Name: Un método para etiquetar los Vasos sanguíneos en embriones de ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprenda a etiquetar vasos sanguíneos en embriones de ratón mediante inyección de tinte fluorescente en la vena facial. Este método permite visualizar la estructura vascular tridimensional para estudiar el desarrollo embrionario.

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Este trabajo fue apoyado por los números de concesión y R01AI055001 R01AI082127 del NIAID para MRN y Tesis SREB Beca de JLB.

1. Fluoresceína dextrano y GSL I-isolectina B 4 inyecciones vena facial para etiquetar vasculatura embrionaria <ol><li> Prepare FITC-dextrano (50ug/mL) en tampón fosfato salino (PBS) o GSL 1 - isolectina B 4 (20ug/200uL) en PBS en un tubo Eppendorf 1,5 ml y calentar a 37 º C. Añadir 100uL de acciones de 1,25 Fast Green / PBS a la solución de FITC-dextrano (volumen total de 1 ml) y 180uL de acciones de 1,25 Fast Green / PBS a la GSL 1 - isolectina B 4 (200uL volumen total), por lo que la solución es visiblemente azul. </li><li> Diseccionar E14.5 E18.5-embriones y el saco vitelino juntos, dejando el tallo alantoideo (arteria y vena umbilical) se mantienen intactas. </li><li> Transferencia de embriones a un nuevo plato de petri (60 x 15 mm) y sumérgelas en PBS a temperatura ambiente. </li><li> La posición del embrión para proporcionar una vista sagital de la cabeza / cara. El uso de micro pinza de disección para agarrar suavemente el embrión en la cabeza. </li><li> Utilizando una aguja 30G, se inyectan 50 ul FITC-dextrano (50ug/mL) o GSL 1 - isolectina B 4 (20ug en 200uL PBS) en la vena facial, apuntando la aguja hacia la parte posterior de la cabeza. </li><li> Cuando el medio de contraste es visible en la vena umbilical, retire la aguja y por separado el embrión del tallo alantoideo (arteria umbilical y la vena). </li><li> Después de las inyecciones, permiten embrión a permanecer en PBS a temperatura ambiente durante 2-3 minutos para que el colorante circula por todo el embrión. </li></ol> 2. Todo el montaje análisis de la vascularización cutánea <ol><li> Después de permitir que el medio de contraste a circular por todo el embrión, extraer muestras de la piel de las regiones de las extremidades, espalda y estómago, etc 8,9. </li><li> Lavar la piel de la muestra en PBS frío, y fijar en el 4% PFA / PBS durante 2 horas 8,9. Lavar 3 veces durante 10 minutos cada uno en un vial de 4 ml claro con 2 ml de PBS frío. </li><li> Coloque la muestra de piel en un microscopio de diapositivas y añadir 100 ml de montaje de los medios de comunicación en cada diapositiva y una cubierta de vidrio. </li><li> Permitir que se sequen en un área de almacenamiento en la oscuridad. </li><li> Continúe con el Paso sección 'Adquisición de imágenes "2. </li></ol> 3. Multi-color etiquetado de timo y los vasos sanguíneos del corazón y las células perivasculares de cryosections (Continúa de la Sección 1, Paso 7) <ol><li> Embrión de todo 'Flash congelar en nitrógeno líquido. Los embriones se pueden y se almacenan a -80 ° C hasta su análisis. </li><li> Por otra parte, diseccionar el timo, el enjuague en PBS 4 ° C, y fijar en 2 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) / PBS durante 2 horas. Lavar 3 veces durante 10 minutos en PBS frío, lugar thymi en octubre, y congelar y almacenar hasta su uso a -80 ° C. </li><li> Para muestras criostáticas, se extendió en octubre 'block' y una sección de montaje en el embrión o los órganos diseccionados / tejidos para el corte. </li><li> Cortar el tejido congelado en 10 micras de espesor y se acumulan en las diapositivas. </li><li> Fix secciones en acetona durante 5-10 minutos. Lavar 3 veces en TBS frío. </li><li> Bloque en el burro 10% de suero / TBS en una cámara húmeda a temperatura ambiente. </li><li> Incubar las secciones de una hora durante la noche-con 100 l de anticuerpos primarios en una cámara húmeda a 4 ° C: en este ejemplo, el uso de rata anti-CD31 de ratón (1:100) al endotelio etiqueta, y de cabra anti-ratón PDGFR-β (1:100) para marcar a las células perivasculares. Es útil para cubrir las diapositivas individualmente cortar tiras Parafilm para asegurarse de que el anticuerpo se extienda uniformemente por toda la sección. </li><li> Después de la incubación con el anticuerpo primario, lave las secciones 3 veces en TBS frío. Incubar con 100 l de anticuerpos secundarios apropiados durante 30 minutos como mínimo. </li><li> Lavar 3 veces en TBS frío. Añadir 100 ml de montaje de los medios de comunicación en cada diapositiva y una cubierta de vidrio. </li><li> Permitir que se sequen en un área de almacenamiento en la oscuridad. </li><li> Pase a la sección 'Adquisición de imágenes ". </li></ol> 4. Multi-color de etiquetado de la vasculatura del timo y células perivasculares de las secciones vibratome (Continúa de la Sección 1, Paso 7) <ol><li> Diseccionar los lóbulos del timo del embrión y enjuague con PBS frío. </li><li> Fix timo en el 4% PFA / PBS a temperatura ambiente durante 2 