacción de DTH.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>12430-062</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>1 mM final, en medio de estimulación</td></tr><tr><td>Penicilina &amp;#8211; Estreptomicina &amp;#8211; L-Glutamina</td><td>Cambrex/BioWhittaker</td><td>17-718R</td><td>100 u/ml - 100 &amp;#x03BC;g/ml - 4 mM respectivamente, final, en medio de estimulación</td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td>NEAA, 1% final, en medio de estimulación</td></tr><tr><td>Vitaminas RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7256</td><td>1% final, en medio de estimulación</td></tr><tr><td>Beta-mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>2ME, 50 &amp;#x03BC;M final, en medio de estimulación</td></tr><tr><td>Suero de rata síngeo</td><td></td><td></td><td>1% final. Véase explicación en el Protocolo.</td></tr><tr><td>Ovoalbúmina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml final, en medio de estimulación.</td></tr></tbody></table>

inducción y seguimiento de adopción de hipersensibilidad retardada en ratas

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

Retardada de hipersensibilidad (DTH) es una reacción inflamatoria mediada por CCR7-efector linfocitos T de memoria que se infiltran en el sitio de la inyección de un antígeno contra el que ha sido el sistema inmunológico preparado. La reacción inflamatoria se caracteriza por enrojecimiento e inflamación del sitio de estímulos antigénicos. Es un modelo práctico para determinar la eficacia in vivo de los inmunosupresores. DTH cutánea puede ser inducido, ya sea por transferencia adoptiva de linfocitos T antígeno-específicos o mediante la inmunización activa con un antígeno, y el desafío posterior intradérmica con el antígeno para inducir la reacción inflamatoria en la piel de una zona determinada. Respuestas DTH pueden ser inducidas a diversos antígenos, para la ovoalbúmina ejemplo, la tuberculina, toxoide tetánico, o hemocianina de lapa californiana. Estas reacciones también pueden ser inducidos en contra de autoantígenos, por ejemplo, proteína básica de mielina (MBP) en ratas con encefalomielitis autoinmune experimental inducida con MBP, un modelo animal de esclerosis múltiple (1). Aquí se demuestra la forma de inducir una reacción adoptivos DTH en ratas Lewis. En primer lugar, se estimula la ovoalbúmina específicos de las células T in vitro y se inyecta por vía intraperitoneal estas células activadas a las ratas ingenuo. Después de permitir que las células que se equilibre en vivo durante 2 días, le desafío a las ratas con ovoalbúmina en el pabellón de una oreja, mientras que el otro oído Wil reciben solución salina. La reacción inflamatoria será visible 3-72 horas más tarde y espesor de la oreja se medirá como una indicación de la gravedad de DTH.

Retardada de hipersensibilidad (DTH) es una reacción inflamatoria mediada por CCR7-T de memoria efectora (TEM) de linfocitos. Aquí se demuestra cómo activar antígenos específicos de células TEM, inducir DTH adoptivos en ratas Lewis y controlar la respuesta inflamatoria.

Inducción y Seguimiento de Adopción de hipersensibilidad retardada en ratas

La hipersensibilidad retardada (DTH) es una reacción inflamatoria mediada por linfocitos T de memoria efectores CCR7+ que infiltran el sitio de inyección de ...

Soy Christine Beaton. Soy investigadora asistente en el laboratorio de George Chen, del Departamento de Fisiología y Biofísica de la Universidad de California en Irvine. Y en los próximos días les mostraré el procedimiento para inducir y medir la DTH adaptativa en ratas Louis.Este procedimiento dura cinco días y lo que voy a mostrarles es cómo activar linfocitos T específicos para un antígeno, cómo inyectarlos luego, dos días después, en ratas ingenuas. A continuación, dos días más tarde, desafiaremos a las ratas en las orejas con el antígeno para el cual esos linfocitos T son específicos. Y al día siguiente, vamos a medir el grado de inflamación en esas ratas.Para obtener suero para mi cultivo de tejidos, necesito obtener la sangre. Para ello, realizo una punción cardíaca. Coloco mi dedo índice izquierdo sobre el plexo solar y alcanzo el corazón a través de las costillas, entre las costillas con mi aguja, y aspiro la mayor cantidad posible de sangre.Y a partir de una extracción, dependiendo del día y de la eficiencia, podemos obtener entre dos y diez mililitros de sangre de una rata determinada. Y la razón por la que necesitamos suero en el cultivo es que deseamos cultivar células

induction-monitoring-adoptive-delayed-type-hypersensitivity

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra la puntuación de inducción y clínicas de un modelo animal de esclerosis múltiple: las enfermedades crónico-recidivante la encefalomielitis autoinmune experimental en ratas DA. La enfermedad, inducida por la inmunización de ratas con una emulsión que contiene la médula espinal de ratas y toda adyuvante completo de Freund, presenta un cuadro clínico parecido a la enfermedad humana.

