Video-velocidad de barrido y microscopía confocal Microendoscopy

Este video demuestra cómo construir un microscopio confocal de barrido de velocidad de video utilizando componentes estándar listos para usar. Un microscopio confocal de barrido se basa en el movimiento coordinado de dos espejos de barrido para trasladar el haz a través del plano de trama La luz del primer espejo se escanea horizontalmente a través del primer conjunto de lentes de relé, que la enfoca de nuevo a un punto estacionario en el segundo espejo de exploración. A continuación, el mismo movimiento de escaneo se traduce a través de las lentes de escaneo y de tubo, colocando el haz de luz ahora expandido en la apertura posterior de la lente del objetivo.

El segundo espejo, cuyo movimiento es lento en comparación con el primer espejo, escanea simultáneamente el eje Y, lo que permite la acción de escaneo por encima y por debajo del plano ilustrado y crea un ráster rectangular en la superficie de la muestra. La principal ventaja de este protocolo sobre la compra de un microscopio disponible comercialmente es el bajo costo y la capacidad de personalizar el instrumento a las necesidades específicas de un proyecto de imagen. Al trabajar con cualquier láser, es vital tomar las medidas de seguridad adecuadas para evitar lesiones en el ojo.

Asegúrese de usar las gafas de seguridad láser adecuadas siempre que sea posible. Los espectadores y/o investigadores que no se alineen o trabajen activamente con el haz siempre deben usar anteojos. Quítese todos los relojes o joyas brillantes y reflectantes.

Lo más importante es asegurarse de seguir y controlar el haz en todo momento terminando su trayectoria con un bloque de viga o una tarjeta de visita montada. Esto es especialmente importante cuando se recubren espejos, ya que la trayectoria del haz puede ser difícil de predecir. Además, nunca haga que sus ojos estén al nivel de la trayectoria del haz.

Apague el láser si necesita cruzar el plano del haz antes de ensamblar el microscopio. Asegúrese de que todo el equipo necesario para la construcción esté disponible, incluyendo la placa de pruebas óptica y los soportes de 90 grados, todos los espejos, lentes y dicroicos, junto con las abrazaderas y herrajes de montaje adecuados, tanto los espejos de escaneo como el fotodetector. También es útil tener a mano un generador de funciones para probar la acción de escaneo y manipular los espejos durante la alineación.

También se recomienda encarecidamente atornillar la placa de pruebas para mayor estabilidad. Comience la construcción del microscopio colocando el controlador de fibra flexible en la montura óptica y colocando este conjunto en el centro de la placa de pruebas óptica. Esto corresponde al origen del rayo azul como se muestra aquí.

Encienda la fuente de luz. Utilice los tornillos de ajuste para ajustar aproximadamente la viga de modo que se desplace en línea recta tanto horizontal como verticalmente. Coloque un iris frente al colador de fibras.

A continuación, ajusta la altura del iris para que el haz pase por el centro. A continuación, aleje el iris del ator a lo largo de la trayectoria del haz. Compruebe la alineación de la viga.

Utilice los dos tornillos de ajuste para reposicionar el haz en el iris si es necesario. Coloque el espejo diic montado en la trayectoria del haz con el rayo láser colocado en el centro del espejo. Gire el soporte del espejo para reflejar el haz a aproximadamente 90 grados, asegurándose de que la altura del haz no cambie.

Sujete el espejo a la mesa apretando los tornillos del soporte. A continuación, coloque el espejo métrico galván resonante montado en la trayectoria del rayo láser. Tenga cuidado de asegurarse de que el rayo láser esté colocado en el centro horizontal exacto de la superficie del espejo.

Gire la montura del espejo para reflejar el rayo láser en un ángulo de 90 grados. A continuación, ajuste aproximadamente el reflejo del espejo para mantener la misma altura vertical del rayo láser. A continuación, toma dos iris y colócalos directamente frente a la chica resonante.

