Un día de flujo de trabajo Método de detección de patógenos bacterianos y pruebas de resistencia a los antimicrobianos de cultivos de sangre

El objetivo general de este procedimiento es identificar y evaluar la susceptibilidad a los antibióticos de los aislados de hemocultivo en menos tiempo que con los métodos convencionales. Esto se logra identificando primero el cultivo de sangre aislado. Utilizando un nuevo ensayo de PCR multiPro de ADN ribosómico 16 s.

A continuación, el aislado se incuba con un panel de antibióticos durante seis horas. El siguiente paso es determinar el crecimiento o el crecimiento en inhibición del aislado en presencia del antibiótico utilizando un ensayo cuantitativo de 16 s ribosómico D-N-A-P-C-R. En última instancia, los resultados muestran que la identificación y las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos de un aislado de hemocultivo se pueden obtener más rápidamente a través de esta combinación de cultivo y PCR.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los que utilizan sistemas automatizados phoenix o IIC, es que no se requiere un estado de cultivo previo y que los resultados de la identificación y las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos pueden estar disponibles en el mismo día. La demostración del procedimiento correrá a cargo de Vandy Hanson y los estudiantes de doctorado de GID de nuestro laboratorio: Diluir 100 microlitros de hemocultivo positivo para crecimiento microbiano en un tubo de reacción que contiene 900 microlitros de cloruro de sodio al 0,9%. A continuación, centrifugar la muestra a 13,400 veces G durante cinco minutos para granular las bacterias después de la centrifugación.

Reese, suspender el pellet en 100 microlitros de agua desmineralizada estéril. Instale la muestra a cuatro grados centígrados hasta su uso posterior. Una vez que todas las muestras estén listas, prepare las mezclas de reacción de PCR en tiempo real para amplificar el ADN ribosómico específico de 16 s de las bacterias de interés.

Utilice agua desmineralizada para ajustar los volúmenes a 20 microlitros por reacción. Alícuota de 20 microlitros de mezcla de PCR por pocillo en una placa de PCR de 96 pocillos. A continuación, añada cinco microlitros de muestra a cada pocillo y selle la placa de PCR.

A continuación, ejecute la PCR en el sistema de PCR en tiempo real A BI Prism 7, 900 HT para analizar los resultados una vez que se complete la PCR, primero use la pestaña de configuración de análisis para ajustar el análisis CT a 0.1. A continuación, reduzca las configuraciones de referencia para iniciar el ciclo seis y finalizar el ciclo 15. Registre el valor de CT para cada muestra.

El valor de corte para considerar un resultado de PCR como positivo generalmente se puede establecer en un valor de CT de 35. En este ejemplo, el perfil de identificación de un hemocultivo infectado con E. coli se muestra en dos mezclas de reacción. Se incluyeron cebadores de ADN ribosómico universal 16 s y se generaron dos curvas de amplificación de CT 25.2 y 25.95.

La tercera curva de amplificación se deriva de la sonda específica para Coli. Otras sondas específicas no generaron señales detectables. Una vez que se ha identificado el patógeno, se pueden realizar pruebas con antibióticos.

Comience transfiriendo cinco mililitros de caldo de un hemocultivo positivo a un tubo separador de suero. Centrifugar la muestra a 2000 veces G durante 10 minutos después de la centrifugación, desechar el agente supan del tubo. Luego, usando un hisopo de algodón estéril, transfiera las bacterias de la capa de gel del tubo a cloruro de sodio al 0,9% hasta obtener una solución con una turbidez de un estándar de McFarland de 0,5.

Esto corresponde aproximadamente a 1,5 por 10 a las ocho unidades formadoras de colonias por mililitro. A continuación, diluir la suspensión en doble concentración Muller Hinton. Dos caldos para obtener una concentración de aproximadamente cinco veces 10 a las cinco unidades formadoras de colonias por mililitro.

Alícuota 50 microlitros por pocillo de la suspensión en una placa de microtitulación que ya contiene 50 microlitros por pocillo de una selección de antibióticos. Asegúrese de incluir controles de crecimiento positivos para cada muestra, utilizando pozos con agua en lugar de antibióticos. Cubra el plato cuando termine.

Luego incube la placa a 37 grados centígrados durante seis horas para permitir el crecimiento bacteriano. Asegúrese de almacenar una alícuota de la suspensión bacteriana a cuatro grados centígrados como control de crecimiento negativo. Después de las seis horas de incubación, transfiera el contenido de cada pocillo y la muestra de control negativo a tubos estériles separados.

Después de una centrifugación de cinco minutos a 16.000 veces. G, retirar 80 microlitros de sobrenadante y volver a suspender los pellets en 80 microlitros de agua desmineralizada estéril. Diluya las muestras de una a 10 en agua antes de usarlas para PCR en tiempo real de ADN ribosómico durante 16 s.

Prepare la mezcla de PCR utilizando la supermezcla IQ cyber green y los cebadores de ADN ribosómico de 16 s y alícuotas. 20 microlitros por pocillo en una placa de PCR de 96 pocillos. A continuación, añada cinco microlitros de cada muestra a los pocillos y selle la placa.

A continuación, ejecute el PCR para analizar los resultados. En primer lugar, calcule el valor de corte del TC. En general, el TC de corte es igual al TC del control de crecimiento positivo más 0,5 veces el TC del control de crecimiento negativo menos el TC del control de crecimiento.

Sin embargo, para la piperacilina piperacillina con tazobactam y CEF dazadi en bacilos gramnegativos, así como para la amoxicilina, la oxacilina y la trimetoprima con sulfametoxazol en Staphylococcus aureus o de amoxicilina. En el caso de los enterococos SPP, el factor de multiplicación de 0,5 debe reducirse a 0,25. La susceptibilidad o resistencia de las cepas en cada muestra se puede determinar comparando el TC de la muestra con el TC de corte.

Un valor de CT por encima del punto de corte indica susceptibilidad, mientras que un CT por debajo del punto de corte indica resistencia. A continuación se muestra un ejemplo de un gráfico de amplificación de la susceptibilidad a los antibióticos. La cepa de E. coli identificada anteriormente se sometió a pruebas de sensibilidad a varios antibióticos, cada uno representado por una curva separada.

Las muestras con un valor bajo de CT son muestras en las que se ha producido un crecimiento en presencia de un antibiótico que indica resistencia al antibiótico analizado. Por el contrario, un valor alto de CT representa una muestra en la que no se ha producido ningún crecimiento, lo que indica susceptibilidad al antibiótico probado una vez dominado. Esta técnica se puede realizar en nueve horas si se realiza correctamente.