La inducción y la puntuación clínica de enfermedades crónico-recurrente encefalomielitis autoinmune experimental

Retardada de hipersensibilidad (DTH) es una reacción inflamatoria mediada por CCR7-efector linfocitos T de memoria. Aquí se demuestra la forma de inducir DTH activa en ratas Lewis y controlar la respuesta inflamatoria.

Inducción y seguimiento de activos de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) en ratas

Aquí se demuestra un método para inducir y registrar el progreso de un retraso de tipo de hipersensibilidad (DTH) la reacción en el oído de la rata. Esto es seguido por una demostración de la elaboración de tejidos de ratas oído para la imagen de dos fotones de la respuesta del efector / memoria de células T.

Imágenes de las células efectoras T de memoria en el oído después de la inducción de DTH adoptivos

Este video muestra la forma de inducir hipofisitis autoinmune en ratones SJL y la forma de evaluar su gravedad por la histopatología.

La inducción de la hipofisitis autoinmune experimental en ratones SJL

Se describe un ensayo de diagnóstico valiosa que potencialmente podría ser utilizado para decidir la retirada de la inmunosupresión después del trasplante sin riesgo elevado de rechazo del injerto. El ensayo utiliza los principios de la hipersensibilidad de tipo retardado y proporciona una evaluación precisa de ambos donantes respuestas inmunes efectoras y reglamentarias específicas montados por los destinatarios.

Trans-vivo hipersensibilidad de tipo retardada Ensayo para Antigen Reglamento Específico

Aquí, presentamos un protocolo para inducir tolerancia en el trasplante y evaluar in vitro e in vivo la capacidad supresora de subconjuntos distintos de la célula del receptor y el estado inmune del receptor hacia el donante o los antígenos exógenos.

In Vitro e In Vivo la evaluación de la actividad supresora T, B y las células mieloides y las respuestas humorales de los receptores de trasplante

Describimos aquí métodos para el tratamiento de neonatal de capsaicina inducir dermatitis atópica en las ratas y la exposición de formaldehído vaporizado para investigar los efectos de la inhalación de formaldehído en dermatitis atópica.

Efectos de la exposición de formaldehído a un modelo de rata de la Dermatitis atópica inducida por el tratamiento Neonatal de capsaicina

Este protocolo utiliza péptidos mixtos G6PI para construir modelos de artritis reumatoide que están más cerca de la artritis reumatoide humana en células CD4+ T y citoquinas. Células T asesinas naturales invariables de alta pureza (principalmente iNKT2) con fenotipos y funciones específicas se obtuvieron mediante inducción in vivo y purificación in vitro para inmunoterapia adoptiva.

Inmunoterapia adoptiva de células iNKT en ratones RA inducidos por glucosa-6-fosfato (G6PI)

La hipersensibilidad de contacto (CHS) es un modelo experimental murino de dermatitis alérgica de contacto (ACD). El CHS se basa en la sensibilización con hapteno reactivo mediante la pintura de la piel afeitada del pecho y el abdomen, con un posterior desafío de la piel del oído con un hapteno diluido, causando una reacción de hinchazón que se evalúa de varias maneras.

Hipersensibilidad de contacto como modelo murino de dermatitis alérgica de contacto

Aquí, presentamos un protocolo conciso para crear un modelo de rata prematura, facilitando la investigación sobre el manejo temprano del dolor posnatal. El método consiste en realizar una cesárea tres días antes del parto previsto, extraer crías de rata prematuras mediante histerectomía e integrarlas con la descendencia biológica de una madre sustituta.

Un modelo de rata prematura para estudios del dolor

El estudio demuestra el papel de la piel en la modulación de las respuestas inmunitarias en ratones a través de la inmunización epicutánea (EC). La inmunización de la AE con un antígeno proteico puede suprimir las respuestas inmunitarias en la hipersensibilidad de contacto o revertir la supresión inducida por la piel cuando se combina con patrones moleculares asociados a patógenos. La inmunización anticonceptiva anticonceptiva (AE) se muestra prometedora como un enfoque eficaz y sin agujas para...

Modelo murino de inmunomodulación inducida epicutáneamente

Aprende a inducir hipersensibilidad retardada adoptiva en ratas Lewis mediante la activación de células T efectoras de memoria específicas de antígeno. Este método permite monitorear la respuesta inflamatoria durante cinco días en modelos de inmunología.

Inducción y Seguimiento de Adopción de hipersensibilidad retardada en ratas

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