Utilización del modelo de EpiAirway para la caracterización de largo plazo Interacciones Huésped-Patógeno

El objetivo general del siguiente experimento es realizar un cocultivo a largo plazo de Hemophilus influenza no tipificable o NTHI con tejidos epiteliales respiratorios humanos primarios utilizando el modelo epi de las vías respiratorias. Esto se logra inoculando la superficie apical con NTHI para permitir que las bacterias se adhieran y entren en los tejidos como un segundo paso. Los insertos se lavan cada 24 horas con DPBS precalentado para imitar el flujo normal de moco y eliminar los productos de desecho de mucina y cualquier residuo celular.

A continuación, se recolectan los tejidos en el momento deseado y se determina la supervivencia de la célula total asociada o NTHI internalizada. Finalmente, con este método, se pueden evaluar las características específicas de la cepa de supervivencia de NTHI dentro de los tejidos a lo largo del tiempo en función de los recuentos de bacterias viables. Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre las infecciones a largo plazo con la Hemophilus Influenza no tipificable.

También se puede utilizar en el estudio de otros patógenos humanos, como Moraxella Alis, lo que demuestra que este procedimiento será realizado por el Dr. Doin, becario postdoctoral en mi laboratorio. Retire la placa de transporte de su embalaje y prepárese para comenzar el experimento. Rocíe la placa de transporte con etanol al 70% y coloque la placa en el gabinete de bioseguridad.

Alícuota de un mililitro de cuatro grados centígrados, epi vías respiratorias, medios de mantenimiento en cada pocillo de una placa de seis pocillos. Luego, después de quitar la cinta, abra la placa y retire la gasa que cubre los insertos de las vías respiratorias epi. Con un movimiento de torsión, use pinzas para liberar un inserto de los aros.

Coloque el inserto en uno de los pocillos de la placa de seis pocillos si es necesario. Utilice un bastoncillo de algodón estéril para retirar con cuidado los aros del inserto, evitando tocar la membrana. Confirme que no haya burbujas de aire atrapadas debajo de los insertos.

Y luego coloque la placa de seis pocillos en una incubadora. Lave los insertos diariamente de la siguiente manera, precaliente el DPBS con calcio y magnesio y llene una punta con el DPBS. A continuación, con unas pinzas estériles, recoja un inserto y pipetee suavemente 200 microlitros de DPBS precalentado sobre el tejido.

A continuación, balancee el inserto para distribuir uniformemente el DPBS sin tocar el tejido. A continuación, incline el inserto en ángulo y coloque una punta de pipeta P 1000 contra el anillo de plástico que sujeta la membrana en la parte inferior del inserto. A continuación, aspire cuidadosamente la solución tampón y coloque la solución en un tubo criogénico para su posterior estudio.

Finalmente, aspire el medio de mantenimiento basal y reemplácelo con un mililitro de medio fresco. Precalienta más DPBS con calcio y magnesio. Agregue tres mililitros de DPBS precalentado a un tubo de 15 mililitros y luego vuelva a suspender colonias individuales de influenza o NTHI no tipificables cultivadas durante la noche en agar chocolate en el tubo.

Ahora agite el tubo vigorosamente durante al menos 10 segundos y luego mida la densidad óptica. Continúe agregando colonias individuales de NTHI hasta que la concentración bacteriana alcance un OD de 600 nanómetros de aproximadamente 0.7. A continuación, lave cada inserto de las vías respiratorias EPI con DPBS precalentado como antes y, a continuación, añada 28 microlitros de la suspensión bacteriana a la superficie apical de cada inserto.

Evitar la inoculación de los medios basales de mantenimiento. A continuación, regrese la placa a la incubadora para cuantificar el NTHI, primero precalentar y luego secar la superficie las placas de agar chocolate. A continuación, diluya en serie el inóculo NTHI utilizando PBS estéril con gelatina al 0,1% o PBSG.

