Name: El cultivo y la electrofisiología de las células en NRCC de patch-clamp chips (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprenda a registrar la actividad electrofisiológica de neuronas cultivadas utilizando chips de patch-clamp planar. Este método permite estudiar funciones de canales iónicos y realizar cribados de fármacos con alta resolución.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer Alexei Bogdanov para la fabricación de chips de patch-clamp en el CPFC y Hue Tran, Zhao Ping y Shiu Mateo para obtener ayuda con el montaje. Naweed Syed fue apoyada por un Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR) subvención. Collin Luk es el receptor de NSERC y Alberta Heritage Foundation for Medical Research (AHFMR) becas de.

1. Fabricación de chips El proceso descrito en 6 resultados en un 3 m de espesor autónomo película, una baja resistencia acceso 1 Mohmio y una superficie lisa en forma de embudo abertura que facilita un sello íntimo con la célula 9, véase la Figura 2. Las virutas se singulated y pegadas en paquetes de plexiglás con la abertura hacia un agujero que conecta el chip a un canal subterráneo. El encolado se dispensa en un modo que se minimice la capacidad en paralelo a un nominal de 17 pF. Paquetes están equipados con dos mm de diámetro y 1,5 mm 6 tubos de vidrio largas como puertos fluídicos (Figura 3). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Micrografía electrónica de barrido de una sección de haz de iones enfocado de una NRCC de patch-clamp de chips muestra una superficie lisa y de dióxido de silicio en forma de embudo que favorece los contactos íntimos de células, y un orificio poco profundo que representa una baja de acceso resistanccorreo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 3. Un chip está pegado a la parte inferior del frasco de cultivo en un paquete de plexiglás equipado con fluidos subterráneos y tubos de vidrio. 2. La esterilización, el cebado y pruebas Los siguientes pasos deben realizarse en una cabina de seguridad biología para evitar la contaminación o el taponamiento de la abertura. <ul type="disc"><li> Esterilizar fichas en un limpiador Harrick básica de plasma (www.harrickplasma.com) con una presión de aire residual 0.1-0.3 mbar durante 15 minutos a la máxima potencia de 18 W. Otros sistemas de aire de plasma puede ser utilizado, con una densidad de potencia comparables (24 mW / cm 3) y mantener el producto de la densidad de potencia y constante de tiempo. El tratamiento con plasma también hace que los chips hidrófilo, lo que facilita el cebado. </li><li> Colocar los tubos de vidrio con agua estéril tubo de silicona Silastic Laboratorio, 1 mm de diámetro interno x 2 mm OD (Cole ParmerCat. # 96115 hasta 08), 3inch en un lado, de 1 pulgada en el otro lado. </li><li> Llenar fluídica a través de los tubos con solución estéril filtrada estándar tampón fosfato (PBS), asegurándose de que ninguna burbuja está atrapado. </li><li> Sujete el tubo de silicona de largo, mientras que la presurización de la PBS desde el lado corto a 1 atm. Una piscina de PBS se filtra a través de la abertura puede ser visible en el vial. Sujete la fuente de presión de la PBS y desconecte el tubo de silicona pasos de que la oferta. </li><li> Llenar vial con filtrada PBS utilizando una jeringa. </li><li> Sumergir una Ag / Ag: electrodo Cl en el tubo corto y un contra-electrodo en el vial. Un medidor de impedancia se usa para confirmar que la resistencia de acceso es entre 300kohm y 3Mohm y la capacitancia de derivación está entre 10pF y 25 pF. Un chip con una menor resistencia es probable que tenga una fuga, y una capacidad mayor se considera inadecuado para su uso, ya que no pueden captar la dinámica de los más rápidos de la electrofisiología de la célula 6. Un chip con una capacidad menoro una mayor resistencia se considera enchufado, aunque podría ser simplemente que una burbuja queda atrapada en el orificio. Algunos chips se vuelven a prueba después de 1H y se encontró que la correcta impedancia electroquímica. </li><li> Enjuague bien el canal de fluidos con agua desionizada estéril, vaciar el frasco de la parte superior y enjuagar dos veces con la misma. </li><li> Sumergir el chip empaquetada con tubos en fresco agua desionizada estéril durante 30 minutos después cargar con otros chips en un recipiente estéril llena con agua desionizada estéril. Esto asegura que los chips de permanecer hidrófilo y protegido de la contaminación. </li></ul> 3. Chips de la preparación en el laboratorio de biología celular Los pasos siguientes se realizan en una campana de filtrado HEPA de flujo laminar utilizando