Name: Enriquecimiento de las células NK a partir de sangre humana con el Kit de RosetteSep de Tecnologías de la StemCell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Aprende a aislar células NK de sangre humana mediante selección negativa con el kit RosetteSep de StemCell Technologies. Este protocolo garantiza alta pureza y viabilidad celular para estudios inmunológicos.

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Un protocolo detallado se incluye con cada cóctel aislamiento Rosette septiembre y está disponible en línea en el sitio web StemCell tecnologías 1.

<ol><li>Procedures and instruction manuals. , 
	
 <a target="_blank" href="http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx">http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx</a> Forthcoming.</li>
</ol>

Las células aisladas con esta técnica pueden ser divididos en diferentes poblaciones con otros equipos de separación de células.

PBS suplementado con 2% de FCS y soluciones Histopaque deben ser llevados a temperatura ambiente antes del inicio del procedimiento.

enriquecimiento de las células nk a partir de sangre humana con el kit de rosettesep de tecnologías de la stemcell

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Asesinas naturales (células NK) son linfocitos granulares grandes citotóxicos que pertenecen al sistema inmune innato y desempeñan un papel importante en la lucha contra el cáncer y las infecciones, pero también están implicados en las primeras etapas del embarazo y el rechazo al trasplante. Estas células están presentes en la sangre periférica, de la que se puede aislar. Las células pueden ser aisladas mediante la selección positiva o negativa. Para la selección positiva se utiliza anticuerpos dirigidos a un marcador de superficie presentes sólo en las células de interés, mientras que para la selección negativa que el uso de cócteles de anticuerpos dirigidos a los marcadores de superficie presentes en todas las células, pero las células de interés. Esta última técnica presenta la ventaja de que las células de interés libre de anticuerpos, lo que reduce el riesgo de activación de las células no deseadas o diferenciación. En este video-protocolo que demuestran cómo separar las células NK de la sangre humana por selección negativa, utilizando el kit de RosetteSep de las tecnologías de StemCell. El procedimiento consiste en la obtención de sangre periférica humana (en una revisión institucional aprobado por la Junta de protocolo para proteger a los seres humanos) y la mezcla con un cóctel de anticuerpos que se unen a los marcadores ausente en las células NK, pero presente en todas las demás células mononucleares presentes en periférico la sangre (por ejemplo, los linfocitos T, monocitos ...). Los anticuerpos presentes en el cóctel se conjugan con los anticuerpos dirigidos a la glicoforina A eritrocitos en el. Todas las células no deseadas y los glóbulos rojos por lo tanto, quedará atrapado en los complejos. La mezcla de cóctel de sangre y anticuerpos se diluye, superpuestas en un gradiente de Histopaque, y se centrifuga. Las células NK (&gt; 80% de pureza) se pueden recoger en la interfaz entre el Histopaque y el plasma diluido. Cócteles similares están disponibles para el enriquecimiento de las poblaciones de células, como los linfocitos T humanos.

Las células asesinas naturales son una pequeña población de linfocitos. Aquí se muestra la forma de aislar estas células de la sangre humana por selección negativa, utilizando un kit de StemCell Technologies. Las células obtenidas son viables y sin tocar por los anticuerpos, y por lo tanto, listo para ser utilizado para una serie de procedimientos.

Enriquecimiento de las células NK a partir de sangre humana con el Kit de RosetteSep de Tecnologías de la StemCell

Las células natural killer (NK) son linfocitos citotóxicos granulares grandes que pertenecen al sistema inmunitario innato y desempeñan funciones fundamentales en la lucha contra el cáncer...

