Name: Un día de flujo de trabajo Método de detección de patógenos bacterianos y pruebas de resistencia a los antimicrobianos de cultivos de sangre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprende un flujo de trabajo de un día para identificar patógenos bacterianos en hemocultivos y evaluar su resistencia a antibióticos mediante PCR cuantitativa del ADN ribosómico 16S. Este método acelera el diagnóstico clínico.

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Este trabajo fue apoyado por el azm Profileringsfonds (PF245).

PARTE I: la identificación de patógenos 1. Preparación de la muestra Nota: El flujo de trabajo molecular que se describe en el siguiente protocolo se debe realizar de acuerdo a las recomendaciones para garantizar la calidad en el diagnóstico molecular 3. <ol><li> Añadir una alícuota de 0,1 ml de cultivo de sangre a 0,9 ml de NaCl al 0,9% en un tubo de 1,5 ml de reacción para convertirse en una muestra diluida 1:10. (Diluir con el fin de prevenir la inhibición qPCR). </li><li> Centrifugar la muestra a 13400 xg durante 5 minutos para sedimentar el ADN bacteriano. </li><li> Resuspender el sedimento bacteriano en 100 l estéril desmineralizada H 2 O. </li><li> Almacenar la muestra de ADN a 4 ° C hasta su uso posterior. </li></ol> 2. Ensayo de identificación: en tiempo real PCR 16S rDNA <ol><li> Preparar las mezclas de reacción de la siguiente manera. El ensayo consiste en cuatro reacciones separadas por muestra. Cada mezcla incluye 12,50 maestro de lmezcla, 0,9 mM cebador (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) 7, cebador 0,6 mM inversa (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) 8 y un panel de sondas. La cantidad de sondas se da para cada una de las cuatro reacciones separadas en adelante. </li><li> La primera reacción incluye: <ul><li> 0,2 mM universal de la sonda (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8 </li><li> 0,2 mM p aeruginosa sonda (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1) </li></ul></li><li> La segunda reacción incluye: <ul><li> 0,2 mM E. la sonda coli (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1) </li><li> 0,2 mM de Pseudomonas spp. de la sonda (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ) </li></ul></li><li> La tercera reacción incluye: <ul><li> 0,2 mM Staphylococcus spp. de la sonda (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ) </li><li> 0,2 mM de S. la sonda aureus (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1) </li><li> 0,2 mM de Enterococcus spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1) </li></ul></li><li> La reacción cuarto incluye: <ul><li> 0,2 mM universal de la sonda (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) </li><li> 0,3 mM Streptococcus spp. de la sonda (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ) </li><li> 0,2 mM de S. pneumoniae de la sonda (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1) </li></ul></li><li> Añadir desmineralizada estéril, H 2 O para llegar a un volumen total de 20 l. Añadir 20 l de cada mezcla de reacción a los pocillos de una placa de 96 pocillos de PCR. </li><li> Añadir 5 l de muestra a cada pocillo. </li><li> Utilizar una película adhesiva para sellar la placa 96-así PCR. </li><li> Ejecutar la placa en el ABI PRISM 7900HT Sistema de Tiempo Real PCR utilizando los siguientes ciclos térmicos condiciones óptimas: <ul><li> Pre-calentamiento a 50 ° C durante 10 min </li><li> Desnaturalización a 95 ° C durante 15 minutos </li><li> 42 ciclos de <ul type="circle"><li> Desnaturalización a 95 ° C durante 15 s </li><li> El recocido a 60 ° C durante 1 minuto </li></ul></li></ul></li></ol> 3. Análisis de los resultados <ol><li> Ajuste el umbral del análisis de Ct a 0,1 en la pestaña Configuración de