técnicas asépticas, todas las soluciones que se utilizan en este procedimiento debe ser filtrada esterilizada antes de su uso mediante un filtro de 0.22μm. <ul type="disc"><li> Abrir un contenedor de astillas bajo una campana de filtrado HEPA de flujo laminar y retirar fichas de ContaINER boca abajo para evitar sacar posibles contaminantes flotantes en el vial de la parte superior. </li><li> Lavar la parte superior del frasco de 2x chip con recién filtrada agua desionizada estéril para eliminar los residuos de la superficie del chip. </li><li> Aspirar el agua desionizada estéril fuera del vial superior. </li><li> Conectar un extremo del tubo de Silastic unido al canal fluídico a una jeringa estéril a presión que contiene agua desionizada filtrada. En nuestro sistema, jeringas llenas de solución están presurizados por conexión a un tanque de aire comprimido a 20 psi establecido. Para asegurar la esterilidad, el aire es filtrado (0,22 micras filtro) antes de la entrada en la jeringa y nuestro sistema también tiene una válvula de encendido / apagado que nos permite detener o aplicar presión cuando sea necesario. </li><li> Utilizando una pinza hemostática, sujetar el extremo de salida de la tubería. </li><li> Abra el encendido / apagado para presurizar las válvulas de la solución. </li><li> Para enjuagar el fluídico subterranen del chip con fresca agua desionizada estéril, suelte el extremo de salida del tubo. </li><li> Para lace el agua hacia arriba a través de la abertura, sujetar el extremo de salida de la tubería con una pinza hemostática. </li><li> Para evitar el drenaje del agua, sujetar los extremos de entrada y salida de la tubería con una hemostatos y cerrar el encendido / apagado válvulas. </li><li> Separar el extremo de entrada del tubo de la jeringa. </li><li> Insertar los tapones de vidrio en ambos extremos de la tubería y eliminar las pinzas hemostáticas. </li><li> Llene la parte superior del vial con agua desionizada steriled filtro. </li><li> Colocar la tapa de un plato 35 mm estéril en la base de un plato 100 mm estéril </li><li> Colocar chip en la parte superior de la tapa 35 mm y cubierta con tapa 100 mm plato. </li><li> Chips de imagen para asegurar que la membrana y la abertura de los chips están libres de desechos y / o burbujas de aire. En nuestro laboratorio usamos un microscopio vertical y un largo 20x objetivo distancia de trabajo. </li><li> Si los desechos y / o burbujas de aire, lave varias veces de canal de fluidos y el vial superior. Si la suciedad y / o burbujas de aire no se puede quitar el chip se descarta. </li><li> Una vez que las virutas sonimágenes impresas, vuelva a la campana de flujo laminar y desenchufe los dos extremos de la tubería. </li><li> Una un extremo de la tubería a una jeringa a presión que contiene medios fisiológicos. </li><li> Fijar el extremo de salida de la tubería con una pinza hemostática </li><li> Abrir la válvula de presión, quitar el hemostato desde el extremo de salida de los fluidos y vaciar el canal fluídico con medios fisiológicos </li><li> Para enjuagar el fluídico subterráneo con medios fisiológicos, abrir el encendido / apagado válvulas y eliminar el hemostato desde el extremo de salida del tubo. </li><li> Para forzar los medios fisiológicos a través de la abertura, sujetar el extremo de salida de la tubería con una pinza hemostática. </li><li> Sujetar extremo de entrada del tubo con una pinza hemostática y cerrar el encendido / apagado válvulas. </li><li> Eliminar el extremo de entrada del tubo de la jeringa y el tapón ambos extremos de la tubería con tapones Glas. </li><li> Retire las pinzas hemostáticas. </li><li> Eliminar el agua del vial superior. </li><li> Llenar el vial con la parte superior del filtro esterilizado medios fisiológicos. </li><li>Vuelva a colocar el chip en la placa de Petri de 100 mm. </li><li> Coloque la base de un plato de 35 mm en el plato de 100 mm y llenarlo con filtro de agua desionizada esterilizada para enriquecer la humedad. </li><li> Cubra el plato hasta que sea tiempo para el revestimiento </li></ul> 4. Célula de recubrimiento de las neuronas de caracol Los chips de patch-clamp puede ser adecuado para una variedad de preparaciones. Actualmente estamos probando nuestras fichas con los mamíferos las neuronas corticales primarias y han obtenido resultados preliminares con células cultivadas durante 14 días 7, lo que indica que nuestro protocolo de esterilización es suficiente y que los chips no son citotóxicos en cultivos a largo plazo. A los efectos de este protocolo, las neuronas de los caracoles fueron escogidos porque representan un modelo simple, pero bien