horas. </li><li> Se lavan con PBS-Triton X (0,15%) 3 veces, 10 minutos y thymi lugar en un cartucho de plástico y se sumergen en el 4% de baja fusión de agarosa / PBS (~ 4 ° C). El timo debe estar en contacto con la parte inferior del cartucho. </li><li> Permitir agarosa para solidificar en el hielo (3-5 minutos). Use una hoja de afeitar para cortar el exceso de agarosa. Añadir cola en el bloque de vibratome y adherirse al bloque de la muestra. </li><li> Añadir PBS frío a baño de agua vibratome hasta que la muestra y la hoja están inmersos. </li><li> Ajustar la velocidad y la amplitud (de gran amplitud y baja velocidad moderada es ideal para suaves secciones del timo). La amplitud debe ser reducida si las secciones romper debido a la agitación en exceso. </li><li> Corte secciones de 50 um. </li><li> Usando un pincel, recoger las secciones en una microplaca de 24 pocillos en PBS frío. </li><li> Secciones de bloque en 500 l de suero de burro del 10% en PBS-Triton X (0,15%) durante 30 minutos. </li><li> Secciones se incuban durante 8 horas o toda la noche con el anticuerpo primario, tales como anti-CD31 y anti-PDGFR β-, En una cubierta de 24 pocillos de microplacas. </li><li> Lavar 3 veces con PBS-Triton X (0,15%) sobre un total de 8 horas a 4 ° C. </li><li> Secciones de bloque en el suero de burro del 10% en PBS-Triton X (0,15%) durante 30 minutos. </li><li> Incubar las secciones de 8 horas a la noche a 4 ° C con anticuerpos secundarios apropiados. </li><li> Lavar 3 veces con PBS-Triton X (0,15%) sobre un total de 8 horas a 4 ° C. </li><li> Fijar de nuevo las muestras en el 4% PFA / PBS durante 30 minutos en hielo. </li><li> Lavar 3 veces con PBS-Triton X (0,15%) más de 30 minutos en hielo. </li><li> Deshidratar las muestras a través de una gradual MeOH / PBS Triton X-series: 25% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH, MeOH y 100% a los 10 minutos para cada paso. Reemplazar el 100% de MeOH con MeOH fresco después de 10 minutos y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> En un recipiente de vidrio, mezclar Babb (alcohol bencílico: benzoato de bencilo) en una proporción de 1:2. Combine Babb con MeOH para una concentración final del 50% Babb y el 50% MeOH. Incubar la muestra en Babb: MeOH durante 10-15 minutos. </li><li> Transferir la muestra a un recipiente de vidrio con 100% Babb y se incuba durante 10-15 minutos o hasta que sean borrados, a temperatura ambiente. </li><li> Llena de diapositivas depresión (0,7 mm de profundidad) con Babb fresca 100% y de transferencia de muestras a un lado. Añadir cubierta de vidrio (No. 1.5) y el sello con 2-3 capas de esmalte de uñas. Permita que el esmalte de uñas para endurecer en la oscuridad a temperatura ambiente, luego almacenar la muestra a 4 ° C. Nota: Las diapositivas deben estar completamente cerrados antes de la adquisición de la imagen confocal. Las imágenes deben ser adquiridas en 12-24 horas, como los tintes fluorescentes pueden desaparecer en Babb. </li><li> Pase a la sección 'Adquisición de imágenes ". </li></ol> 5. De adquisición de imágenes <ol><li> Imagen 10 micras secciones congeladas con un microscopio confocal con el Plan-Apochromat 20X/0.8 objetivo (512 x 512 píxeles) con 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectina B 4), 543 - y 633-nm líneas láser. </li><li> Adquirir confocal z-secciones de la piel y montaje de todo 50 micras de agarosa embebido en secciones con el Plan-Apochromat 10X/0.4 objetivo (512 x 512 píxeles) con 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectina B 4), 543 -, y 633-nm líneas láser. De serie Z-secciones deben ser recogidos de forma secuencial en un micrones para cada canal correspondiente. </li><li> Reconstruir serie Z-secciones usando Zeiss Axiovision 4,6 u otro software de análisis de imagen. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Etiquetado de la eficiencia de la vasculatura embrionarias es crucial para la evaluación de los defectos de los vasos sanguíneos en embriones de ratones. La figura 1 muestra un etiquetado específico de los vasos sanguíneos del timo E16.5 (1A-B) y el etiquetado de cooperación con CD31 (1B), además de la tinción de los ventrículos derecho e izquierdo (1E-F), respectivamente. El GSL I-isolectina B 4 protocolo para cryosections como se describe en las secciones 1, 3 y 5 se utilizó en estos experimentos. Todo el montaje de etiquetado de la red de vasos sanguíneos en la piel E16.5 ratones, utilizando los protocolos descritos en las secciones 1, 2 y 5 se muestra en la Figura 1C-D. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3267/3267fig1.jpg"> Figura 1 Leyenda. FITC GSL I - isolectina B 4 inyecciones en la vena facial E16.5 embriones de ratón. criosección a. de timo embrionario después de la inyección. b. Fusión de CD31 co-etiquetado con isolectina B 4. c. y d. Todo el montaje de la inyección de la piel embrionaria vasculatura siguiente. e. y f. criosección de corazón embrionarias e. (derecha ventrículo) f. (ventrículo izquierdo) después de la inyección.

