Name: פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ אנופלס Spp. (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: למדו שיטת Chelex לחילוץ DNA מאנופלס Spp. לזיהוי מולקולרי וגנוטיפינג של מלריה. שיטה מהירה ובטוחה לשימוש שגרתי במעבדות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים הם חבים לראשים, מוכתרים והקהילות של Macha לunwaveing ​​לשתף הפעולה במהלך אוספים לדוגמא שדה יתושים. ד&quot;ר דאג נוריס ורבקה קנט הציע מומחיות רבה ערך על פרוטוקול ההמלחה החוצה. עבודה זו מומנה על ידי מערכת ג&#39;ונס הופקינס מלרית מכון מחקר פיילוט המענק. סטנדרטי הטפיל DNA מעבדת יתושים ונתרמו באדיבות על ידי MR4 סוג, אמריקאי ואוספת תרבות.

1. Dissection הכנת דגימות יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתוש מקום על חיתוך קטן של parafilm והר על ביתור מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות בטיפת מי deionized לרכך רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך נבלת היתוש בדיוק במפרק בין בית החזה והבטן, ובכך סחבתי את הראש ובית החזה מסעיף הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כל קטע יתושים גזורים לתוך צינור נקי autoclaved 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge prelabeled עם פרטי יתושי ת.ז וכראוי מסומן לציון סעיף גוף (לדוגמה: &quot;מ &#39;&quot; לקטע באמצע בטן; &quot;HT&quot; לראש ובית החזה בסעיף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך parafilm ולנגב במת מיקרוסקופ בזהירות עם 70% אלכוהול טבול Kimwipe לפני עיבוד היתוש הבא. </li></ol> 2. הפקת דנ&quot;א מדוגמאות יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 μl פיפטה של ​​מים לתוך צינור deionized מדגם עצת פיפטה שימוש לטחון סעיף היתוש השקוע באו&quot;םהשעית iform. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של פתרון סאפונין 1% לhomogenate מדגם ותמהיל ידי vortexing הרגעי העדין autoclaved 1X PBS /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 20000 עבור 2 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה בμl 1X PBS 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שוב ב20000 XG עבור 2 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ידי vortexing העדין (5 שניות), resuspend גלולה במי deionized סטרילי μl 75 ו 25 μl של 20% השעית w / v Chelex-100 שרף במי deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חור פירס במכסה של צינור מדגם באמצעות מזרק 23 ז סטרילי flamed במבער בונזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעית רתיחת מדגם באמבט מים במתקן צף (או בבלוק חימום) למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 20000, עבור פתרון ה-DNA העברה התפתח 1 דקות ולתוך בקבוקון האחסון prelabeled לשימוש כתבנית ביישומי PCR. </li></ol> 3. Plasmodium falciparum genotyping ואנופלסspp. זיהוי מולקולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 μl של תמצית ה-DNA Chelex ב25 תגובות PCR μl כדי לבדוק את איכות דנ&quot;א 11, לזהות מיני אנופלס 10 ולגנוטיפ פ falciparum 12 דלקות בלוטת אמצע בטן ורוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למקסם את תשואת amplicon, במיוחד לפ איתור falciparum, כולל 1.5x אלבומין בסרום שור (BSA) בבדיקת PCR. הרכב התגובה הבא מומלץ: (2.5 תבנית μl, 0.25 פריימרים מיקרומטר, מגנזיום כלוריד מיקרומטר 1.5, 200 dNTPs מיקרומטר, 1X PCR חיץ, 1.5x BSA וDNA פולימראז 1.0U Taq, ב 25 כרכי μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק לאיכות ה-DNA בתמצית, להגביר אזור דהידרוגנז פרוקי רגלי המיטוכונדריה ניקוטינמיד אדנין dinucleotide (NADH) מקטע 4 (ND4) גן (פריימרים ND4FW [5&#39;-GTD יאט tta TGA TTR CCT ​​AA-3 &#39;] וND4RV [5&#39; CTT-CGD CTT CCW ADW CGT TC-3 &#39;]; מצפה מוצר 400bp) 11,13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדל אנופלס גמביהדואר SL. מיני אחים (An. gambiae ss ו. arabiensis בלבד), להגביר אזור איגוף SNPs באזור spacer intergenic (IGS), (פריימרים האו&quot;ם [5&#39;-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 &#39;], GA [5&#39;-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 &#39;], AR [5&#39;-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3&#39;]; מצפה 390bp המוצר gambiae ss, 315bp arabiensis) 10,11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ההקלדה פ פולימורפיזמים סמי התנגדות antifolate falciparum, לבצע PCR המקונן כדי להגביר אזור איגוף קודונים חומצת אמינו 108, 51, 59, 16 ו 164 בטפיל dihydrofolate רדוקטאז (DHFR) גן: עגולי פריימרים עיקריים: M1 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 &#39;] וM5 [5&#39;-AGTATATACATCGCTAACAGA-3&#39;] עגולים פריימרים שניים: M3 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 &#39;] עם F / [5&#39;-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3&#39;] או F [5&#39;-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] עם M4 [5&#39;-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 &#39;]). גם להגביר אזור המכיל חומצת אמינו קודונים 436, 437, 540, 581 אnd 613 בפ synthetase גן falciparum dihydropteroate (DHPS): הסבב הראשוני פריימרים R2 [5&#39;-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 &#39;] עם R / [5&#39;-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3&#39;]; פריימרים עגולים משניים J: [5&#39;-&#39;TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3&#39;] עם K / [5&#39;-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 &#39;] או K: [5&#39;-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 &#39;] עם K /, או L [5&#39;-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 &#39;] עם L / [5&#39;-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3&#39;] 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 amplicon μl הכפוף לdigestions אלל הספציפי הגבלה באנזים 30 תגובות μl בעקבות הוראות היצרן, כדי לזהות פולימורפיזמים סמים antifolate התנגדות הקשורים 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 μl הנושא של ה-PCR amplicon (או 15 μl הגבלת התקציר) לכל נתיב של 2% ג&#39;ל ethidium רומיד המוכתם agarose לאלקטרופורזה (100 - 120V) ולדמיין להקות תחת קוף UV. </li></ol>