establecido para el estudio de electrofisiología neuronal 11, y es con las células que se han obtenido los resultados más significativos hasta la fecha 10. Aislamiento de células detallada y los procedimientos de la cultura tienenhan descrito anteriormente 12, 13. <ul type="disc"><li> Quite la cubierta exterior 2 a 3 meses de edad stagnalis Lymnaea con unas pinzas romas y los animales anestesiar en Lymnaea salina que contiene 10% de Listerine. Todas las etapas subsiguientes a cabo asépticamente dentro de una campana de flujo laminar con equipo esterilizado disección y soluciones a temperatura ambiente. </li><li> Vuelva a colocar los medios fisiológicos en los fluidos con la solución de grabación de su caso, utilizando una pipeta de Eppendorf. En el caso de las neuronas Lymnaea la solución contiene (en mM): KCl 50, 5 MgCl 2, 5 etilenbis (oxietilenonitrilo) tetraacético (EGTA) y 4 5 - (2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES, pH 7,4 , 130 mOsm) 14 </li><li> Pin los caracoles en un plato lleno de Sylgard Lymnaea salina y eliminar todo el cerebro como se ha descrito previamente 13 </li><li> Tratar el aised cerebros en medios definidos (DM) con tripsina (0,2% de solución, Sigma, Catálogo # T-9201) durante 18 minutos, seguido por tratamiento en DM y el inhibidor de tripsina (Sigma, soja, Catálogo # T-9003) durante 15 minutos. </li><li> Pin el cerebro en un plato pequeño lleno de Sylgard alta osmolaridad define los medios de comunicación (HODM - DM con glucosa añadida, 750 mL de solución de glucosa 1M a 20 ml DM). </li><li> Con unas pinzas finas y tijeras de disección, retirar la cubierta exterior y la interior de los ganglios de interés, la exposición de las neuronas. </li><li> Utilizando una pipeta fuego vidrio pulido llena HODM y unido a una microjeringa, aplicar succión suave cerca de la célula de interés (Izquierda dorsal del pedal 1) hasta que la neurona se separa del cerebro y se suspende en la pipeta. </li><li> La pipeta de vidrio se mueve entonces y se sumerge en neurochips individuales cuando la expulsión suave desde la microjeringa permite que las neuronas que se empuja suavemente hacia fuera de la pipeta y se coloca en la parte superior de los agujeros de parches individuales sobre los chips.</li><li> Permitir que las células de sentarse en reposo durante un mínimo de 2 horas a temperatura ambiente para promover su adhesión a la superficie del chip que rodea la abertura. </li></ul> 5. Registros electrofisiológicos Para conectar las fichas para el amplificador (en nuestro caso un amplificador MultiClamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, EE.UU.) <ul type="disc"><li> Sustituir la solución en el fluídico subterráneo y en el vial chip con las soluciones de grabación apropiados. En el caso de las neuronas Lymnaea, las cámaras de cultivo superiores están llenos de Lymnaea salina (en mM: NaCl 51,3, 1,7 KCl, 4 CaCl2, y MgCl2 1,5) tamponada a pH 7,9 con HEPES 14. </li><li> Para mayor estabilidad, pegamento el chip en un portaobjetos de vidrio y colocar bajo el microscopio. </li><li> Para conectar el chip al amplificador (en nuestro caso un amplificador MultiClamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, EE.UU.), cortar un extremo del tubo e insertar un Silvealambre R que está conectada a la cabeza-etapa. </li><li> Colocar el electrodo de referencia en el vial superior del chip. </li><li> El chip está ahora listo para la grabación. </li><li> Aplicar un paso mV 5 con el amplificador para medir la resistencia total (R t) y determinar la configuración de las neuronas: células adjunta (R t&gt; 1 GΩ); de células enteras (Rt = 50-100 transitorios mW más capacitiva, indicativa de la ruptura de la membrana sobre la abertura), o sin sello (R t &lt;5 MW). En nuestra última serie de experimentos 10, 58% por ciento de las células tenían los sellos de alta resistencia y, de ellos, el 80% de las células excitables mostraron respuestas. </li></ul> 6. Los resultados representativos <ul type="disc"><li> Aplicar despolarizante pulsos de corriente (20 incremento pA) a la neurona (en este caso LPeD1). </li><li> Mantenga la neurona al cierre de Vm a su potencial de reposo (~ - 60 mV). </li><li> Tenga en cuenta las respuestas a estos pulsos despolarizantes. Los potenciales de acción debe rebasamientose observa si la neurona es viable. </li><li> La Figura 4 muestra un resultado representativo que se discute en detalle en 14, 15. </li></ul><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Las respuestas de tensión (superior) de una neurona a LPeD1 serie graduada de intracelular pulsos de corriente (abajo). Los pulsos de corriente se