<ol><li>Cuddihy, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-mediated+cross-talk+within+the+neonatal+murine+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus.</a> Blood. 113, 2723-2731 (2009).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+of+VEGF-A+in+thymus+epithelium+disrupts+thymus+blood+vessel+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+origin+of+perivascular+mesenchyme+in+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).</li>
<li>Foster, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neural+crest-derived+cells+in+the+embryonic+and+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+between+CCR7-+and+CCR9-mediated+chemokine+signals+in+prevascular+fetal+thymus+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization.</a> Blood. 108, 2531-2539 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+critical+for+maintenance+of+the+adult+coronary+vasculature+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice.</a> J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Todo el montaje y PECAM-1 (CD31) en las secciones de tinción son los métodos convencionales para el etiquetado de la vasculatura en embriones de ratones. Estos métodos requieren el uso de la inmunofluorescencia directa y / o indirecta, y los detergentes para permeabilizar los tejidos del ratón. Este resulta ser un proceso más oportuna. En este caso, hemos empleado FITC-dextrano o isolectina B 4 inyecciones vena facial para etiquetar directamente la vasculatura embrionaria, eliminando así la necesidad de medid...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> FITC-dextrano </td><td> Sigma </td><td> FD150S-1G </td></tr><tr><td> Fluoresceína GSL 1 - isolectina B 4 </td><td> Vector Laboratories </td><td> FL-1201 </td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> MP Biomedicals </td><td> 195178 </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Fluka </td><td> 76240 </td></tr><tr><td> El suero fetal bovino </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Compuesto óptimo de temperatura de corte (octubre </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Acetona </td><td> JT Baker </td><td> 9006-33 </td></tr><tr><td> Burro suero </td><td> Jackson </td><td> 017-000-121 </td></tr><tr><td> rata anti-ratón CD31, </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558736 </td></tr><tr><td> cabra anti-ratón PDGFR-β </td><td> R &amp; D Systems </td><td> AF1042 </td></tr><tr><td> burro anti-CD31 de rata Alexa 647 (Invitrogen) </td><td> Biolegend </td><td> 102516 </td></tr><tr><td> burro de cabra anti-Alexa 594 (Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> A11058 </td></tr><tr><td> Triton X -100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td></tr><tr><td> Agarosa de bajo derretimiento / PBS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9414-25G </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A413-4 </td></tr><tr><td> El alcohol de bencilo </td><td> Acros Científico </td><td> 148390010 </td></tr><tr><td> Benzoato de bencilo </td><td> Acros Científico </td><td> 105860010 </td></tr><tr><td> Se desliza la depresión </td><td> Fisher Scientific </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> Fluorogel </td><td> Microscopía electrónica de Ciencias </td><td> 17985-10 </td></tr><tr><td> Cubierta de vidrio (22x22) -1,5 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 152222 </td></tr><tr><td> Zeiss LSM 510 Microscopio Confocal Meta </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Micro pinza de disección </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td></tr><tr><td> Parafilm No. OM992 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-374-16 </td></tr><tr><td> 12 y 24, así microplacas </td><td> Evergreen Científico </td><td> 222-8044-01F </td></tr><tr><td> Superfrost / Plus Micropreparados </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> 4 ml viales claras </td><td> Nacional de Investigaciones Científicas </td><td> B7800-2 </td></tr></tbody></table>