análisis. Limitar las configuraciones de referencia para empezar (Ciclo): 6 y el fin (del ciclo): 15. </li><li> Registre el ciclo umbral (Ct), el valor de todas las muestras. El valor de corte para considerar un resultado positivo por PCR como se puede ajustar a un valor de CT-35. La cantidad de bacterias presentes en los cultivos de sangre osciló entre 07 al 10 10 11 UFC / ml, la generación de Ct valores por debajo de 35. </li></ol> PARTE II: pruebas de susceptibilidad antimicrobiana 4. El aislamiento de bacterias de cultivos de sangre positivos 9 <ol><li> Aspirar 5 ml de caldo de una botella de hemocultivo positivo y la transfiere en un tubo separador de suero. </li><li> Centrifugar el tubo separador de suero a 2000 xg durante 10 min. </li><li> Se desecha el sobrenadante del tubo separador de suero. </li><li> Transferencia de bacbacterias de la capa de gel del tubo con una torunda de algodón estéril en solución salina al 0,9% hasta un 0,5 McFarland suspensión estándar se obtiene. </li></ol> 5. La inoculación de las placas Micro Titre <ol><li> Diluir la suspensión 0,5 McFarland en doble concentrado caldo Mueller Hinton II para formar una suspensión de 5 x 10 5 UFC / ml. </li><li> Añadir esta suspensión a los pocillos de una placa de micro título que contiene una selección de antibióticos (Tabla 1). </li><li> Se incuba la placa micro título a 37 ° C durante 6 h. </li><li> Almacenar una alícuota de la suspensión a 4 ° C (como testigo de crecimiento negativo). </li><li> Después de 6 horas de incubación, transferir el contenido de cada pocillo en un tubo estéril, así como la muestra de control de crecimiento negativo que se almacenó a 4 ° C. </li><li> Centrifugar los tubos a 16000 xg durante 5 min. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante, sin perturbar el sedimento bacteriano. </li><li> Resuspender el precipitado en H desmineralizada estéril <li> Diluir las muestras de 10 veces en estériles desmineralizada H 2 O. </li></li></ol> 6. En tiempo real de PCR del rDNA 16S 10 <ol><li> Preparar la mezcla de PCR como sigue: <ul><li> 12,50 l iQ SYBR Green Supermix </li><li> 0,5 mM cebador 16S-1 (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11 </li><li> 0.25 16S-2 micras de imprimación inversa (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11 </li><li> estéril desmineralizada H 2 O hasta un volumen total de 20 l </li></ul></li><li> Añadir 20 l de mezcla de PCR a los pocillos de una placa de 96 pocillos de PCR. </li><li> Añadir 5 l de muestra a cada pocillo. </li><li> Utilizar una película adhesiva para sellar la placa 96-así PCR. </li><li> Ejecutar la placa en el MyiQ un solo color en tiempo real del sistema de detección por PCR, utilizando las siguientes condiciones óptimas ciclos térmicos: <ul><li> Desnaturalización a 95 ° C durante 4 minutos </li><li> Inicial recocido a 65 ° C durante 30 s </li><li> 35 ciclos de <ul><li> Desnaturalización a 95 ° C durante 15 s </li><li> El recocido a 60 ° C durante 1 minuto </li></ul></li><li> Fundir análisis de la curva (60 a 95 ° C en 20 minutos con incrementos de 0,57 ° C) </li></ul></li></ol> 7. Análisis de los resultados <ol><li> Calcular el valor de corte de Ct utilizando una de las fórmulas siguientes (dependiendo del tipo de antibiótico). <ul><li> En general: De corte el valor Ct = Ct de control de valor de un crecimiento positivo + 0,5 x (control de Ct valor de crecimiento negativo - el control de Ct valor de crecimiento positivo) </li><li> Piperacilina, piperacilina / tazobactam y ceftazidima en bacilos Gram-negativos, amoxicilina, oxacilina y trimetoprim / sulfametoxazol en el S. aureus, Enterococcus spp amoxicilina en:. De corte Ct = valor de control de valor de Ct crecimiento positivo + 0,25 x (crecimiento Ct valor negativo - Control Ct valor de crecimiento positivo) </li></ul></li><li> Use la muestra se incuba con agua estéril desmineralizada H 2 O, como testigo de crecimiento positivo.