<ol><li>Bonnet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+antimalarial+treatment+in+Guinea%3A+in+vivo+study+of+two+artemisinin+combination+therapies+in+Dabola+and+molecular+markers+of+resistance+to+sulphadoxine-pyrimethamine+in+N%27Zerekore%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore.</a> Malar. J. 6, 54(2007).</li>
<li>Nsimba, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulphadoxine%2Fpyrimethamine+versus+amodiaquine+for+treating+uncomplicated+childhood+malaria+in+Gabon%3A+a+randomized+trial+to+guide+national+policy%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy.</a> Malar. J. 7, 31(2008).</li>
<li>Oyewole, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviour+and+population+dynamics+of+the+major+anopheline+vectors+in+a+malaria+endemic+area+in+southern+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vector+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria.</a> J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).</li>
<li>Harris, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+proportion+of+asymptomatic+Plasmodium+infections+with+low+and+sub-microscopic+parasite+densities+in+the+low+transmission+setting+of+Temotu+Province%2C+Solomon+Islands%3A+challenges+for+malaria+diagnostics+in+an+elimination+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J.+%22%5BJournal%5D)">A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting.</a> Malar. J. . 9, 254(2010).</li>
<li>Ouedraogo, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substantial+contribution+of+submicroscopical+Plasmodium+falciparum+gametocyte+carriage+to+the+infectious+reservoir+in+an+area+of+seasonal+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission.</a> PLoS ONE. 4, e8410(2009).</li>
<li>Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+challenges+in+the+scaling+up+of+HIV%2C+TB%2C+and+malaria+programs%3A+The+interaction+of+health+and+laboratory+systems%2C+clinical+research%2C+and+service+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery.</a> Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).</li>
<li>Ishengoma, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Health+laboratories+in+the+Tanga+region+of+Tanzania%3A+the+quality+of+diagnostic+services+for+malaria+and+other+communicable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Trop.+Med.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).</li>
<li>Alonso, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+research+agenda+for+malaria+eradication%3A+vector+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">A research agenda for malaria eradication: vector control.</a> PLoS Med. 8, e1000401(2011).</li>
<li>Grimberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+non-organic+procedure+for+the+isolation+of+genomic+DNA+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood.</a> Nucleic Acids Res. 17, 8390(1989).</li>
<li>Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indentification+of+single+specimens+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).</li>
<li>Kent, R. J., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mammalian+blood+meals+in+mosquitoes+by+a+multiplexed+polymerase+chain+reaction+targeting+cytochrome+B%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).</li>
<li>Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum%3A+detection+of+polymorphisms+in+the+dihydrofolate+reductase+and+dihydropteroate+synthetase+genes+by+PCR+and+restriction+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion.</a> Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).</li>
<li>Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+isolation+by+distance+among+Aedes+aegypti+populations+along+the+northeastern+coast+of+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).</li>
<li>Kreader, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relief+of+amplification+inhibition+in+PCR+with+bovine+serum+albumin+or+T4+gene+32+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).</li>
<li>Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsatellite+DNA+polymorphism+and+heterozygosity+among+field+and+laboratory+populations+of+Anopheles+gambiae+ss+%28Diptera+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae).</a> J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).</li>
<li>Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+polymerase+chain+reaction-amplified+malarial+DNA+in+infected+blood+and+individual+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes.</a> Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).</li>
<li>Al-Soud, W. A., Radstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+PCR-inhibitory+components+in+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).</li>
<li>Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitory+effect+of+pentobarbitone+on+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Methods%22%5BJournal%5D)">The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השיטה הפשוטה Chelex מוצגת כאן מאפשרת מיצוי של האיכות אנופלס spp ופ דנ&quot;א falciparum מדגימות המתאימים ליישומים מגוונים PCR יתושים. טכניקה זו יכולה להיות מועסקת לזיהוי מולקולרי של יתושי מלרית וקטור ומעקב של פ העמיד לתרופות אללים falciparum ביתושים לתוכניות בקרת מלריה לאומיות. יתרונותיה של הטכניקה הפשוטה Chelex כוללים פשטות, ריאגנטים פחות ולכן עלות, בטיחות וזמן עיבוד קצר יותר (37 דקות) מפרוטוקולים סטנדרטיים כגון (47 דקות 2 שעות וצעד לילה, טבלת 1) המלחה את השיטה 10. היתרונות הנ&quot;ל והדרישות מינימאליות מגיבות (3 ריאגנטים) בהשוואה לפרוטוקול הסטנדרטי הנוכחי (10 ריאגנטים, טבלת 1) 11,15, להפיק את פרוטוקול Chelex הפשוט ידידותי במיוחד למעבדות במדינה אנדמית בי מגיבה מתמדתשרשרת אספקה ​​היא לעתים קרובות קשה לתחזוקה. מגבלה של השיטה היא שכמו הפרוטוקול הסטנדרטי, זה היה גם נושא למעכבי PCR הידועים להתרחש בintegument יתושי 16. עם זאת, זו היא קלה בקלות על ידי הוספה של BSA במבחנים. BSA גם הועסק בהצלחה כהגברה משפרת נגד מעכבים ביישומי PCR אחרים 17,18.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Chelex-100, 50-100 רשת יבשה </td><td> BioRad </td><td> # 143-2832 </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> SIGMA </td><td> 142-7425 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> B9001S </td><td></td></tr></tbody></table>

