Un método para etiquetar los Vasos sanguíneos en embriones de ratones

El objetivo general del siguiente experimento es determinar los efectos de mutaciones genéticas específicas en el desarrollo y la estructura vascular. Esto se logra mediante la disección del embrión y los tejidos extraembrionarios juntos, a fin de obtener una muestra adecuada para la inyección. A continuación, se inyecta una vena facial con un colorante fluorescente para marcar la vasculatura intacta.

Luego, el embrión se prepara para el análisis. Finalmente, se realizan montajes completos o secciones de la vasculatura marcada para obtener imágenes que muestren la estructura tridimensional de la vasculatura normal mediante microscopía de inmunofluorescencia de montajes completos o secciones de tejido. Tuve por primera vez la idea de este método cuando me interesaba determinar el punto temporal del desarrollo en el que la vasculatura periférica se conecta con el timo mediante angiogénesis.

Para comenzar, prepare FXI dextrano o GS L uno I selectina B cuatro en PBS en un tubo einor de 1,5 mililitros, agregue 100 microlitros de la solución stock de 1,25 milimolar de azul rápido en PBS al dextrano FTSE, o 180 microlitros al GS L uno I selectina B cuatro para que las soluciones sean visiblemente azules. A continuación, caliente el tubo a 37 grados Celsius.

Disecar embriones de E 14,5 a E 18,5 y las bolsas de vitelo juntas, dejando el pedículo umbilical intacto. Transferir los embriones a una nueva placa de Petri e inmergirlos en PBS a temperatura ambiente. A continuación, colocar un embrión para obtener una vista sagital de la cara.

Luego, con pinzas de disección microscópicas, sostenga suavemente el embrión por la cabeza. Utilizando una aguja de calibre 30, inyecte 50 microlitros de dextrano FXI o GS L uno I selectina B cuatro en la vena facial, orientando la aguja hacia la parte posterior de la cabeza. Cuando el colorante sea visible en la vena umbilical, retire la aguja y separe el embrión del lan.

Almacenar el embrión. Deje que el embrión permanezca en PBS a temperatura ambiente durante dos o tres minutos para que el colorante circule por todo el embrión. Después de permitir que el colorante circule por todo el embrión, retire muestras de piel de las regiones de las extremidades, la espalda y el estómago.

Lave las muestras de piel con PBS frío y fíjelas en PBS con paraformaldehído al 4% durante dos horas. Luego, lávelas tres veces durante 10 minutos cada vez en viales transparentes de cuatro mililitros con dos mililitros de PBS frío. Coloque las muestras de piel sobre portaobjetos y añada 100 microlitros de medio de montaje y una cubeta a cada portaobjeto.

Deje secar las laminillas en la oscuridad antes de realizar el aclaramiento para imagenología en BABB y la posterior imagenología confocal, que se puede llevar a cabo para obtener imágenes de mayor resolución de la vasculatura cutánea. Para preparar los tejidos para corte por criosección, congele rápidamente los embriones completos en nitrógeno líquido para criosección. Extienda OCT sobre un bloque de sección y monte el embrión.

Corte el tejido congelado en secciones de 10 micrones de grosor y coléctelas sobre portaobjetos. Fije las secciones en acetona durante cinco a 10 minutos, luego lávelas tres veces en bloque de TBS frío con 10% de suero de asno en TBS en una cámara de humedad. A temperatura ambiente, agregue 100 microlitros de anticuerpo primario a cada sección.

En este ejemplo, utilizamos ratón anti-CD 31 humano para marcar el endotelio y cabra anti-P-D-G-F-R beta humano para marcar las células perivasculares, con el fin de asegurar que el anticuerpo se distribuya uniformemente a través de la sección. Cubra los portaobjetos con tiras individuales de parafilm recortadas. Incube los portaobjetos durante una hora hasta toda la noche en una cámara húmeda a cuatro grados Celsius.

A continuación, lave las secciones tres veces con TBS frío. Incube con 100 microlitros de los anticuerpos secundarios apropiados durante un mínimo de 30 minutos. Finalmente, lave tres veces con TBS frío. Añada 100 microlitros de medio de montaje y un cubreobjetos a cada portaobjetos.

