Un día de flujo de trabajo Método de detección de patógenos bacterianos y pruebas de resistencia a los antimicrobianos de cultivos de sangre

El objetivo general de este procedimiento es identificar y evaluar la susceptibilidad a antibióticos de los aislamientos de hemocultivo en menos tiempo que con los métodos convencionales. Esto se logra primero identificando el aislamiento de hemocultivo mediante un novedoso ensayo de PCR múltiple de ADN ribosomal 16 s.

Luego, el aislado se incuba con un panel de antibióticos durante seis horas. El siguiente paso consiste en determinar el crecimiento o la inhibición del crecimiento del aislado en presencia del antibiótico, utilizando un ensayo cuantitativo de PCR del ADN ribosómico 16S. En última instancia, los resultados muestran que la identificación y la prueba de susceptibilidad a antibióticos de un aislado de cultivo de sangre pueden obtenerse más rápidamente mediante esta combinación de cultivo y PCR.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los que utilizan sistemas automatizados Phoenix o IIC, es que no requiere estado previo de cultivo, y que los resultados de identificación y de prueba de sensibilidad a antibióticos pueden estar disponibles dentro del mismo día. Realizando el procedimiento estarán Vandy Hanson y estudiantes de doctorado del GID de nuestro laboratorio. Diluya 100 microlitros de cultivo de sangre positivo para crecimiento microbiano en un tubo de reacción que contiene 900 microlitros de cloruro sódico al 0,9 %. Luego, centrifugue la muestra a 13.400 × g durante cinco minutos para formar un sedimento bacteriano tras la centrifugación.

Reese, suspenda el precipitado en 100 microlitros de agua estéril desmineralizada. Almacene la muestra a cuatro grados Celsius hasta su uso posterior. Una vez que todas las muestras estén listas, prepare las mezclas de reacción de PCR en tiempo real para amplificar el ADN ribosómico 16 s específico de las bacterias de interés.

Utilice agua desmineralizada para ajustar los volúmenes a 20 microlitros por reacción. Aliquote 20 microlitros de la mezcla de PCR por pocillo en una placa de PCR de 96 pocillos. Luego, agregue cinco microlitros de muestra a cada pocillo y selle la placa de PCR.

A continuación, realice la PCR en el sistema de PCR en tiempo real A BI Prism 7,900 HT para analizar los resultados una vez finalizada la PCR. En primer lugar, utilice la pestaña de configuraciones de análisis para ajustar el análisis de CT a 0,1. Luego, reduzca las configuraciones de línea base para que comiencen en el ciclo seis y terminen en el ciclo 15. Registre el valor de CT para cada muestra.

El valor de corte para considerar un resultado de PCR como positivo generalmente puede establecerse en un valor de CT de 35. En este ejemplo, se muestra el perfil de identificación de un cultivo sanguíneo infectado por E. coli en dos mezclas de reacción. Se incluyeron cebadores universales de ADN ribosómico 16S y generaron dos curvas de amplificación con valores de CT de 25,2 y 25,95.

La tercera curva de amplificación se deriva de la sonda específica para Coli. Otras sondas específicas no generaron señales detectables. Una vez que se ha identificado el patógeno, se puede realizar la prueba de antibióticos.

Comience transfiriendo cinco mililitros de caldo de una hemocultivo positivo a un tubo separador de suero. Centrifugue la muestra a 2000 ×g durante 10 minutos; tras la centrifugación, deseche el sobrenadante del tubo. Luego, utilizando un hisopo estéril de algodón, transfiera las bacterias desde la capa gelatinosa del tubo a cloruro de sodio al 0,9 % hasta obtener una solución con una turbidez equivalente al estándar de McFarland 0,5.

Esto corresponde a aproximadamente 1,5 veces 10 a la ocho unidades formadoras de colonias por mililitro. A continuación, diluya la suspensión en caldo Mueller Hinton al doble de concentración para obtener una concentración de aproximadamente cinco veces 10 a la cinco unidades formadoras de colonias por mililitro.

Aliquotar 50 microlitros por pocillo de la suspensión en una placa de microtitulación que ya contenga 50 microlitros por pocillo de una selección de antibióticos. Asegúrese de incluir controles positivos de crecimiento para cada muestra utilizando pocillos con agua en lugar de antibióticos. Tapar la placa al finalizar.

Luego, incube la placa a 37 grados Celsius durante seis horas para permitir el crecimiento bacteriano. Asegúrese de almacenar una alícuota de la suspensión bacteriana a cuatro grados Celsius como control negativo de crecimiento. Después de la incubación de seis horas, transfiera el contenido de cada pocillo y la muestra del control negativo a tubos estériles separados.

Tras una centrifugación de cinco minutos a 16.000 × g, retire 80 microlitros de sobrenadante y resuspenda los pellet en 80 microlitros de agua estéril desmineralizada. Diluya las muestras 1:10 en agua antes de usarlas para la PCR en tiempo real del ARN ribosómico 16S.

Prepare la mezcla de PCR utilizando la mezcla súper IQ cyber green y los cebadores de ADN ribosómico 16 s, y alícuota de 20 microlitros por pocillo en una placa de PCR de 96 pocillos. Luego, agregue cinco microlitros de cada muestra a los pocillos y selle la placa.

A continuación, realice la PCR para analizar los resultados. Primero, calcule el valor de CT de corte. En general, el CT de corte equivale al CT del control de crecimiento positivo más 0,5 veces el CT del control de crecimiento negativo menos el CT del control de crecimiento.

Sin embargo, para piperacilina con tazobactam y CEF dazadi en bacilos gramnegativos, así como para amoxicilina, oxacilina y trimetoprim con sulfametoxazol en staphylococcus aureus o a partir de amoxicilina en enterococcus SPP, el factor de multiplicación de 0,5 debe reducirse a 0,25. La susceptibilidad o resistencia de las cepas en cada muestra puede determinarse comparando el CT de la muestra con el CT de corte.

Un valor de CT por encima del punto de corte indica susceptibilidad, mientras que un valor de CT por debajo del punto de corte indica resistencia. A continuación se muestra un ejemplo de un gráfico de amplificación de susceptibilidad a antibióticos. La cepa de e coli identificada anteriormente fue analizada para determinar su sensibilidad a varios antibióticos, cada uno representado por una curva independiente.

Las muestras con un valor bajo de CT son aquellas en las que ha ocurrido crecimiento en presencia de un antibiótico, lo que indica resistencia al antibiótico ensayado. Por el contrario, un valor alto de CT representa una muestra en la que no ha ocurrido crecimiento, lo que indica susceptibilidad al antibiótico ensayado. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en nueve horas si se lleva a cabo correctamente.