פשוט פרוטוקול chelex למיצוי dna מ<em&gt; אנופלס</em&gt; spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

מדינות אנדמיות יותר ויותר לאמץ כלים מולקולריים להקלדה יעילה, זיהוי ומעקב נגד טפילי מלריה ויתושי וקטור, כחלק בלתי נפרד מתוכניות בקרת 1,2,3,4,5. להקמת בר קיימא של גישות המדויקות אלה בפעולות מחקר כדי לחזק את שליטת מלריה ומאמצי חיסול, שיטות פשוטות ובמחיר סבירים, עם ריאגנט החסכן ודרישות ציוד חיוני 6,7,8. כאן אנו מציגים טכניקה Chelex מבוססת פשוטה לחילוץ טפיל מלריה ודנ&quot;א מדגימות יתושי וקטור שדה שנאספו. אנו מורפולוגית זיהו 72 אנופלס gambiae sl. מ156 יתושים שנתפסו על ידי Pyrethrum התרסיס תופס בחדרי שינה נפרדת של משקי בית תוך 2 קרבה 2,000 ק&quot;מ של מכון המלריה בMacha. לאחר נתיחה כדי להפריד את הראש ובית החזה מהבטן לכל 72 אנופלס gambiae sl. יתושים, שני הסעיפים הונחו בנפרד ב1.5 צינורות microcentrifuge מ&quot;ל ושקוע ב20 μl מי deionized. באמצעות קצה פיפטה סטרילי, כל מקטע יתוש homogenized בנפרד להשעיה אחידה במי deionized. של homogenate שהתפתח מכל קטע יתוש, 10 μl נשמר תוך 10 μl האחר הועברה לצינור מ&quot;ל נפרד autoclaved 1.5. את aliquots הנפרד נחשפו למיצוי DNA או על ידי Chelex הפשוט או סטנדרטי המלחה החוצה חילוץ פרוטוקול 9,10. פרוטוקול ההמלחה החוצה הוא מה שנקרא ושימוש נרחב משום שהיא מעסיקה ריכוז מלח גבוה במקום בממסים אורגניים מסוכנים (כגון פנול וכלורופורם) לצעד משקעי החלבון במהלך חילוץ דנ&quot;א 9. תמציות שמשו כתבניות להגברת PCR באמצעות פריימרים מיקוד dehydroge פרוקי הרגליים המיטוכונדריה ניקוטינמיד אדנין dinucleotidenase (NADH) 4 גן המקטע (ND4) כדי לבדוק את איכות דנ&quot;א 11, PCR לזיהוי מיני אחי gambiae אנופלס 10 ו PCR מקונן להקלדה של זיהום Plasmodium falciparum 12. PCR השוואה באמצעות איכות ה-DNA (ND4) הראתה רגישות 93% וסגוליים 82% לגישה היחסית לפרוטוקול מבוסס המלחה החוצה Chelex. ערכים מקבילים של רגישות וסגולית היו 100% ו 78%, בהתאמה, באמצעות אח מיני זיהוי PCR ו92% ו 80%, בהתאמה, לפ falciparum האיתור PCR. לא היו הבדלים משמעותיים בשיעור של דגימות נותנות אות amplicon עם Chelex או המלחה מתוך פרוטוקול קבוע בכל השלושה יישומי PCR. גישת Chelex נדרשה שלושה ריאגנטים פשוטים ו37 דקות כדי להשלים, תוך המלחה מתוך הפרוטוקול הכרוך 10 ריאגנטים שונים ו2 זמן העיבוד &quot;47 דקות hr ו, כולל צעד בן לילה. התוצאות שלנו מראות הבשיטת Chelex דומה לחילוץ הקיים המלחה החוצה וניתן להחליף כגישה פשוטה וברת קיימא בהגדרות משאבים מוגבלים שבי שרשרת אספקת מגיב קבועה היא לעתים קרובות קשה לתחזוקה.