Hola, soy Christine Beaton. Soy investigadora asistente en el laboratorio de George Chen, del Departamento de Fisiología y Biofísica de la Universidad de California en Irvine. Hoy les mostraré cómo seleccionar negativamente células asesinas naturales a partir de sangre humana utilizando los kits de cócteles de tecnologías de células madre.La razón por la que utilizamos este kit de Stem Cell Technologies es que nos proporciona una pureza celular muy alta, y la selección negativa nos permite obtener células que no han sido unidas a un anticuerpo. Así, no ocurre nada inesperado con esas células. El funcionamiento del kit Tsep consiste en que se tienen anticuerpos que se unirán a todas las células en la sangre en las que no estamos interesados.En mi caso, las células T, las células B, los monocitos y luego los anticuerpos que se unirán a la glucoforina A en los glóbulos rojos; lo que hicieron fue vincular un anticuerpo contra un glóbulo blanco a un anticuerpo contra un glóbulo rojo. Entonces, lo que ocurrirá es que se formará un complejo con un glóbulo blanco no deseado y múltiples glóbulos rojos, y dado que los glóbulos rojos tienen una mayor densidad que los glóbulos blancos, cuando coloques tu mezcla de sangre y anticuerpos sobre un gradiente y la centrifuges, los glóbulos rojos se hundirán hasta el fondo del tubo y arrastrarán consigo todos los glóbulos blancos que no deseas. Por lo tanto, en la parte superior del gradiente, lo que recogerás serán tus células asesinas naturales puras o casi puras, que no se han unido a ningún anticuerpo.Así que comencemos con el aislamiento de células NK a partir de un tubo de sangre humana. Esta es sangre recién extraída en un tubo con heparina sódica. Voy a utilizar el cóctel de enriquecimiento de células NK humanas Roset ep como gradiente.Más adelante en mi experimento voy a utilizar el histo pack 10 77, que tiene una densidad de 1,077, y también he preparado un frasco de PBS suplementado con 2% de suero de ternero fetal. Me aseguro de que estos componentes alcancen la temperatura ambiente antes de usarlos, ya que los almaceno en el refrigerador. Así que voy a tomar todo el tubo de sangre y colocarlo en un tubo cónico de 50 mL.Entonces, dado que es un recipiente al vacío, hay vacío en su interior; para abrirlo sin salpicaduras, localizo la pequeña muesca en la tapa del capuchón y la levanto cuidadosamente para permitir que entre aire en mi tubo. Y cuando, una vez que el vacío se ha roto dentro del tubo, puedo retirar con mayor facilidad la tapa; luego, usando una pipeta de 10 ml, voy a pipetear todo el contenido de sangre del tubo. Por lo tanto, espero que deba haber aproximadamente 10 ml de sangre.Aquí tengo 9,5 ml de sangre y voy a colocar estos 9,5 ml completos en este tubo Falcon de 50 ml. Luego, la pipeta con la sangre se coloca directamente en la bolsa de riesgo biológico; en el tubo, yo siempre pongo un poco de lejía, lo cierro y luego lo coloco en la bolsa de riesgo biológico. Así es como se ve la sangre antes de añadir el cóctel de anticuerpos.Ahora voy a añadir el cóctel de anticuerpos a la sangre, ya que tenía aproximadamente 9,5 ml de sangre y necesito añadir 50 microlitros de cóctel por mililitro de sangre; por lo tanto, voy a añadir 450 microlitros del cóctel a mi sangre. Luego voy a mezclar suavemente y casi de inmediato verán ocurrir el fenómeno. Como pueden ver ahora, ya se observa el fenómeno.Entonces, la fuga cruzada entre los glóbulos blancos no deseados y los glóbulos rojos está ocurriendo ahora mismo. Voy a programar un temporizador de 20 minutos y dejar que el tubo permanezca así en la cabina durante 20 minutos. La sangre ha incubado durante 20 minutos con la mezcla de sustrato de roseta.Así que voy a diluirlo uno a uno con PBS más suero de feto bovino. Y esta mezcla la voy a superponer sobre dos mililitros de Histopaque 1077. Después de eso, voy a centrifugar mi muestra en la centrífuga durante 20 minutos.Tengo aproximadamente 10 ml de sangre más el cóctel de anticuerpos. Voy a añadir 10 ml de PBS que contiene 2% de suero de feto bovino. Eso es una dilución uno a uno.Tendré que mezclar suavemente porque, como