</li><li> Dependiendo del microorganismo, utiliza el control apropiado de crecimiento negativo: <ul><li> Gram-negativos Muestra varillas se incubaron con la mezcla de antibióticos </li><li> Enterococcus spp. Muestra almacenada a 4 ° C </li><li> Ejemplo de S. aureus se almacena a 4 ° C </li></ul></li><li> Determinar la susceptibilidad (S) o resistencia (R) de la cepa para el antibiótico ensayó como sigue: <ul><li> Un valor Ct superior al valor de corte de Ct indica la susceptibilidad </li><li> Un valor de Ct inferior al valor de corte de Ct indica que la resistencia </li></ul></li></ol> 8. Los resultados representativos Dos organismos modelo, es decir, una E. Gram-negativos coli y S. una Gram-positivas aureus, se eligen para visualizar el procedimiento combinado para la detección e identificación de bacterias patógenas y la determinación de su perfil antimicrobiano. La primera parte del protocolo comprende la identificación de patógenos. Spesondas específicas están diseñadas para la detección de ocho microorganismos clínicamente relevantes. En presencia de un objetivo incluido en el panel bacteriana, curvas de amplificación se generan y Ct valores se calculan (Figura 2). El valor de corte para considerar un resultado positivo por PCR como se establece en un valor de Ct de 35 años. En la Figura 2A, el perfil de identificación de un cultivo de sangre infectada con E. coli se muestra. La sonda 16S universal está incluida en dos mezclas de reacción separadas y, en consecuencia genera dos curvas de amplificación (Ct de 25,20 y 25,95). La tercera señal se deriva de la sonda específica para E. E. (Ct de 27.04). La identificación de una S. aureus infectada cultivo de sangre se muestra en la Figura 2B. La sonda 16S universal tiene señales de amplificación de 33,35 y 33,71. Las dos señales restantes se derivan de las sondas específicas para Staphylococcus spp. y S. aureus (Ct de 32,48 y 30,59). La figura 3 es un ejemplo de un gráfico de amplificación pruebas de susceptibilidad a los antibióticos, en representación de la cepa de E. coli que se mostró también en la Figura 2A. Cada línea representa un antibiótico que la muestra bacteriana se incubó con. Una muestra con un bajo valor de CT es una muestra en la que se ha producido crecimiento en presencia de una resistencia a los antibióticos, lo que indica que el antibiótico probada. Por el contrario, un alto valor Ct representa una muestra en la que no hay crecimiento se ha producido por el funcionamiento efectivo de la susceptibilidad a los antibióticos, lo que indica que el antibiótico probada. La Tabla 1 ilustra la determinación del perfil de los antimicrobianos de la E. coli y S. aureus aislados. Todos los valores de Ct se informan y, utilizando las fórmulas mencionadas en el texto del protocolo (7,1), dos de corte los valores de Ct se calcularoncionado a distinguir entre la resistencia y susceptibilidad. La cepa es resistente a los antibióticos, si el valor de Ct informado es más bajo que el calculado valor de corte de Ct (y viceversa). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento de identificación de patógenos y la susceptibilidad a los antibióticos mediante pruebas en tiempo real PCR del rDNA 16S. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 Ensayo de identificación:. Parcelas de amplificación y los valores de ciclo umbral (Ct valores) Un cultivo de sangre positivo se detecta por lo universal de la sonda de ADNr 16S, mientras que las sondas específicas se utilizan para la identificación del agente causal.. Parcela A. amplificación de cultivo de sangre que contiene E. coli; parcela B. amplificación de la cultura de la sangre que contiene S. aureus, Pseudomonas ae, Pseudomoncomo P. aeruginosa, uni, 16S universal de la sonda; Ecoli, Escherichia coli de la sonda, Pseudomonas sp, Pseudomonas spp. la sonda, S. pneumoniae, Streptococcus pneumoniae sonda; Strep sp, Streptococcus spp. la sonda, Entero, Enterococcus spp. la sonda, S. aureus, la sonda de Staphylococcus aureus, estafilococo sp, Staphylococcus spp. sonda. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Amplificación parcela de las pruebas de sensibilidad antibiótica de una E. E. aislar (muestra 1). Cada curva representa un antibiótico que la cepa se incubó con. Una señal temprana es causada por una alta carga bacteriana, lo que significa que la cepa ha crecido en presencia del antibiótico probado y es por lo tanto resistentes al antibiótico. Señales tardías indican que la cepa no ha crecido en presencia del antibiótico, en otras palabras, es susceptible. <table border="1"><tbody><td> Ejemplo 1: E. E. </td><td></td><td></td><td> Ejemplo 2: S. Staphylococcus </td><td></td><td></td><tr><td> AST </td><td> Ct </td><td> R / S </td><td> AST </td><td> Ct </td><td> R / S </td></tr><tr><td> La amoxicilina 8 mg / l </td><td> 16,83 </td><td> R </td><td> La amoxicilina 0,25 mg / l </td><td> 21,03 </td><td> R </td></tr><tr><td> La amoxicilina-ácido clavulánico 4.8 mg / L </td><td> 17,36 </td><td> R </td><td> Oxacilina 2 mg / l </td><td> 25,80 </td><td> S </td></tr><tr><td> Piperacilina 16 mg / l </td><td> 16,67 </td><td> R </td><td> La vancomicina 2 mg / l </td><td> 25,20 </td><td> S </td></tr><tr><td> Piperacilina-tazobactam 16 /4 mg / l </td><td> 24,15 </td><td> S </td><td> La gentamicina 4 mg / l </td><td> 25,86 </td><td> S </td></tr><tr><td> La ciprofloxacina 1 mg / l </td><td> 29,72 </td><td> S </td><td> Trimetoprim-sulfametoxazol 2/38 mg / L </td><td> 24,62 </td><td> S </td></tr><tr><td> La ceftazidima 1 mg / l </td><td> 24,03 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> La ceftazidima 8 mg / l </td><td> 26,58 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> La gentamicina 4 mg / l </td><td> 29,83 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trimetoprim-sulfametoxazol 2/38 mg / L </td><td> 27,60 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Control de crecimiento negativo (mezcla de antibióticos) </td><td> 30,41 </td><td></td><td> Testigo de crecimiento negativo (muestra almacenada a 4 ° C) </td><td> 27,42 </td><td></td></tr><tr><td> Control de crecimiento positivo </td><td> 16,90 </td><td></td><td> Control de crecimiento positivo </td><td> 20,22 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> De corte CT-valor de 1 * </td><td> 21,76 </td><td></td><td> De corte CT-valor 1 *** </td><td> 23,82 </td><td></td></tr><tr><td> De corte CT-valor 2 ** </td><td> 18,75 </td><td></td><td> De corte CT-valor 2 **** </td><td> 22,02 </td><td></td></tr><tr><td> * Para la amoxicilina, amoxicilina-clavulánico, ciprofloxacino, gentamicen, trimetoprim-sulfametoxazol ** Para piperacilina, piperacilina-tazobactam, ceftazidime </td><td></td><td></td><td> *** Para vancomicina y gentamicina **** Para amoxicilina, oxacilina y trimetoprim-sulfametoxazol </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Determinación de las pruebas de sensibilidad antibiótica de las dos muestras (E. coli y S. aureus). Ct valores de la PCR-ensayo fueron copiados a este archivo de Excel, ya que automáticamente se calcula las dos línea de corte alores Ct del control de crecimiento positivo y negativo, utilizando las fórmulas que aparecen en el texto del protocolo. Si un antibiótico muestra un valor de Ct menor que el valor de corte Ct, la cepa es resistente a los antibióticos, si el valor de CT fue mayor que la de corte, la cepa es susceptible.