דוגמאות לתוצאות ממבחני PCR לאיכות תמצית ה-DNA יתוש (איור 1), זיהוי אנופלס arabiensis מולקולרי (איור 2) ופ falciparum זיהוי (איור 3) מראה ששיטת Chelex הפשוטה מניבה תוצאות דומות לרמת המלחה מתוך פרוטוקול 10, למרות צעדים הרבה פחות (טבלה 1). עם איכות DNA דומה בתמציות בהתאמה, אין זה מפתיע כי שיעורים חיוביים לדוגמה ביחס ל. מיני אחי gambiae כמו גם שיעורי זיהום טפיל לא היו סטטיסטי המבוסס על בדיקת צ'י המרובעת של McNemar (איור 3) שונים. רגישות (%) חושבת כTP / (TP + FN) * 100, שם מציין TP החיוביים אמיתית וFN מציין שליליים כוזבת. סגולי (%) נקבע כTN / (TN + FP) * 100, שם מציין TN תשלילים אמיתיים וFP מציין תוצאות חיוביות שגויות. איכות ה-DNA ( ND4) PCR הראה רגישות 93% וסגוליים 82% לגישת Chelex השוואה להמלחה הוקם מתוך פרוטוקול כתקן זהב. ערכים מקבילים של רגישות וסגולית היו 100% ו 78%, בהתאמה, באמצעות אח מיני זיהוי PCR ו92% ו 80%, בהתאמה, לפ falciparum האיתור PCR. התוספת של BSA לתערובות תגובה הביאה לעלייה כללית של התוצאות חיוביות PCR (איור 3) בשל הקלה של ה-PCR מעכבי 14, לשניהם Chelex והסדיר פשט המלחה את הפרוטוקול. עם זאת, עלייה זו לא הייתה מובהקת סטטיסטי, פרט לאיכות ה-DNA (ND4 PCR) על תמציות Chelex (p = 0.039). עיכול אנזים הגבלת אלל ספציפי בפ falciparum DHFR (או גן היעד אחר) amplicon מאפשר genotyping של זיהומי מלרית בלוטת אמצע בטן ורוק לאללים סמי התנגדות (איור 4; נתוני בלוטת רוק אינו מוצגים). <table bo style=";text-align:right;direction:rtl">rder = "1"&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> תהליך פשוט Chelex </td><td colspan="2"> תקן המלחה את הנוהל </td></tr><tr><td> צעדים </td><td> ריאגנטים </td><td> צעדים </td><td> ריאגנטים </td></tr><tr><td><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לצינור דגימה microfuge מ"ל 1.5 והומוגני ב100 μl של פתרון Saponin% 1 (2 דקות) 1X PBS /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב20000 XG עבור 2 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μl של 1X PBS ומערבב בעדינות על ידי vortexing רגע (3 שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ב20000 XG עבור 2 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl של 20% Chelex w / v במי deionized ומי deionized סטרילי μl 75. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חור פירס במכסה של צינור דגימה באמצעות מחט חמה, סטרילי 23 ז מזרק ותכולת שפופרת להרתיח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינור microfuge בשעת 20000 XG לדקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לפתרון ה-DNA חנות בקבוקון prelabeled סטרילית וב -20 ° C עד לשימוש (2.5 μl בתגובת PCR 25 μl). </li></ol></td><td> PBS Saponin Chelex-100 חרוזים </td><td><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לצינור דגימה microfuge מ"ל 1.5 והומוגני ב* חיץ נדר μl 100 עם DEPC% 1 (2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך השעות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תצטט 15 μl קר ז 8 אשלגן. מערבב בעדינות ולדגור על קרח למשך 