un método para etiquetar los vasos sanguíneos en embriones de ratones

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

El establecimiento de una red de vasos sanguíneos funcionales es una parte esencial de la organogénesis, y es necesario para la función del órgano óptimo. Por ejemplo, en la formación de la vasculatura del timo y el patrón adecuado es esencial para la entrada en el órgano de timocitos y células T maduras salida a la periferia. La disposición espacial de los vasos sanguíneos en el timo depende de señales del microambiente local, es decir, las células epiteliales del timo (TEC). Varios informes recientes sugieren que la interrupción de las señales de estos resultados en un recipiente de 1,2 defectos timo sangre. Estudios previos han descrito técnicas que se utilizan para etiquetar los 1,2 timo vasculatura neonatal y de adultos. Se demuestra aquí una técnica para el etiquetado de los vasos sanguíneos en el timo embrionario. Este método combina el uso de FITC-dextrano o Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina I (GSL 1 - isolectina B 4) inyecciones faciales vena y CD31 tinción de anticuerpos para identificar las estructuras vasculares del timo y PDGFR-β a la etiqueta del timo mesénquima perivascular 3-5. La opción de utilizar cryosections o secciones vibratome también se proporciona. Este protocolo se puede utilizar para identificar el timo defectos vasculares, lo cual es crítico para la definición de los roles de TEC-moléculas derivadas del timo en la formación de vasos sanguíneos. Como el método de las etiquetas de todo el sistema vascular, también puede ser utilizado para analizar las redes vasculares en múltiples órganos y tejidos en todo el embrión, incluyendo la piel y el corazón de 6-10.

En este artículo se describe un método para el etiquetado de la piel embrionaria y los vasos sanguíneos del timo.

Un método para etiquetar los Vasos sanguíneos en embriones de ratones

El establecimiento de una red de vasos sanguíneos funcional es una parte esencial de la organogénesis y es necesario para el funcionamiento óptimo de los órganos. Por ejemplo, en...