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

El protocolo aquí descrito permite la identificación rápida de patógenos y ofrece un perfil funcional a los antimicrobianos que puedan conducir a la administración precoz de antibióticos adecuados, mejorando así el pronóstico de los pacientes con infecciones del torrente sanguíneo. Dependiendo de las condiciones exigidas de una prueba, es decir, costo bajo, alto rendimiento, un mínimo de tiempo de vuelta, las condiciones de prueba se puede ajustar. Todo el procedimiento se puede realizar en un día de trabajo. Además, las dos partes del protocolo puede realizarse simultáneamente, lo cual reduce el tiempo de giro alrededor de manera significativa. Por lo aquí expuesto, el panel de identificación es una selección de las bacterias con mayor relevancia clínica en nuestro hospital. Desde el principio principal se dirige a la región del gen 16S, las sondas específicas para otros microorganismos pueden ser diseñados y se añade a la del ensayo. El ensayo completo fue originalmente pensado para el análisis rápido de los cultivos de sangre, pero también pueden ser utilizados para el procesamiento de Otros materiales de la muestra. Este es también el caso de los antibióticos que se utilizaron para las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos: los antibióticos más o se pueden agregar otros, con base en los patrones de resistencia locales y directrices.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> De cloruro de sodio (NaCl) </td><td> Merck Chemicals </td><td> 106404 </td><td> 0,9% en agua </td></tr><tr><td> Vacutainer SST suero tubo separador 5 ml </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 367986 </td><td></td></tr><tr><td> Mueller Hinton II caldo de </td><td> BD Diagnostic Dystems </td><td> 212322 </td><td> 44 g / l en agua </td></tr><tr><td> Centrifugar Rotixa 50 rs </td><td> Andreas Hettich GmbH &amp; Co. KG </td><td> 4910 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga 5415 D </td><td> Eppendorf </td><td> Suspendido </td><td></td></tr><tr><td> Primers </td> &lt;td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> na </td><td></td></tr><tr><td> Sondas </td><td> Sigma-Aldrich/Applied Biosystems </td><td> na </td><td></td></tr><tr><td> TaqManEnvironmental maestro de la mezcla 2,0 </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4396838 </td><td></td></tr><tr><td> iQ SYBRGreen Supermix </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> 170-8880 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp óptica de 96 pocillos de reacción </td><td> Applied Biosystems </td><td> N8010560 </td><td></td></tr><tr><td> Película MicroAmp adhesivo óptico </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> iQ PCR de 96 pocillos placas </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> 223-9441 </td><td></td></tr><tr><td> Microseal B burletes adhesivos en </td><td> Bio-Rad Trabajoatories BV </td><td> MSB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> PCR en tiempo real del sistema de detección </td><td> Applied Biosystems </td><td> ABI PRISM 7900HT </td><td></td></tr><tr><td> PCR en tiempo real del sistema de detección </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> MyiQ un solo color </td><td></td></tr></tbody></table>

un día de flujo de trabajo método de detección de patógenos bacterianos y pruebas de resistencia a los antimicrobianos de cultivos de sangre

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Infecciones del torrente sanguíneo se asocia con altas tasas de mortalidad a causa de la manifestación probable de sepsis, sepsis grave y shock séptico 1. Por lo tanto, la administración rápida de la terapia antibiótica adecuada es de importancia principal en el tratamiento de infecciones del torrente sanguíneo. El elemento crítico en este proceso es el tiempo, depende en gran medida los resultados de la identificación de bacterias y pruebas de susceptibilidad a los antibióticos. Ambos de estos parámetros son rutinariamente obtenida por cultivo basado en pruebas, que consume tiempo y necesita una media de 24-48 horas 2, 4. El objetivo del estudio fue desarrollar ensayos basados ​​en el ADN para la identificación rápida de infecciones del torrente sanguíneo, así como pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana. El primer ensayo es un 16S rDNA eubacterial real basado en PCR en tiempo complementadas con especies del género-o sondas específicas 5. El uso de estas sondas, bacterias Gram-negativas, incluyendo Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosay Escherichia coli, así como las bacterias Gram-positivas como Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp. y Streptococcus pneumoniae pueden ser distinguidos. El uso de este ensayo de Multiprobe, una primera identificación del microorganismo causal se da después de 2 horas. En segundo lugar, hemos desarrollado un ensayo molecular para el semi-pruebas de sensibilidad antibiótica de S. aureus, Enterococcus spp. y (facultativo) aerobios bacilos Gram-negativos 6. Este ensayo se basa en un estudio en el que la PCR se utilizó para medir el crecimiento de bacterias 7. Las bacterias recolectadas directamente de los cultivos de sangre se incubaron durante 6 horas con una selección de los antibióticos, y después de un SYBR Green-tiempo real basado en el ensayo de PCR determina la inhibición del crecimiento. La combinación de estos dos métodos podría dirigir la elección de una terapia antibiótica apropiada, en el mismo día (Figura 1). En conclusión, El análisis molecular de ambos identificación y susceptibilidad a los antibióticos ofrece una alternativa más rápida para la detección de patógenos, y podría mejorar el diagnóstico de infecciones del torrente sanguíneo.