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מדגם בצינורות microfuge ב20000 XG למשך 10 דקות והעברה supernatant לצינור מ"ל חדש 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של אתנול 100% ומערבבים היטב על ידי היפוך הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת מדגם בRT למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין דגימות ב20000 XG במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ולהשליך supernatant, והשאיר את הכדור לייבוש מלא בצינור (30 מ 'ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלול ב 20 μl של 0.1x SSC + RNAse (10 מיקרוגרם / מ"ל) הלילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף מי 80 μl DEPC ולאחסן ב -20 ° C עד שימוש. </li></ol></td><td> Diethylpyrocarbonate (DEPC) * נדר מאגר: 0.1 מ 'NaCl 0.2 סוכרוז M 0.1 מ 'טריס-HCL 0.05 M EDTA, pH 9.1 0.5% SDS במי DEPC תצטט ז 8 אשלגן אתנול נתרן ציטראט חיץ מלוח 0.1x (SSC) RNAse (10 מיקרוגרם / מ"ל) </td></tr><tr><td colspan="2"> זמן כולל: 37 דקות </td><td colspan="2"> זמן כולל: 2 47 דקות לשעה, בתוספת הלילה </td></tr></tbody></table> טבלת 1. הצעד אחר צעד השוואה של ריאגנטים ודרישות זמן לפרוטוקול Chelex פשוט ולעמודארד המלחה את השיטה להפקת דנ"א מדגימות יתושים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1. השוואת ND4 המיטוכונדריה PCR של DNA מאיכות הפשוטה Chelex "C" וסטנדרטי המלחה את התמציות "M" על דגימות שדה arabiensis אנופלס. NC שליטה, שלילית; M1 ו C1, C2 וM2, M3 ו-C3, ו M4 ו-C4 היא לזווג את ההמלחה ותמציות Chelex מאותה. דגימות יתושי arabiensis. L, סולם 100 נ"ב ה-DNA. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2 המולקולרי זיהוי PCR לarabiensis אנופלס C1 ו M1, M2 וC2, C3 ו-M3, C4 ו M4 יסמנו amplicon המתאים מהמלחה החוצה "ז" ופשט תמציות Chelex "C" לאותן דגימות דנ"א יתושים;.. AR, אנופלס arabiensisביקורת חיובית; הליטר, 100 נ"ב סולם הדנ"א. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. איתור של תוצאות חיוביות על Chelex והמלחה החוצה תמציות DNA לדגימות שדה יתושים, עם מבחני PCR לזיהוי מולקולרי של אנופלס arabiensis (ע"ר) 10, גן פרוקי רגלי NADH דהידרוגנז 4 (ND4) בדיקת איכות ה-DNA 11, ו-P עמידות לתרופה antifolate . falciparum DHFR 12 genotyping (F-M4). תוצאות מוצגות עבור מבחנים לרוץ עם או בלי BSA בתמהיל התגובה. מבחן צ'י המרובע של McNemar שמש כדי לקבוע אם ההבדלים בין אחוזי PCRs החיובי מהדנ"א שחולצו מן Chelex הפשוט והסטנדרטיים המלחה מתוך פרוטוקולים היו מובהקים סטטיסטי. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> פ זיהומי falciparum ביתושים (נתוני אמצע הבטן מוצגים) עבור אללים עמידות לתרופה. אני עיכול BstN על amplicon איגוף קודון 108 לפ גן falciparum DHFR 12 תערוכות מוטנטים S108T cycloguanil עמידים בדגימות יתושים (M1-M5; נתוני אמצע הבטן מוצגים). U, לא מעוכל 522 נ"ב amplicon; FCR3, המעבדה הסטנדרטית פ שיבוט falciparum חיובי שליטה נושא S108T; K1, פ falciparum מעבדה סטנדרטית שליטה שלילית שיבוט נושאה S108N cycloguanil רגיש; הליטר, 100 נ"ב סולם הדנ"א.