El objetivo general del siguiente experimento es determinar los efectos de mutaciones genéticas específicas en el desarrollo y la estructura vascular. Esto se logra mediante la disección del embrión y los tejidos extraembrionarios juntos, a fin de obtener una muestra adecuada para la inyección. A continuación, se inyecta una vena facial con un colorante fluorescente para marcar la vasculatura intacta.Luego, el embrión se prepara para el análisis. Finalmente, se realizan montajes completos o secciones de la vasculatura marcada para obtener imágenes que muestren la estructura tridimensional de la vasculatura normal mediante microscopía de inmunofluorescencia de montajes completos o secciones de tejido. Tuve por primera vez la idea de este método cuando me interesaba determinar el punto temporal del desarrollo en el que la vasculatura periférica se conecta con el timo mediante angiogénesis.Para comenzar, prepare FXI dextrano o GS L uno I selectina B cuatro en PBS en un tubo einor de 1,5 mililitros, agregue 100 microlitros de la solución stock de 1,25 milimolar de azul rápido en PBS al dextrano FTSE, o 180 microlitros al GS L uno I selectina B cuatro para que las soluciones sean visiblemente azules. A continuación, caliente el tubo a 37 grados Celsius.Disecar embriones de E 14,5 a E 18,5 y las bolsas de vitelo juntas, dejando el pedículo umbilical intacto. Transferir los embriones a una nueva placa de Petri e inmergirlos en PBS a temperatura ambiente. A continuación, colocar un embrión para obtener una vista sagital de la cara.Luego, con pinzas de disección microscópicas, sostenga suavemente el embrión por la cabeza. Utilizando una aguja de calibre 30, inyecte 50 microlitros de dextrano FXI o GS L uno I selectina B cuatro en la vena facial, orientando la aguja hacia la parte posterior de la cabeza. Cuando el colorante sea visible en la vena umbilical, retire la aguja y separe el embrión del lan.Almacenar el embrión. Deje que el embrión permanezca en PBS a temperatura ambiente durante dos o tres minutos para que el colorante circule por todo el embrión. Después de permitir que el colorante circule por todo el embrión, retire muestras de piel de las regiones de las extremidades, la espalda y el estómago.Lave las muestras de piel con PBS frío y fíjelas en PBS con paraformaldehído al 4% durante dos horas. Luego, lávelas tres veces durante 10 minutos cada vez en viales transparentes de cuatro mililitros con dos mililitros de PBS frío. Coloque las muestras de piel sobre portaobjetos y añada 100 microlitros de medio de montaje y una cubeta a cada portaobjeto.Deje secar las laminillas en la oscuridad antes de realizar el aclaramiento para imagenología en BABB y la posterior imagenología confocal, que se puede llevar a cabo para obtener imágenes de mayor resolución de la vasculatura cutánea. Para preparar los tejidos para corte por criosección, congele rápidamente los embriones completos en nitrógeno líquido para criosección. Extienda OCT sobre un bloque de sección y monte el embrión.Corte el tejido congelado en secciones de 10 micrones de grosor y coléctelas sobre portaobjetos. Fije las secciones en acetona durante cinco a 10 minutos, luego lávelas tres veces en bloque de TBS frío con 10% de suero de asno en TBS en una cámara de humedad. A temperatura ambiente, agregue 100 microlitros de anticuerpo primario a cada sección.En este ejemplo, utilizamos ratón anti-CD 31 humano para marcar el endotelio y cabra anti-P-D-G-F-R beta humano para marcar las células perivasculares, con el fin de asegurar que el anticuerpo se distribuya uniformemente a través de la sección. Cubra los portaobjetos con tiras individuales de parafilm recortadas. Incube los portaobjetos durante una hora hasta toda la noche en una cámara húmeda a cuatro grados Celsius.A continuación, lave las secciones tres veces con TBS frío. Incube con 100 microlitros de los anticuerpos secundarios apropiados durante un mínimo de 30 minutos. Finalmente, lave tres veces con TBS frío. Añada 100 microlitros de medio de montaje y un