El diseño de un esquema de flujo de trabajo sencillo de un día para el diagnóstico de patógenos bacterianos permite el reconocimiento rápido de infecciones del torrente sanguíneo. La inclusión de los ocho objetivos bacterianos clínicamente relevantes y sus perfiles de resistencia a los antibióticos ofrece al clínico una visión inicial en el mismo día, que puede conducir a una terapia más adecuada.

Un día de flujo de trabajo Método de detección de patógenos bacterianos y pruebas de resistencia a los antimicrobianos de cultivos de sangre

Las infecciones del torrente sanguíneo se asocian con altas tasas de mortalidad debido a la probable manifestación de sepsis, sepsis grave y choque séptico1. ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar y evaluar la susceptibilidad a antibióticos de los aislamientos de cultivos de sangre en menos tiempo que con los métodos convencionales. Esto se logra primero identificando el aislamiento del cultivo de sangre, mediante un novedoso ensayo de PCR múltiple de ADN ribosómico 16 s.Luego, el aislado se incuba con un panel de antibióticos durante seis horas. El siguiente paso consiste en determinar el crecimiento o la inhibición del crecimiento del aislado en presencia del antibiótico, utilizando un ensayo cuantitativo de PCR del ADN ribosomal 16S. En última instancia, los resultados muestran que la identificación y la prueba de susceptibilidad a antibióticos de un aislado de cultivo de sangre pueden obtenerse más rápidamente mediante esta combinación de cultivo y PCR.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los que utilizan sistemas automatizados Phoenix o IIC, es que no requiere estado previo de cultivo, y que los resultados de identificación y de prueba de sensibilidad a antibióticos pueden estar disponibles el mismo día. Realizarán la demostración del procedimiento Vandy Hanson y estudiantes de doctorado en GID del laboratorio. Diluya 100 microlitros de cultivo de sangre positivo para crecimiento microbiano en un tubo de reacción que contiene 900 microlitros de cloruro de sodio al 0,9 %. Luego, centrifugue la muestra a 13.400 × g durante cinco minutos para formar el pellet bacteriano tras la centrifugación.Reese, suspenda el precipitado en 100 microlitros de agua desmineralizada estéril. Almacene la muestra a cuatro grados Celsius hasta su uso posterior. Una vez que todas las muestras estén listas, prepare las mezclas de reacción de PCR en tiempo real para amplificar el ADN ribosómico 16 s específico de las bacterias de interés.Utilice agua desmineralizada para ajustar los volúmenes a 20 microlitros por reacción. Aliquote 20 microlitros de la mezcla de PCR por pocillo en una placa de PCR de 96 pocillos. Luego agregue cinco microlitros de muestra a cada pocillo y selle la placa de PCR.A continuación, realice la PCR en el sistema de PCR en tiempo real A BI Prism 7,900 HT para analizar los resultados una vez finalizada la PCR. Primero, utilice la pestaña de configuraciones de análisis para ajustar el análisis de CT a 0,1. Luego, reduzca las configuraciones de línea base para que comiencen en el ciclo seis y terminen en el ciclo 15. Registre el valor de CT para cada muestra.El valor de corte para considerar un resultado de PCR como positivo generalmente puede establecerse en un valor de CT de 35. En este ejemplo, se muestra el perfil de identificación de un cultivo sanguíneo infectado por e coli en dos mezclas de reacción. Se incluyeron cebadores universales de ADN ribosómico 16 s y generaron dos curvas de amplificación con valores de CT de 25,2 y 25,95.La tercera curva de amplificación se deriva de la sonda específica para Coli. Otras sondas específicas