דרך מהירה ואפשרית כדי לחלץ טפיל מלריה ואיכות ה-DNA וקטור מדגימות יתושים מתוארת. ניצול תכונות chelating של שרף Chelex, השיטה הפשוטה מאפשרת genotyping של טפילי מלריה בשלבי יתושי בלוטת אמצע בטן ורוק, כמו גם זיהוי מולקולרי של<em&gt; אנופלס</em&gt; אח מינים באמצעות PCR.

פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ<em&gt; אנופלס</em&gt; Spp.

מדינות אנדמיות מאמצות יותר ויותר כלים מולקולריים לצורך תיפוס (typing), זיהוי ומעקב יעילים נגד טפילי מלריה והווקטור...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק DNA של מלריה, טפילים ויתושים מחלקי המעי האמצעי ובלוטות הרוק של דגימות חריגות. דבר זה מושג תחילה על ידי חיתוך היתוש בדיוק במפרק שבין הבטן לחזה, ובכך מפרידים את המעי האמצעי מחלק בלוטות הרוק. לאחר מכן, כל חלק נטחן בנפרד במים דה-יוניים.לאחר מכן, תרחיף הרקמה עובר תמיסת בסיס (lyed) ושטיפה, ומשקע התאים מופק. לבסוף, משקע התאים מומס מחדש ומורתח, וה-DNA מופק. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות DNA באיכות גבוהה של יתושים ושל טפילי מלריה, המתאים לשימוש כתבנית לזיהוי anomlies, מיני וקטורים וגנוטיפ של זיהומי מלריה באמצעות PCR ועיכול על ידי אנזימי הגבלה ספציפיים לאלל.היתרון המרכזי של טכניקה פשוטה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיצוי אורגני ושיטות מיון, הוא שהיא משתמשת במספר קטן מאוד של ריאגנטים בטוחים וזמינים, ודורשת זמן עיבוד קצר בהרבה. כדי להתחיל בדיסקציה של היתוש, הניחו אותו על פיסת פאראפורם קטנה והניחו אותה תחת מיקרוסקופ דיסקציה. כסו את היתוש בטיפה של מים דה-יוניים.כדי לרכך את הרקמה בגודלה, יש לחתוך את גופת היתוש בדיוק במפרק שבין החזה לבטן. כך יופרדו הראש והחזה מהחלק הבטני. העבירו כל חלק מפורק מהיתוש לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה נקייה ועקרה בנפח 1.5 milliliter, המסומנת מראש עם מספר הזיהוי של היתוש וחלקי הגוף. הסירו את ה-parafilm והשתמשו בנייר Kim wipe טבול ב-70% alcohol כדי לנגב בזהירות את משבת המיקרוסקופ לפני המעבר ליתוש הבא. כדי למסות את ה-DNA של היתוש, שאבו תחילה 20 µL של מים דה-יוניים אל שפופרת הדגימה.השתמשו בטיפ של הפפטה כדי לגרס את נתח היתוש הטבול עד לקבלת תמיחה אחידה. הוסיפו 100 µL של תמיסת XPBS 1% saponin שעברה עיקור באוטוקלאב אל הומוגנאט הדגימה, וערבבו בעזרת וורטקס עדין. דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.בשלב הבא, סבבו בצנטריפוגה ב-20,000 G למשך שתי דקות, והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). השביעו מחדש את המשקע (pellet) ב-100 µL של one XPBS. לאחר מכן, חזרו על פעולת הסבב.