Deje caer 10 alícuotas de microlitros del inóculo en las placas y luego incube las placas durante la noche a 37 grados Celsius en dióxido de carbono al 5%. Al día siguiente, determine las UFC por mililitro contando la dilución que tiene de 15 a 30 colonias distintas en cada gota, y calculando su inóculo viable real de NTHI para cosechar el total de bacterias asociadas a las células. Enjuagar tres veces la superficie apical de las vías respiratorias epi con 200 microlitros de DPBS sin calcio ni magnesio.

A continuación, incline el inserto y enjuague los medios de mantenimiento restantes de la membrana basal. Coloque el inserto lavado en una placa nueva de seis pocillos y agregue 250 microlitros de solución estéril de saponina al 1% en la superficie apical de cada tejido. Regrese la placa a la incubadora durante 10 minutos mientras la placa se incuba.

Configure los tubos para la dilución en serie, llenando cada tubo de dilución con 900 microlitros de PBSG. A continuación, frote el tejido de la membrana con una punta de pipeta P 1000 con un movimiento hacia adelante y hacia atrás, seguido de un movimiento circular para eliminar el tejido de los bordes del inserto. A continuación, con una punta de pipeta P 1000 estéril de gran diámetro, coloque la suspensión en un tubo einor vacío de 1,5 mililitros.

Ahora agregue 250 microlitros de DPBS en la superficie apical del inserto y, a continuación, examine el inserto utilizando un microscopio de contraste de fase invertida para determinar si queda algún tejido por recolectar. Agregue la suspensión al tubo einor y cubra con 500 microlitros de DPBS vigorosamente. Vórtice la suspensión celular durante un minuto.

A continuación, utilizando una jeringa estéril de un mililitro provista de una aguja de calibre 26. Aspire la suspensión en la jeringa a través de la aguja. Pase lentamente la suspensión a través de la aguja tres veces, teniendo cuidado de no crear burbujas.

A continuación, agita la suspensión vigorosamente durante un minuto más. A continuación, utilice una punta de pipeta de gran diámetro para transferir 100 microlitros de la suspensión al primer tubo de dilución. Agite el tubo vigorosamente durante cinco segundos y luego haga una placa de dilución en serie de una a 10 placas de agar chocolate.

Luego, incube las placas durante la noche a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono para obtener recuentos bacterianos viables para recolectar bacterias internalizadas. Lave cada inserto solo tres veces con 200 microlitros de DPBS. Reemplace el medio de mantenimiento basal con un medio que contenga 100 microgramos por mililitro de sulfato de gentamicina y luego agregue 300 microlitros del medio de mantenimiento que contiene gentamicina en la superficie apical.

Regrese los insertos a la incubadora durante una hora mientras se incuban, precaliente algunos DPBS. A continuación, retire el medio de mantenimiento que contiene gentamicina de la superficie apical. A continuación, lave ampliamente la superficie apical y la membrana basal de los insertos con el DPBS precalentado.

Finalmente, repita el procedimiento de lavado y recolección que se acaba de demostrar antes de realizar diluciones en serie y siembra de las bacterias internalizadas en esta figura. Comparación de imágenes de microscopio electrónico de barrido de tejidos de las vías respiratorias epi no infectados a la izquierda con tejidos de las vías respiratorias epi infectados con NTHI de cinco días a la derecha. Se puede observar que el cocultivo a largo plazo con NTHI no produce daños significativos en los tejidos apicales, lo que subraya la utilidad del modelo epi de la vía aérea.

Aquí se muestra un gráfico que muestra el número de NTHI internalizados a lo largo del tiempo durante un cocultivo epi de la vía aérea. La cepa R 2 8 6 6 se inoculó aproximadamente una vez 10 de la séptima UFC por inserto. A continuación, se recolectaron las bacterias internalizadas y se enumeraron en cada punto de tiempo indicado.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar el cocultivo a largo plazo de NTHI con los tejidos respiratorios de la hormona primaria utilizando el modelo A PRE.