Luego, usando el rayo láser reflejado en el espejo gal resonante como referencia, establezca su altura vertical como antes. Ahora, utilizando los orificios de los tornillos de la placa de pruebas óptica como guía para el ojo, sujete los dos iris en línea recta. Ajusta el primer espejo en el camino, que es el dicroico para centrar el haz en el primer iris.

A continuación, ajuste el segundo espejo en el trazado. La chica resonante para centrar el haz en el segundo iris. Ajuste iterativamente estos dos espejos hasta que el haz esté alineado a través de ambos iris.

Asegurándose de que el rayo láser reflejado por el espejo gal resonante aún se refleje desde el centro aproximado del espejo. Si el haz está desviado, ajuste el soporte del colador de fibra y repita los ajustes con el haz centrado en ambos iris abiertos. El siguiente paso es colocar las dos lentes de relé que tomarán imágenes del primer plano telecéntrico estacionario en el segundo plano telecéntrico estacionario.

Para este microscopio en particular, las lentes seleccionadas en el primer relé tienen la misma distancia focal F, por lo que la distancia entre los dos espejos aquí es simplemente cuatro F. Para esta configuración, F equivale a 90 milímetros, por lo que la posición de cuatro F estará a 360 milímetros del espejo de escaneo. Para asegurarse de que las lentes estén centradas con precisión en la trayectoria del haz, coloque la primera lente en la trayectoria del haz y observe el punto del rayo láser en el siguiente iris en la trayectoria del haz. Siguiendo la lente, ajuste la altura de la lente para que el centro vertical del haz esté en el centro del iris.

A continuación, ajuste la posición horizontal del haz para centrar el haz en el iris. Repite este proceso con la segunda lente. A continuación, se instalará el espejo de escaneo y se girará el microscopio para facilitar la colocación y alineación sencillas de las piezas que, de otro modo, tendrían que ajustarse verticalmente.

Para encontrar la posición exacta del segundo plano telecéntrico, conecte el gal O resonante a su unidad de escaneo y enciéndalo. Utilice una tarjeta de visita para seguir la trayectoria del haz de escaneo a través de las dos lentes. El segundo plano telecéntrico se situará aproximadamente a cuatro F de la gal O residente y puede identificarse como el emplazamiento en el que el haz de exploración parece estacionario.

Marque la placa de pruebas debajo de esta ubicación con un lápiz. Una vez que se haya identificado el plano telecéntrico, configure la entrada del espejo de escaneo a cero voltios y encienda el hardware de control del espejo para que el espejo se asiente en su posición neutral. A continuación, coloque el espejo galil de escaneo estándar en la ubicación exacta del teleavión.

Ajuste la posición del espejo de modo que el haz en el teleplano incida en el centro exacto del espejo de escaneo y apriete la montura del espejo. Ahora afloje el tornillo de bloqueo que sujeta el espejo gal y gírelo, asegúrese de que el haz se propague verticalmente. Ahora apague el láser y los dispositivos electrónicos de escaneo.

Desconecte la fibra y desconecte los espejos de escaneo. Luego, use soportes de montaje de placa de pruebas de 90 grados. Asegure la segunda placa de pruebas a la primera.

Finalmente, gire con cuidado todo el microscopio para que la nueva placa de pruebas quede plana y use la abrazadera para asegurar el microscopio en su posición. Vuelva a conectar el gal o y el láser aquí y recuerde devolver el gal O a cero voltios. El resto de la configuración anteriormente vertical se puede llevar a cabo fácilmente en la placa de pruebas plana.

A continuación, configuraremos el segundo conjunto de lentes de relé, conocido formalmente como lente de escaneo y lente de tubo. Consulte el protocolo escrito adjunto para obtener información muy importante sobre cómo elegir la combinación correcta de lentes. Comience por configurar las lentes.

Primero, coloque los espejos necesarios para dirigir el haz hacia la lente del objetivo. Coloque el primer espejo grande de dos pulgadas cerca del borde de la placa de pruebas y gire el soporte del espejo para reflejar el rayo láser aproximadamente 90 grados aproximadamente. Ajuste el reflejo del espejo para mantener la misma altura del haz vertical.