Deje secar las laminillas en la oscuridad. Para el corte en vibrátomo, diseccione los lóbulos del timo de los embriones y enjuáguelos en PBS frío. Fije el tejido en PBS con paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante dos horas.

Después de lavar las muestras en PBS con Triton X, llene un pequeño cartucho de plástico con agarosa al 4 % de fusión baja. Sumerja las muestras en la agarosa en PBS, asegurándose de que el tejido esté en contacto con el fondo del cartucho. Deje que la agarosa se solidifique sobre hielo.

Luego, use una cuchilla de afeitar para cortar el exceso de agarosa. Aplique pegamento al bloque de VIBRAM y adhiera la muestra al bloque. Vierta PBS frío en el baño de agua Vibram hasta que la muestra y la cuchilla queden sumergidas.

Establezca la velocidad y la amplitud. La amplitud debe reducirse. Si las secciones se desintegran debido a una agitación excesiva, corte 50 secciones de tejido.

Luego, utilizando pinzas, transfiera las secciones a PBS frío en una placa microtituladora de 24 pocillos. Bloquee las secciones en 500 microlitros de suero de asno al 10 % en PBS con Triton X durante 30 minutos. Después de agregar anticuerpos primarios como anti-CD31 y anti-P-D-G-F-R beta, incube de ocho horas a toda la noche en una placa microtituladora cubierta a cuatro grados Celsius. A continuación, lave tres veces en PBS con Triton X durante un total de ocho horas a cuatro grados Celsius.

Después de bloquear nuevamente las secciones e incubarlas en anticuerpos secundarios, lave las muestras tres veces en PBS Triton X durante un total de ocho horas a cuatro grados Celsius. Luego, vuelva a fijar las muestras en PBS con paraformaldehído al 4 % durante 30 minutos en hielo y lávelas otras tres veces en PBS Triton X durante 30 minutos en hielo. Deshidrate las muestras mediante una serie graduada de metanol en PBS Triton X durante 10 minutos en cada paso.

Luego, reemplace el metanol al 100 % por metanol fresco e incube durante una hora a temperatura ambiente. Coloque la muestra en un portaobjetos de vidrio con cavidad y cubra la muestra con una solución uno a uno de BABB y metanol. Incube las muestras durante 10 a 15 minutos.

A continuación, sustituya la solución por BABB al 100% e incube a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos o hasta que se vuelva transparente. Añada un cubreobjetos y selle con dos o tres capas de esmalte de uñas. Deje que el esmalte de uñas se endurezca en la oscuridad y a temperatura ambiente.

La muestra puede almacenarse a cuatro grados Celsius, pero debe tomar las imágenes entre 12 y 24 horas. Imagen secciones congeladas de 10 micrones con un microscopio confocal utilizando el objetivo plan A per cromado 20 veces 0,8 con líneas láser de 6 33 4 88 y 5 43 nanómetros; adquiera secciones Z confocales de un micrón de secciones incluidas en aros de 50 micrones utilizando el objetivo plan A per cromado 10 x 0,4 con líneas láser de 4 88 5 43 y 6 33 nanómetros; reconstruya secciones Z seriadas utilizando el software de análisis de imágenes Zeiss AIA vision 4.6 o software similar. La marcación eficiente de la vasculatura embrionaria es fundamental para evaluar defectos en los vasos sanguíneos de ratones embrionarios. Estas figuras muestran la marcación específica de los vasos sanguíneos del timo en E 16,5 y la marcación simultánea de GS L uno y selectina.

B cuatro embriones inyectados con CD31, así como tinción de los ventrículos derecho e izquierdo. Se utilizó el protocolo GSL uno selectina B cuatro para secciones criostáticas en estos experimentos. Se muestra aquí la marcación en montaje completo de la red de vasos sanguíneos de la piel en ratones E16.5 siguiendo este procedimiento.

Otros métodos, como la marcación simultánea de las células estromales y las células sanguíneas con el sistema vascular, pueden utilizarse para responder preguntas adicionales, como: ¿Cómo interactúan las células sanguíneas y las células estromales con el sistema vascular en el embrión de ratón bajo condiciones normales y patológicas?