no generaron señales detectables. Una vez que se ha identificado el patógeno, se puede realizar la prueba de antibióticos.Comience transfiriendo cinco mililitros de caldo desde un cultivo sanguíneo positivo a un tubo con separador de suero. Centrifugue la muestra a 2000 ×g durante 10 minutos; tras la centrifugación, deseche el sobrenadante del tubo. Luego, utilizando un hisopo estéril de algodón, transfiera las bacterias desde la capa gelatinosa del tubo a cloruro de sodio al 0,9 %, hasta obtener una solución con una turbidez equivalente al estándar de McFarland 0,5.Esto corresponde a aproximadamente 1,5 veces 10 a la ocho unidades formadoras de colonias por mililitro. A continuación, diluya la suspensión en caldo Mueller Hinton de concentración doble para obtener una concentración de aproximadamente cinco veces 10 a la cinco unidades formadoras de colonias por mililitro.Aliquotar 50 microlitros por pocillo de la suspensión en una placa de microtitulación que ya contenga 50 microlitros por pocillo de una selección de antibióticos. Asegúrese de incluir controles positivos de crecimiento para cada muestra utilizando pocillos con agua en lugar de antibióticos. Tapar la placa al finalizar.Luego, incube la placa a 37 grados Celsius durante seis horas para permitir el crecimiento bacteriano. Asegúrese de almacenar una alícuota de la suspensión bacteriana a cuatro grados Celsius como control negativo de crecimiento. Después de la incubación de seis horas, transfiera el contenido de cada pocillo y la muestra del control negativo a tubos estériles separados.Tras una centrifugación de cinco minutos a 16.000 × g, retire 80 microlitros de sobrenadante y resuspenda los precipitados en 80 microlitros de agua estéril desmineralizada. Diluya las muestras a una relación de 1:10 en agua antes de utilizarlas para la PCR en tiempo real del ARN ribosómico 16S.Prepare la mezcla de PCR utilizando la mezcla súper IQ cyber green y los cebadores de ADN ribosómico 16 s, y alícuota de 20 microlitros por pocillo en una placa de PCR de 96 pocillos. Luego, agregue cinco microlitros de cada muestra a los pocillos y selle la placa.A continuación, realice la PCR para analizar los resultados. Primero, calcule el valor de CT de corte. En general, el CT de corte equivale al CT del control de crecimiento positivo más 0,5 veces el CT del control de crecimiento negativo menos el CT del control de crecimiento.Sin embargo, para piperacilina con tazobactam y CEF dazadi en bacilos gramnegativos, así como para amoxicilina, oxacilina y trimetoprim con sulfametoxazol en estafilococo aureus o a partir de amoxicilina. En enterococo SPP, el factor de multiplicación de 0,5 debe reducirse a 0,25. La susceptibilidad o resistencia de las cepas en cada muestra puede determinarse comparando el CT de la muestra con el CT de corte.Un valor de CT por encima del punto de corte indica susceptibilidad, mientras que un valor de CT por debajo del punto de corte indica resistencia. A continuación se muestra un ejemplo de un gráfico de amplificación para la susceptibilidad a antibióticos. La cepa de e coli identificada previamente fue analizada para determinar su sensibilidad a varios antibióticos, cada uno representado por una curva distinta.Las muestras con un valor bajo de CT son aquellas en las que ha ocurrido crecimiento en presencia de un antibiótico, lo que indica resistencia al antibiótico ensayado. Por el contrario, un valor alto de CT representa una muestra en la que no ha ocurrido crecimiento, lo que indica susceptibilidad al antibiótico ensayado. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en nueve horas si se lleva a cabo correctamente.