cubreobjetos a cada portaobjetos.Deje secar las laminillas en la oscuridad. Para el corte en vibrátomo, diseccione los lóbulos del timo de los embriones y enjuáguelos en PBS frío. Fije el tejido en PBS con paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante dos horas.Después de lavar las muestras en PBS con Triton X, llene un pequeño cartucho de plástico con agarosa al 4 % de fusión baja. Sumerja las muestras en la agarosa en PBS, asegurándose de que el tejido esté en contacto con el fondo del cartucho. Deje que la agarosa se solidifique sobre hielo.Luego, use una cuchilla de afeitar para cortar el exceso de agarosa. Aplique pegamento al bloque de VIBRAM y adhiera la muestra al bloque. Vierta PBS frío en el baño de agua Vibram hasta que la muestra y la cuchilla queden sumergidas.Establezca la velocidad y la amplitud. La amplitud debe reducirse. Si las secciones se desintegran debido a una agitación excesiva, corte 50 secciones de tejido.Luego, utilizando pinzas, transfiera las secciones a PBS frío en una placa microtituladora de 24 pocillos. Bloquee las secciones en 500 microlitros de suero de asno al 10 % en PBS con Triton X durante 30 minutos. Después de agregar anticuerpos primarios como anti-CD31 y anti-P-D-G-F-R beta, incube de ocho horas a toda la noche en una placa microtituladora cubierta a cuatro grados Celsius. A continuación, lave tres veces en PBS con Triton X durante un total de ocho horas a cuatro grados Celsius.Después de bloquear nuevamente las secciones e incubarlas en anticuerpos secundarios, lave las muestras tres veces en PBS Triton X durante un total de ocho horas a cuatro grados Celsius. Luego, vuelva a fijar las muestras en PBS con paraformaldehído al 4 % durante 30 minutos en hielo y lávelas otras tres veces en PBS Triton X durante 30 minutos en hielo. Deshidrate las muestras mediante una serie graduada de metanol en PBS Triton X durante 10 minutos en cada paso.Luego, reemplace el metanol al 100 % por metanol fresco e incube durante una hora a temperatura ambiente. Coloque la muestra en un portaobjetos de vidrio con cavidad y cubra la muestra con una solución uno a uno de BABB y metanol. Incube las muestras durante 10 a 15 minutos.A continuación, sustituya la solución por BABB al 100% e incube a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos o hasta que se vuelva transparente. Añada un cubreobjetos y selle con dos o tres capas de esmalte de uñas. Deje que el esmalte de uñas se endurezca en la oscuridad y a temperatura ambiente.La muestra puede almacenarse a cuatro grados Celsius, pero debe tomar las imágenes entre 12 y 24 horas. Imagen secciones congeladas de 10 micrones con un microscopio confocal utilizando el objetivo plan A per cromado 20 veces 0,8 con líneas láser de 6 33 4 88 y 5 43 nanómetros; adquiera secciones Z confocales de un micrón de secciones incluidas en aros de 50 micrones utilizando el objetivo plan A per cromado 10 x 0,4 con líneas láser de 4 88 5 43 y 6 33 nanómetros; reconstruya secciones Z seriadas utilizando el software de análisis de imágenes Zeiss AIA vision 4.6 o software similar. La marcación eficiente de la vasculatura embrionaria es fundamental para evaluar defectos en los vasos sanguíneos de ratones embrionarios. Estas figuras muestran la marcación específica de los vasos sanguíneos del timo en E 16,5 y la marcación simultánea de GS L uno y selectina.B cuatro embriones inyectados con CD31, así como tinción de los ventrículos derecho e izquierdo. Se utilizó el protocolo GSL uno selectina B cuatro para secciones criostáticas en estos experimentos. Se muestra aquí la marcación en montaje completo de la red de vasos sanguíneos de la piel en ratones E16.5 siguiendo este procedimiento.Otros métodos, como la marcación simultánea de las células estromales y las células sanguíneas con el sistema vascular, pueden utilizarse para responder preguntas adicionales, como: ¿Cómo interactúan las células sanguíneas y las células estromales con el sistema vascular en el embrión de ratón bajo condiciones normales y patológicas?