se puede ver, cuando agrego el PBS a la sangre, no se mezcla de inmediato. Por eso solo mezclo suavemente. Ahora tengo una mezcla uno a uno de PBS con sangre, y esto es lo que voy a agregar a mis 15 mililitros de histo pack.Y voy a superponerlo cuidadosamente para evitar mezclar la sangre con el histopaquete. Para ello, en lugar de usar una pipeta de 25 M que tomaría toda la sangre, voy a utilizar una pipeta de 10 mil y proceder en varios pasos. Para superponer con facilidad, sostengo mi tubo de histopaquete casi en posición horizontal.Voy a colocar una pequeña cantidad de sangre en el tubo y llevarla hacia abajo hasta el hisopado. Luego, muy lentamente, voy a superponer la sangre sobre el hisopado. Una vez que tenga una capa adecuada de sangre, podré comenzar a transferir más rápidamente y, poco a poco, devolver mi tubo a una posición vertical.Ahora he superpuesto mis 20 ml completos de la mezcla de sangre con el cóctel de anticuerpos y PBS sobre dos porciones de 15 ml de histo-pack. Y si pueden observar en la unión del tubo, empezarán a ver lentamente pequeños agregados de glóbulos rojos hundiéndose lentamente en el gradiente, y vamos a centrifugar RET simplemente para acelerar el proceso. Así, en 20 minutos tendremos todos los glóbulos rojos en el fondo del tubo.Y existe un punto muy importante al realizar una gt: se debe desactivar el freno, ya que detenerse demasiado rápido podría alterar sus ingredientes. Por lo tanto, siempre desactivamos el freno y luego voy a centrifugar mi muestra RI durante 20 minutos y dejar que haga su trabajo. El ingrediente ya ha sido centrifugado durante 20 minutos.Entonces tenemos las diferentes capas de células. Comenzamos en la parte inferior del tubo aquí. Aquí están todas las células rojas de la sangre y las células en las que no estamos interesados.Encima hay una capa clara de gradiente y sobre esta, una capa amarillenta de plasma. Y las células que nos interesan hoy, las células NK, son este delgado estrato blanco de células entre las capas de gradiente y plasma.Por supuesto, esta capa es muy, muy delgada porque las células NK solo representan una minoría de las células sanguíneas. Ahora voy a retirar la capa de células NK utilizando una pipeta Pasteur estéril. Y esta capa la voy a colocar en un nuevo tubo cónico de 50 ml vacío.Así que voy a la capa y la extraigo. Por supuesto, hay muy pocas células. Cuando se tiene un gran número de células, se puede obtener la capa muy limpiamente, pero cuando hay tan pocas células, no es así.Y según lo recomienda el fabricante, sugieren que se retire algo del gradiente junto con las células para evitar perderlas. Por eso lo extraigo con la pipeta mientras siga viendo células allí. Una vez que haya retirado todas las células, debería observarse un contraste nítido entre el reactivo clarificado y el plasma de color amarillento.Así que creo que ya tengo todas mis células separadas. Si observa el gradiente, no verá nada blanco y borroso en la interfase entre el histo-pack y el plasma. Ahora he retirado todas las células NK que pude ver del gradiente, las he colocado en un nuevo tubo Falcon de 50 ml y he añadido inmediatamente algo de PBS suplementado con 2% de suero de feto bovino al tubo.Así que lo llené hasta 50 ml y voy a centrifugar las células para obtener el sedimento. Ese será el primer lavado. Y voy a repetir el procedimiento una segunda vez para lavar las células un total de dos veces.Y después de eso, las células estarán listas para cualquier procedimiento que desee realizar, ya sea colocarlas en cultivo o usarlas para la tinción por citometría de flujo. Y debería obtener al menos un 80% de pureza de células NK, quizás más. He obtenido hasta un 98% de pureza con este procedimiento.Hoy les he mostrado una técnica muy rápida y confiable para aislar células asesinas naturales a partir de sangre humana, utilizando los kits TS de StemCell Technologies. Y por supuesto, si desean aislar otros tipos celulares de humano, rata o ratón, pueden usar cualquiera de los diversos kits de aislamiento de células T. Existen kits para células T, células B e incluso subtipos de células T, por ejemplo.