aplicaron a Vm = - 60mV. Solución de problemas <ul type="disc"><li> Antes de placas, chips de imagen para determinar si la membrana y la apertura son libres de desechos y adecuado para el revestimiento. Nosotros usamos un microscopio vertical y una larga 20x objetivo de distancia de trabajo. En nuestra última serie de experimentos 1, 67% por ciento de los chips se cebaron con éxito de esta manera. </li><li> Si los desechos y / o burbujas de aire están presentes descartan chip y probar con la otra. </li><li> Diversos tratamientos de superficie (plasma) o recubrimientos (PDL, PEI, etc) puede ser juzgado, pero el éxito puede ser altamente dependiente del tipo celularutilizada. </li><li> La composición de la fluídica ("pipeta") en solución crítica para la formación de la giga-sello y toda la celda. Ajustar la solución, prestando especial atención a la osmolaridad, pH, y el maquillaje iónico. </li><li> Para el cultivo de más largo plazo, empezar con los medios de comunicación en el canal de microfluidos, luego cambiar a la pipeta solución antes de la grabación a través de la gravedad de perfusión suave alimentado (~ 0,5 ml / min). </li></ul>

<ol><li>Walz, W. Patch-Clamp Analysis: Advanced Techniques. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalz%2C+W+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. , 2nd, Springer Protocols. 38(2007).</li>
<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibers.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Behrends, J. C., Fertig, N. Ch. 14: Planar Patch-clamp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehrends%2C+JC+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. , 2nd, (2007).</li>
<li>Fertig, N., Tilke, A., Blick, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+integration+of+isolated+cell+membrane+patches+in+a+nanomachined+aperture%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Stable integration of isolated cell membrane patches in a nanomachined aperture.</a> Applied Physics Letters. 77, 1218-1220 (2000).</li>
<li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+electrophysiology%3A+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+hysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and hysiology.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 7 (4), 358-368 (2008).</li>
<li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+silicon+patch-clamp+chip+permits+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+functionally+defined+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A novel silicon patch-clamp chip permits high-fidelity recording of ion channel activity from functionally defined neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), 593-600 (2010).</li>
<li>Martinez, D., Martina, M., Kremer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+patch-clamp+chips+for+mammalian+cell+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+and+Nanosystems%22%5BJournal%5D)">Development of patch-clamp chips for mammalian cell applications.</a> Micro and Nanosystems. 2 (4), (2010).</li>
<li>National Research Centre of Canada . , Candian Photonics Fabrication Centre. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/solutions/facilities/prototyping_index.html">http://www.nrc-cnrc.gc.ca/eng/solutions/facilities/prototyping_index.html</a> (c1995-2001).</li>
<li>Py, C., Salim, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+to+aperture+interaction+in+patch-clamp+chips+visualized+by+fluorescence+microscopy+and+focused-ion+beam+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Cell to aperture interaction in patch-clamp chips visualized by fluorescence microscopy and focused-ion beam sections.</a> Biotechnology & Bioengineering. 108, 1395-1403 (2011).</li>
<li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002(2011).</li>
<li>Bell, H. J., Syed, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+modulation+of+the+respiratory+CPG%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+bioscience+%3A+a+journal+and+virtual+library%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced modulation of the respiratory CPG.</a> Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 14, 3825-3835 (2009).</li>
<li>Syed, N. I., Bulloch, A. G. M., Lukowiak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstruction+of+the+respiratory+central+pattern+generator+of+the+mollusk+Lymnaea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstruction of the respiratory central pattern generator of the mollusk Lymnaea.</a> Science. 250, 282-285 (1990).</li>