הוסיפו 75 µL של מים דה-יוניים סטריליים ו-25 µL של תרחיף שרף Cellex 100 בריכוז 20% weight per volume במים דה-יוניים, וערבבו בעזרת vortex בעדינות כדי להשעיות מחדש את המשקע באמצעות מחט היפודרמית סטרילית בכילול 23 gauge שעברה עיקור בלהבת מבערן בנזן. פתחו חור במכסה של מבחנת הדגימה.הרתיחו את תרחיף הדגימה בבלוק חימום למשך 10 דקות. סובבו בצנטריפוגה ב-20,000 G למשך דקה אחת, והעבירו את תמיסת ה-DNA למבחנה למסמך מסומנת מראש לשימוש כתבנית בתגובות PCR כדי לבדוק את איכות ה-DNA שהופק, ולהגביר אזור בגן mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit four של arthropod mi, שצפוי להפיק פרגמנט של 400 base pair. לאחר מכן, כדי להבדיל בין מיני Ananais Gambia, הגבירו אזור המקיף SNPs באזור ה-intergenic spacer, שצפוי להפיק גדלים של 390 base pairs עבור Ananais Gambia Sens Stricto, ו-315 base pairs עבור ananais api.לאחר מכן יש לבצע טיפוס גנטי (genotyping) של פולימורפיזמים העמידים לתרופות אנטי-פולאט ב-p falciparum. בצעו nested PCR להגברה של האזור הסמוך לקודוני חומצות האמינו 16 51 59, 108 ו-164. בתוך הגן של ה-dihydro folate reductase בטפיל, בצעו עיכול ספציפי לאלל של האמפליקון כדי לזהות עמידות לתרופות אנטי-פולאט.פולימורפיזם קשור. בדוק את התגובות על ג'ל 2%AROS. דוגמאות של תוצאות מבדיקות PCR לבדיקת איכות תמצית DNA של יתוש, זיהוי מולקולרי של RABIS וטיפוס גנטי של p falciparum מראות כי שיטת Kelex המפושטת מניבה תוצאות דומות לפרוטוקול השקיעה במלח (salting out) הסטנדרטי, למרות פחות שלבים ופחות מרבע מהזמן, עם איכות DNA דומה בתמציות הרלוונטיות. אין זה מפתיע ששיעורי החיוביות של הדגימות ביחס לאנומליות, למינים מקבילים של Gambia, וכן שיעורי זיהום הפרזיטים, לא היו שונים באופן סטטיסטי על פי מבחן חי-ריבוע של McNear.הוספת BSA לתערובות התגובה מובילה לעלייה כללית במספר תוצאות ה-PCR החיוביות הודות להסרת מעכבי PCR, הן בפרוטוקול ה-kelex המפושט והן בפרוטוקול ה-salting out הרגיל. עם זאת, עלייה זו לא הייתה מובהקת סטטיסטית, למעט באיכות ה-DNA בתמציות kelex. עיכול של האמפליקון של p falciparum באמצעות אנזים הגבלה ספציפי לאלל מאפשר, לאחר רכישת מיומנות בשיטה, ביצוע גנוטיפיקה של זיהומי מלריה במעי האמצעי ובבלוטות הרוק כדי לזהות אללים של עמידות לתרופות.ניתן לבצע טכניקה זו בערך ב-37 דקות אם היא מבוצעת כראוי.

a-simple-chelex-protocol-for-dna-extraction-from-anopheles-spp

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

לאחרונה תפוקה גבוהה טכנולוגיית ריצוף גדלה מאוד הרגישות של הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הניסוי מתבקש יישומו באמצעות תאים או רקמות גזור מטוהרים. כאן אנו קובעים שיטה להשתמש בטכניקה שבב...