Luego coloque el espejo de otras dos pulgadas en el borde opuesto de la placa de pruebas para dirigir el haz en un ángulo de 90 grados y use los tornillos de ajuste para fijarlo en su lugar. A continuación, coloque dos iris y ajuste los dos espejos como antes para centrar el haz. A continuación, coloque la lente de escaneo a su distancia focal desde el gal en la trayectoria del haz y ajuste su posición horizontal y vertical.

Para centrar el punto láser en el primer iris entre los dos espejos. Coloque con cuidado la lente de tubo grande de dos pulgadas a la distancia adecuada de la lente de escaneo y ajuste su posición horizontal y vertical para centrar el haz en el primer iris. En esta configuración, la lente del tubo se coloca a una distancia de 75 milímetros más 300 milímetros con todos los componentes en su lugar.

Conecte el gal O a la salida de un generador de función eléctrica estándar o circuito de control, y ajuste los voltajes de pico a pico a uno a tres voltios. A continuación, empieza a escanear los dos espejos con una tarjeta de visita. Ubique el rayo láser en el plano estacionario, 300 milímetros después de la lente del tubo.

Coloque la lente del objetivo en la trayectoria del haz, asegurándose de colocar la apertura trasera de la lente del objetivo lo más cerca posible del plano estacionario. Configure la etapa de muestreo, asegurándose de que la montura del eje Z traducible no golpee la montura del objetivo a medida que se traslada a través de su rango. Para configurar el confocal, el estenopeico y el detector, comience por desconectar todas las fuentes de alimentación y la fibra óptica.

Gire el conjunto del microscopio de modo que vuelva a descansar sobre la placa de pruebas, sosteniendo el espejo de exploración resonante. Después de volver a conectar la fibra al colimador y al espejo de escaneo estándar, los cables de alimentación, suministro y control, coloque cero voltios en el voltaje de control que impulsa el gal de escaneo estándar como antes en el escenario, coloque una muestra de un sándwich de tinte brillante entre dos cubreobjetos. A continuación, encienda la fuente láser y enfoque el tinte.

Ajuste la potencia del láser para que la fluorescencia sea lo más brillante posible con una tarjeta de presentación. Traza la emisión fluorescente de la muestra a través de la lente del objetivo a través del sistema de escaneo hasta el espejo dicroico, que refleja el rayo láser y transmitirá la emisión fluorescente. Encuentra esta señal fluorescente en el otro lado del espejo dicroico.

Ahora atenúa las luces de la habitación. Coloque un espejo detrás del espejo dicroico para reflejar la emisión en un ángulo de 90 grados. Luego, usando un iris con un espejo, dirija el haz de fluorescencia lo más recto y paralelo posible a la placa de pruebas.

A continuación, la unidad estenopeica confocal se configurará utilizando el conjunto de montaje en jaula de filtro espacial de Thor Labs. Este diagrama describe la configuración. El espejo de escaneo se encuentra en planos estacionarios que son tele con un objetivo estacionario.

Los pares de planos de apertura trasera de lentes entre los planos estacionarios actúan para transmitir los haces escaneados. El primer par de lentes tiene lentes focales iguales formando un telescopio uno a uno. El segundo par de lentes, conocido formalmente como lente de escaneo y lente de tubo, no necesita ser igual y tener una distancia focal y, a menudo, sirven como un telescopio de expansión de haz para garantizar que la apertura posterior del objetivo esté sobrellenada.

La luz emitida por la muestra viaja de vuelta a través del sistema de escaneo y pasa a través del espejo dicroico. Una lente de enfoque corto o una lente de objetivo enfoca la luz de emisión a través del orificio confocal, que luego es cotejada por una lente. Una lente final enfoca la emisión filtrada confocal en un tubo fotomultiplicador.

Coloque la unidad de filtro espacial en línea con la trayectoria del haz de emisión, teniendo cuidado de centrar la primera montura de lente de enfoque en el haz de emisión. En este caso, se seleccionó una unidad de filtro espacial con un tamaño de agujero de alfiler de 100 micras. A continuación, monte una lente de distancia focal corta en la unidad y deslice la montura de traslación Z hasta que se pueda observar un enfoque claro en la superficie estenopeica.