<li>Syed, N. I., Zaidi, H., Lovell, P. In vitro reconstruction of neuronal circuits: A simple model system approach. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSyed%2C+NI+%22Modern+techniques+in+neuroscience+research%22">Modern techniques in neuroscience research</a>. Windhorst, U., Johansson, H. , Springer. (1999).</li>
<li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002(2011).</li>
<li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+patch-clamp+chip+suitable+for+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Silicon patch-clamp chip suitable for high-fidelity recording of ion channel activity from cultured neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), (2010).</li>
<li>Ong, W. -L., Yobas, L., Ong, W. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+missing+factor+in+chip-based+patch+clamp+assay%3A+gigaseal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Conference+Series%22%5BJournal%5D)">A missing factor in chip-based patch clamp assay: gigaseal.</a> Journal of Physics: Conference Series. 34, 187(2006).</li>
<li>Charrier, A., Martinez, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+placement+and+guidance+on+substrates+for+neurochip+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Cell placement and guidance on substrates for neurochip interfaces.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 368-373 (2010).</li>
<li>Diaz-Quijada, D., Maynard, C. C. omas, Monette, T., Py, R., A, C. K. rantis, Mealing, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Patterning+with+Chemisorbed+Chemical+Cues+for+Advancing+Neurochip+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+%26+Engineering+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Surface Patterning with Chemisorbed Chemical Cues for Advancing Neurochip Applications.</a> Industrial & Engineering Chemistry Research. 50 (17), 10029-10035 (2011).</li>
<li>Martinez, D., Py, C., Denhoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+patch-clamp+recordings+from+neurons+cultured+on+a+polymer+microchip%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">High-fidelity patch-clamp recordings from neurons cultured on a polymer microchip.</a> Biomedical Microdevices. 12, 977-97 (2010).</li>
<li>Taketani, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaketani%2C+M+%22Advances+in+Network+Electrophysiology%3A+Using+Multi-Electrode+Arrays%22">Advances in Network Electrophysiology: Using Multi-Electrode Arrays</a>. , Springer. (2006).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Patch-clamp NRCC la plataforma de la interrogación chip es una herramienta potencialmente poderosa para la alta ensayos de contenido de información farmacéutica y para investigar en modelos in vitro de la enfermedad. Sus ventajas en comparación con pipetas de vidrio son una resistencia acceso bajo, lo cual es una ventaja para sondear células grandes, ya pesar de una capacitancia algo mayor resultará en la dinámica comparables para células más pequeñas. Celular espontánea a los sellos de apertura se han obtenido rutinariamente, y la entrada de células enteras se ha observado que 14 espontánea. Una diferencia clara entre los chips y el método de pipeta de vidrio es el hecho de que la sonda es parte de la placa de cultivo de células y no es manualmente pone en contacto con la membrana celular. El cultivo de células, posiblemente parte de las redes funcionales, los resultados de los modelos más relevantes biológicamente como modelos de enfermedades, y un mecanismo diferente para asegurar la celda de alta para probar los sellos 16. Sin embargo, en contraste con las suspensiones de células, la aspiración Cannot se utiliza para posicionar una celda de la sonda. Neuronas del caracol, como otras células grandes, son susceptibles de posicionamiento manual en la parte superior de la sonda. Para células más pequeñas que requieren largos tiempos de cultivo, hemos obviado la necesidad de cualquier manipulación y mantener una alta probabilidad de obtener un sello por polipéptidos de adhesión de modelado en la parte superior de las sondas para colocar las células en la parte superior de las sondas, y demostró la colocación de las células en el sonda de 17,18. NRCC también está desarrollando una poliimida microfluidos parche-abrazadera chip de 19 con una capacitancia comparable a la del vidrio pipeta. El objetivo final de que es un proyecto múltiples sondas-parche-abrazadera chip que permite el control simultáneo de la actividad electrofisiológica de las neuronas que participan en varias comportamiento de la red en la resolución de los canales iónicos individuales 14. Este método es un método de alta resolución complementaria a las matrices de electrodos múltiples 20.