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Research

Investigación

JoVE Journal

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Inmunología e Infección

Se introduce un inmunohistoquímica todo el montaje y la microscopía confocal de barrido láser con múltiples etiquetas para analizar la formación de complejos de la red vascular de la piel del ratón extremidades embrionarias.

Todo el montaje El análisis inmunohistoquímico de la piel del miembro Vasculatura embrionarias: un sistema modelo para estudiar la morfogénesis vascular ramificación en embriones

La retina murino neonatal proporciona un modelo bien caracterizado fisiológica de la angiogénesis, que permite que las investigaciones de las funciones de los diferentes genes o fármacos que modulan la angiogénesis en...

Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em&gt; En vivo</em

Se describe una serie de métodos para inyectar colorantes, vectores de ADN, virus, y células con el fin de supervisar tanto el destino celular y el fenotipo de las células endógenas y injertados derivados de células embrionarias o pluripotentes dentro de embriones de ratón en el día embrionario (E) 9,5 y etapas posteriores de desarrollo.

Etiquetado de la célula y de inyección en Desarrollo de embriones de ratón Corazones

Este protocolo describe una técnica para evaluar los cambios en la vasculatura materna durante el embarazo en ratones. Utilizando métodos estereológicos, se evalúa cuantitativamente la remodelación de las arterias espirales deciduales y los resultados se confirman cualitativamente mediante inmunohistoquímica.

Evaluación del Materno remodelado vascular durante el embarazo en el útero de ratón

Este protocolo demuestra un método basado en la fluorescencia para visualizar la vasculatura y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden visualizarse minutos después de la inyección de un colorante fluorescente en el corazón de un embrión después de manipulaciones genéticas y / o farmacológicas para estudiar el desarrollo cardiovascular in vivo .

Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Este trabajo demuestra un nuevo enfoque para evaluar la proliferación, la diferenciación y el potencial de formación de vasos de células madre endoteliales vasculares (VESCs) a través de trasplante de almohadillas de grasa mamaria seguido de preparación de tejido de montaje completo para la observación microscópica. También se presenta una estrategia de seguimiento de linaje para investigar el comportamiento de VESCs in vivo .

Una nueva técnica de trasplante de grasa mamaria para visualizar la generación de vasos de células madre endoteliales vasculares

La examinación ecocardiográfica se utiliza con frecuencia en los ratones. Dispositivos de ecografía de alta resolución caro han sido desarrollados para este propósito. Este protocolo describe un procedimiento ecocardiográfico asequible combinado con análisis de morfometría histológica para determinar la morfología cardiaca.

Examen ecocardiográfico e histológico de la morfología cardiaca en el ratón

Presentamos los protocolos para examinar el desarrollo del corazón de ratón utilizando microscopía epifluorescente Monte todo en embriones de ratón disecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato reportero knock-en ratones. Este método nos permite visualizar directamente cada etapa de la formación del ventrículo durante el desarrollo del corazón de ratón sin mano de obra intensiva métodos histoquímicos.

Análisis del desarrollo de la cámara cardiaca durante la embriogénesis de ratón usando todo de Monte de epifluorescencia

El artículo describe un protocolo rápido para etiquetar los vasos sanguíneos en un pez teleósteo por perfusión cardíaca de DII diluido en fijador, usando medaka (Oryzias latipes) como modelo y centrándose en el cerebro y el tejido pituitario.

Etiquetado de los vasos sanguíneos en el cerebro Teleost y la hipófisis usando perfusión cardíaca con un-fijador DiI

Demostramos la inducción química de la dilatación de grandes vasos sanguíneos en ratones como modelo para investigar la disfunción cerebrovascular, que se puede utilizar para el modelado de la demencia vascular y la enfermedad de Alzheimer. También demostramos la visualización de la vasculatura mediante la inyección de compuesto de caucho de silicona y proporcionamos una guía visual clara para medir los cambios en el tamaño de los vasos sanguíneos.

Un enfoque visual para inducir dolicoectasia en ratones para modelar la disfunción cerebrovascular mediada por grandes vasos

Este protocolo introduce un método rápido para la obtención de imágenes vasculares tridimensionales cuantitativas de montaje completo mediante microscopía de fluorescencia de lámina de luz. La eficacia del método se demuestra utilizando el sistema de arterias de arco faríngeo del modelo de embrión de pollo, con fuerzas hemodinámicas cuantificadas mediante dinámica de fluidos computacional.

Obtención rápida de imágenes de alta resolución de la vasculatura de animales pequeños para estudios cuantitativos

Aprenda a etiquetar vasos sanguíneos en embriones de ratón mediante inyección de tinte fluorescente en la vena facial. Este método permite visualizar la estructura vascular tridimensional para estudiar el desarrollo embrionario.

Un método para etiquetar los Vasos sanguíneos en embriones de ratones

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