Asegúrese de que toda la unidad esté orientada a lo largo de la línea recta establecida por el haz fluorescente. Sujete la unidad a la placa de pruebas. Ahora, usando las perillas de ajuste en la etapa de traducción, ajuste los dos ejes para realizar una búsqueda 2D sobre la superficie de montaje del orificio para encontrar el punto donde se maximiza la señal fluorescente a través del orificio.

A continuación, coloque la lente de recubrimiento en la montura de la jaula Después del agujero de alfiler con una tarjeta de presentación, busque el ion fluorescente que pasa a través de la unidad confocal y deslice la lente de recubrimiento a lo largo de los postes hasta que la fluorescencia emitida esté lo más recopilada posible. Configure el conjunto del tubo multiplicador de fotos. Coloque una lente de distancia focal de 50 milímetros en la trayectoria del haz de emisión fluorescente y encuentre su punto focal.

Marque esta posición en la placa de pruebas. Ahora apague el láser por completo y coloque el tubo multiplicador de fotos de modo que su ventana esté ubicada lo más cerca posible del punto focal marcado. Luego, usando tubos de lente ajustables, conecte el conjunto a la lente de enfoque.

Envuelva con cinta oscura todas las trayectorias del haz expuestas siguiendo el orificio, encienda el láser, manteniendo su potencia extremadamente baja. Encienda el tubo fotomultiplicador leyendo cuidadosamente su voltaje en el osciloscopio. A medida que aumenta la intensidad del láser, aumente el voltaje hasta que se pueda ver una lectura similar a un pico o un desplazamiento de CC en la pantalla del osciloscopio.

Confirme que esta señal surge efectivamente de la fluorescencia apagando la potencia del láser o bloqueando la trayectoria del haz para observar una pérdida de señal. Por último, alinee iterativamente el orificio para obtener la máxima señal en el osciloscopio. Al manipular primero la posición Z de la lente de enfoque y luego ajustar la etapa de traslación YZ, el hardware del microscopio de velocidad de video está completo.

Primero, apague el tubo multiplicador de fotos. Ahora conecte los espejos, los tableros de control personalizados y la computadora como se diagrama en el protocolo escrito adjunto. Este sistema se puede adaptar para la realización de microendoscopia de barrido confocal.

Al reemplazar la etapa con una etapa de retención de fibra, consulte el texto o los detalles adjuntos. El microscopio de barrido confocal vertical terminado y el microendoscopio deben aparecer como se muestra aquí. El láser y los haces de emisión se han dibujado como una guía para el ojo.

Durante la operación de microendoscopia, un soporte de fibra mantiene la fibra de imagen en su lugar para los experimentos. Este soporte de fibra podría reemplazarse fácilmente con una etapa XY para usos. Una plataforma de microscopio vertical que se muestra aquí es una imagen de prueba representativa tomada de una M minúscula impresa en una tarjeta de presentación blanca utilizando una tarjeta capturadora de fotogramas de velocidad de video para generar imágenes a partir de la señal entrante. Blanqueado.

El papel blanco contiene una fuerza de flúor que se excita fácilmente con la luz ultravioleta y azul, lo que da como resultado un fondo brillante detrás de la oscuridad. Se eligió la letra M y el filtro de emisión centrado a 515 nanómetros para recoger esta emisión fluorescente. Se puede observar una pequeña distorsión de la imagen, especialmente cerca de los bordes laterales del marco de la imagen.

Esta distorsión es el resultado del patrón de escaneo sinusoidal del espejo gvo de ocho kilohercios y se discute en detalle en el documento adjunto. Esta película muestra datos de velocidad de video de muestra obtenidos al escanear una tarjeta de presentación. Después de ver este video, ahora debería tener una buena comprensión de cómo construir y alinear un microscopio de barrido confocal de velocidad de video.

No olvide que trabajar con luz láser puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como quitarse todas las joyas reflectantes y evitar trabajar con los ojos al nivel de la línea del haz mientras se realiza este procedimiento.