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Inmunología e Infección

Un protocolo rápido para la identificación directa de Enterococcus faecalis y otras especies de Enterococcus en un hemocultivo positivo con un ácido péptido nucleico ensayo de hibridación fluorescente in situ (FISH ANP).

Un procedimiento de 1,5 horas para la identificación de Enterococcus Especies directamente los cultivos de sangre

Biosensores fagos líticos y los granos de anticuerpos son capaces de discriminar entre resistente a la meticilina (MRSA) y la bacteria estafilococo sensibles. Los fagos se inmovilizaron mediante un método de Langmuir-Blodgett sobre una superficie de un sensor de microbalanza de cristal de cuarzo y trabajaron como amplias sondas estafilococo gama. Perlas de anticuerpos reconocen SARM.

Biosensor para la detección de antibióticos Las bacterias estafilococo resistentes

Una preparación rápida sedimento bacteriano de un cultivo de sangre positivo puede ser utilizado como una muestra para aplicaciones tales como la identificación por MALDI-TOF, la tinción de Gram, la prueba de susceptibilidad a los antibióticos y prueba basada en PCR. Los resultados pueden ser comunicados rápidamente a los médicos a mejorar el resultado de pacientes que sufren de infecciones del torrente sanguíneo.

Preparación de una Cultura de pellets de sangre para Rapid bacteriana Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los antibióticos

Los antibióticos etiquetados fluorescentemente son herramientas poderosas que se pueden utilizar para estudiar múltiples aspectos de la resistencia a los antimicrobianos. Este artículo describe la preparación de antibióticos etiquetados fluorescentemente y su aplicación para estudiar la resistencia a los antibióticos en bacterias. Las sondas se pueden utilizar para estudiar mecanismos de resistencia bacteriana (por ejemplo, eflujo) por espectrofotometría, citometría de flujo y microscopía.

Visualización de la resistencia bacteriana mediante sondas fluorescentes antibióticas

Este protocolo presenta un ensayo rápido de prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) dentro de las 2,5 h mediante imágenes de dispersión Raman estimuladas por células individuales del metabolismo de D2O. Este método se aplica a las bacterias en la orina o en el entorno sanguíneo completo, que es transformador para la AST fenotípica unicelular rápida en la clínica.

Pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana mediante imágenes de dispersión Raman estimuladas de la incorporación de deuterio en una sola bacteria

Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento e identificación de bacterias resistentes a antibióticos del agua y la caracterización molecular de sus genes de resistencia a antibióticos (ARG). El uso de técnicas basadas en cultivos y no basadas en cultivos (análisis metagenómico) proporciona información completa sobre la diversidad bacteriana total y el conjunto total de diferentes ARG presentes en aguas dulces de Mumbai, India.

Aislamiento e identificación de bacterias resistentes a antibióticos transmitidas por el agua y caracterización molecular de sus genes de resistencia a antibióticos

Aquí presentamos el principio, la estructura y las instrucciones del sistema inteligente de detección de fagos / pruebas de sensibilidad antimicrobiana de alto rendimiento. Su aplicación se ilustra utilizando como ejemplo la Salmonella aislada de aves de corral en Shandong, China. Se calcula el índice Lar y se discute exhaustivamente su importancia en la evaluación de la resistencia a los antimicrobianos.

Aplicación del sistema inteligente de detección de fagos y pruebas de sensibilidad antimicrobiana de alto rendimiento y lar índice de resistencia a los antimicrobianos

EUCAST ha desarrollado un protocolo de pruebas directas de susceptibilidad a los antimicrobianos (AST) para hemocultivos automatizados. Sin embargo, su dependencia de la identificación microbiana basada en espectrometría de masas puede evitarse mediante el uso de un protocolo de preparación directa de inóculo en un sistema automatizado de identificación microbiana. Este enfoque puede proporcionar informes AST dentro de las 24 horas posteriores a la recolección de la muestra.

Identificación microbiana directa mediante un sistema automatizado de identificación microbiana para facilitar el método EUCAST RAST sin espectrometría de masas

Varios patógenos bacterianos pueden causar infecciones del tracto respiratorio y provocar graves problemas de salud si no se detectan con precisión y se tratan con prontitud. La detección rápida y precisa de estos patógenos a través de la amplificación isotérmica mediada por bucle proporciona una gestión y un control eficaces de las infecciones del tracto respiratorio en entornos clínicos.

Detección rápida de patógenos bacterianos que causan infecciones del tracto respiratorio inferior a través de la amplificación isotérmica mediada por bucle basada en chips microfluídicos

Este protocolo describe un método LAMP basado en un chip microfluídico completamente integrado que permite la detección, en un punto de atención, de 15 patógenos que causan infecciones del tracto respiratorio inferior en pacientes de UCI dentro de una hora.

Detección rápida en el punto de atención de patógenos causantes de infecciones del tracto respiratorio inferior en pacientes de la UCI

Aprende un flujo de trabajo de un día para identificar patógenos bacterianos en hemocultivos y evaluar su resistencia a antibióticos mediante PCR cuantitativa del ADN ribosómico 16S. Este método acelera el diagnóstico clínico.

Un día de flujo de trabajo Método de detección de patógenos bacterianos y pruebas de resistencia a los antimicrobianos de cultivos de sangre (Video) | JoVE Journal

Un día de flujo de trabajo Método de detección de patógenos bacterianos y pruebas de resistencia a los antimicrobianos de cultivos de sangre

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