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

בין השלושה סוגי היתושים,...

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה על כרומוזומים mitotic של יתושים

אנו מתארים שיטה חזקה לimmunoprecipitation הכרומטין באמצעות תאי T ראשוניים. השיטה מבוססת על גישות סטנדרטיות, אך משתמשת בקבוצה מסוימת של תנאים וריאגנטים המשפרים את היעילות למוגבלים בכמויות של תאים. חשוב מכך, תיאור מפורט של שלב ניתוח הנתונים מוצג.

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

ציור כרומוזום הוא שיטה שימושית לחקר ארגון גרעין התא והתפתחות הקריוטיפ. כאן, אנו מדגימים גישה לבודד ולהגביר אזורים ספציפיים של עניין מכרומוזומי פוליטן יחיד המשמשים לאחר מכן עבור פלואורסצנט דו מימדי בהכלאה situ (FISH).

ציור כרומוזום דו מימדי ותלות מימדי אצל יתושים מלריה

אנו מתארים כאן שיטה להפקת DNA פשוטה ומהירה מבוססי נייר של HIV proviral דנ"א שלם דם זוהה על ידי PCR כמותי. פרוטוקול זה יכול להתארך לשימוש באיתור סמנים גנטיים אחרים או בשיטות הגברה חלופיות.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

כאן אנו מציגים גישה חדשה לזיהוי וירוסים עם כפול-גדיל DNA הגנום. אנו משתמשים בשיטות הרגילות כדי לחלץ DNA ו- RNA עלים נגועים ולבצע רצף הדור הבא. כלים Bioinformatic להרכיב רצפים לתוך contigs, לזהות contigs המייצג את הגנום של וירוס והקצה הגנום לקבוצות בטקסונומיה.

שילוב ניתוח של דנ א ב מיצוי Virion גולמי עם הניתוח של RNA של עלים נגועים לגלות הגנום וירוס חדש

מתואר כאן פרוטוקול מיצוי DNA באמצעות חרוזים מגנטיים כדי לייצר עקירות DNA באיכות גבוהה יתושים. עקירות אלה מתאימות לגישת רצף של הדור הבא במורד הזרם.

פרוטוקול מיצוי DNA יתוש מבוסס חרוז מגנטי לרצף הדור הבא

פרוטוקול זה מספק את השלבים החל מיצוי DNA ועד לערך ניסיוני עבור PCR טיפה דיגיטלית (ddPCR), כולל ניתוח לזיהוי וכימות של אירועי הצטרפות קצה לא הומולוגיים (NHEJ) באתרי יעד לאחר מחשוף Cas9 המושרה על ידי gRNA ותיקון DNA. שימושים אחרים בשיטה זו כוללים יישומים כגון זיהוי פולימורפיזם ואימות וריאנט עריכת גנים.

PCR טיפה דיגיטלית כדי לזהות מוטציות indels באוכלוסיות יתושים אנופלין מהונדס גנטית

מאמר זה מפרט פרוטוקול לזיהוי מהיר של indels המושרה על ידי CRISPR / Cas9 ובחירה של קווים מוטנטיים יתוש Aedes aegypti באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה.

זיהוי איdel בעקבות MUtagenesis CRISPR/Cas9 באמצעות ניתוח נמס ברזולוציה גבוהה aedes aegypti יתוש

פרוטוקול זה מתאר בדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים סנדוויץ' כדי לזהות ספורוזואיטים של בלוטת הרוק ביתושים. באמצעות נוגדנים חד-שבטיים הזמינים בקלות, השיטה מאפשרת זיהוי חסכוני ובתפוקה גבוהה של יתושים הנושאים פלסמודיום פלציפרום או פלסמודיום ויוואקס. השיטה מתאימה לחקר העברת מלריה, כולל סקרים וקטוריים.

איתור פלסמודיום ספורוזואיטים ביתושי אנופלס באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים

למדו שיטת Chelex לחילוץ DNA מאנופלס Spp. לזיהוי מולקולרי וגנוטיפינג של מלריה. שיטה מהירה ובטוחה לשימוש שגרתי במעבדות.

פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ

גלה סרטונים נוספים