el cultivo y la electrofisiología de las células en nrcc de patch-clamp chips

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Debido a su exquisita sensibilidad y la capacidad de monitorear y controlar las células individuales en el nivel de los canales iónicos, de patch-clamp es el estándar de oro de la electrofisiología se aplica a modelos de enfermedad y las pantallas de farmacéuticos por igual 1. El método implica tradicionalmente suavemente en contacto una célula con una pipeta de vidrio lleno de una solución fisiológica con el fin de aislar un parche de la membrana bajo su vértice 2. Un electrodo insertado en la pipeta captura de iones canal actividad dentro del parche o membrana, cuando se rompió, por toda la celda. En la última década, patch-clamp virutas se han propuesto como una alternativa 3, 4: una película suspendido separa el medio fisiológico del medio de cultivo, y una abertura en la película microfabricated reemplaza el ápice de la pipeta. Patch-clamp fichas se han integrado en los sistemas automatizados y comercializado para el cribado de alto rendimiento 5. Para incrfacilitar el rendimiento, que incluyen la entrega de fluidos de las células de la suspensión, su posicionamiento en la apertura por medio de succión, y las rutinas automatizadas para la detección de la célula a la sonda juntas y entrar en el modo de célula entera. Nos han informado sobre la fabricación de silicio de un chip de patch-clamp con una impedancia optimizada y forma del orificio que permite la grabación de alta calidad de los potenciales de acción en las neuronas cultivadas de 6 caracoles, recientemente, también han informado de los progresos hacia el interrogatorio neuronas de mamíferos 7. Nuestros patch-clamp chips son fabricados en el Centro Canadiense de Fabricación Fotónica 8, un comercial de la fundición, y están disponibles en grandes series. Estamos ansiosos de participar en la colaboración con los electrofisiólogos para validar el uso de la tecnología NRCC en diferentes modelos. Los chips se utilizan de acuerdo con el esquema general representada en la figura 1: el chip de silicio está en el fondo de un frasco de cultivo de plexiglás y la parte posterior de la abertura está conectado a un subterráneo ChannEl provista de tubos en cada extremo del paquete. Las células se cultivaron en el vial y la célula en la parte superior de la sonda se controla mediante un electrodo de medición insertado en el channel.The dos fuera de los puertos fluídicos facilitar el intercambio de solución con una perturbación mínima a la celda, lo cual es una ventaja en comparación con pipetas de vidrio para intracelular perfusión. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Principio de medición usando el NRCC parche-abrazadera de chip Detallamos aquí los protocolos de esterilización y preparar las patatas fritas, cargarlos con el medio, a la placa con las células y, finalmente, los utilizan para registros electrofisiológicos.

Mostramos cómo plana patch-clamp fichas fabricadas en el Consejo de Investigación Nacional de Canadá se esterilizan, preparado, cargado con el medio, recubierto de células, y se utiliza para los registros electrofisiológicos.