enrichment-nk-cells-from-human-blood-with-rosettesep-kit-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí se describe un método para expandir de manera eficiente y purificar una gran cantidad de células NK humanos y evaluar su función.

Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK

Este video muestra el método para analizar el metabolismo energético en células NK humanas activadas utilizando un analizador de flujo extracelular. Diferentes inhibidores de los complejos de la cadena de transporte de electrones influyen en la síntesis de ATP, que se mide a través de la tasa de consumo de oxígeno u OCR, lo que proporciona información sobre el metabolismo celular y la bioenergética.

Monitorización en tiempo real del metabolismo energético en células NK humanas mediante un analizador de flujo extracelular

Este protocolo describe el desarrollo, la expansión, y en la formación de imágenes in vivo de células NK derivadas de hESCs y iPSCs.

Desarrollo, la expansión y<em&gt; En vivo</em&gt; Monitoreo de las células NK humanas a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) y y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

Un método sencillo y fiable se describe aquí para analizar un conjunto de funciones de las células NK, tales como la desgranulación, de citoquinas y la producción de quimioquinas dentro de los diferentes subconjuntos de células NK.

Ensayo de citometría de flujo de base para la supervisión de funciones de las células NK

El objetivo de este estudio fue elaborar tecnologías que permiten la transducción génica exitosa en natural killer (NK) las células primarias. La transducción lentivirales dextrano-mediada de humanos o resultados primarios de las células NK del ratón en una mayor eficiencia de expresión génica. Este método de transducción génica mejorará enormemente la manipulación genética de la célula NK.

Dextrano mejora la eficiencia de transducción lentivirales de las células NK primaria murinas y humanas

Aquí se muestra un método basado en la citometría de flujo para determinar cuantitativamente la actividad citotóxica de las células de asesino naturales humanas.

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

Aquí, presentamos un protocolo para producir en masa las células murinas de silenciamiento génico NK usando un sistema de diferenciación libre de alimentador para estudios mecanísticos in vitro e in vivo.

Un novedoso sistema de alimentador-libre para la producción masiva de células de asesino naturales murinos In Vitro

Aquí se describe un protocolo para estudiar los eventos impulsados por FcγRIIIa por anticuerpos terapéuticos en células asesinas naturales humanas. Esta plataforma de estimulación artificial permite el interrogatorio de funciones efectoras aguas abajo, como la degranulación, la producción de quimiocinas / citoquinas y las vías de señalización mediadas por las porciones FcγRIIIa y Fc de anticuerpos involucrados en la unión.

Evaluación de los eventos de células asesinas naturales humanas impulsados por la participación de FcγRIIIa en presencia de anticuerpos terapéuticos

El presente protocolo muestra cómo diferenciar las células CD3−/CD45+CD56+ con citotoxicidad leve de las células madre humanas de potencial expandido (hEPSC) en condiciones de cultivo 3D y 2D. Esto permite la validación fenotípica rutinaria sin la destrucción del microambiente complejo.

Generación de células asesinas naturales a partir de células madre humanas de potencial expandido

Aquí, presentamos un método para diferenciar y expandir las células asesinas naturales que expresan el receptor de antígeno quimérico (CAR) derivado de iPSC humano con una matanza mejorada contra varias neoplasias malignas. Este protocolo demuestra la diferenciación y expansión de células CAR-NK derivadas de iPSC optimizadas para asesinos naturales (NK) y la medición de la actividad antitumoral frente a varias líneas celulares tumorales.

Avances en células asesinas naturales que expresan receptores de antígenos quiméricos derivados de células madre pluripotentes humanas

Aprende a aislar células NK de sangre humana mediante selección negativa con el kit RosetteSep de StemCell Technologies. Este protocolo garantiza alta pureza y viabilidad celular para estudios inmunológicos.

Enriquecimiento de las células NK a partir de sangre humana con el Kit de RosetteSep de Tecnologías de la StemCell

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