El cultivo y la electrofisiología de las células en NRCC de patch-clamp chips

Debido a su exquisita sensibilidad y a la capacidad de monitorizar y controlar células individuales al nivel de los canales iónicos, el patch-clamp es el estándar de oro...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en registrar la actividad electrofisiológica de células cultivadas mediante un chip de registro de parche plano. Esto se logra esterilizando, acondicionando y probando los chips de registro de parche para permitir el crecimiento del cultivo celular y el posterior monitoreo de su actividad electrofisiológica. Después de las pruebas, los chips pueden almacenarse hasta que se vuelvan a acondicionar en un laboratorio de biología celular.Como siguiente paso, se extraen neuronas de las extremidades, se colocan en cultivo y se siembran sobre los chips. Finalmente, los chips se conectan a un amplificador de registro por parche para monitorear la actividad electrofisiológica de las células. La principal ventaja de esta tecnología frente a los chips de registro por parche planares existentes es que es adecuada para su uso con neuronas en cultivo establecido, lo que permite investigar neuronas que se comunican sinápticamente y se comunican entre sí.Este método y el enfoque permitirán una mejor comprensión de las funciones de los canales iónicos en células excitables integradas dentro de una red neuronal, tanto en condiciones normales como patológicas. Las implicaciones de este método se extienden a la farmacología, donde puede utilizarse para realizar cribados de fármacos con contenido de información alto y throughput medio, dirigidos a canales iónicos y proteínas receptoras. Hemos optado por demostrar este método utilizando neuronas de caracol, ya que estas neuronas pueden colocarse y cultivarse fácilmente.Y debido a que estas neuronas volverán a formar redes en cultivo, constituyen un excelente modelo para estudiar la transformación. Más importante aún, estas placas también pueden utilizarse en otros sistemas celulares, como células cardíacas y células cancerosas. El principal desafío al usar placas de registro de parche plano es obtener placas con aberturas limpias, así como sembrar y cultivar las células adecuadamente.Los chips desconectados serían contraproducentes, por lo tanto todos los chips se prueban antes de ser utilizados. El punto más crítico de la evaluación electrofisiológica se presenta una vez que las células han sido cultivadas. Consiste en la formación del sello gigaseal entre la membrana celular y el borde superior del chip económico.Todos los chips de parche plano para registro por electrodo de micropipeta se fabricaron con células aisladas en suspensión y dependen de la succión para atraer las células hacia la abertura y formar un sello gigaohm. La formación del sello gigaohm. El uso de nuestros chips ocurre de forma espontánea.Aunque los cultivos de neuronas no requieren succión, demostraré el paso de esterilización y selección del chip. Tanya explicará la carga en un laboratorio de biología celular, Colin ilustrará la preparación y siembra de células. Finalmente, Marcia mostrará cómo se realizan nuestras grabaciones. Para comenzar este procedimiento, esterilice los chips en un limpiador de plasma heric basic con una presión residual de aire de 0,1 a 0,3 milibares durante 15 minutos a la potencia máxima de 18 vatios.El tratamiento con plasma también hace que el chip sea hidrofílico, lo que facilita el cebado. A continuación, coloque tubos de vidrio con un tubo de silicona estéril elástico para laboratorio, de tres pulgadas en un extremo y una pulgada en el otro extremo. Luego, llene los tubos con solución estéril estándar de tampón fosfato, asegurándose de que no quede ninguna burbuja atrapada.Pinche el tubo de silicona largo mientras presuriza el PBS desde el extremo corto a una atmósfera. Luego libere la presión en el canal fluidico. Después de eso, llene el vial con PBS utilizando una jeringa.Sumerja un electrodo de plata, cloruro de plata en el vial y un electrodo auxiliar en el tubo corto. Utilice un medidor de impedancia para confirmar que la resistencia de acceso esté entre 300 kiloohmios y tres megaohmios, y que la capacitancia en derivación esté entre 10 picofaradios y 25 picofaradios. A continuación, enjuague el canal fluidico con agua desionizada estéril.Vacíe el vial superior y repita el proceso de enjuague dos veces. Posteriormente, sumerja el paquete del chip con los tubos en agua desionizada estéril fresca durante 30 minutos. Luego cargue otros chips en un recipiente estéril lleno con agua desionizada estéril.Esto asegura que los chips permanezcan hidrofílicos y protegidos contra contaminación. Abra un contenedor de chips bajo una campana de flujo laminar con filtro HEPA y retire los chips con el vial superior orientado hacia abajo para evitar la contaminación por residuos de empaque que flotan sobre la superficie del agua. Para eliminar cualquier residuo restante de la superficie del chip, enjuague el vial superior dos veces con agua desionizada estéril filtrada. Conecte un extremo del tubo elástico unido al canal fluidico a una jeringa presurizada que contenga agua desionizada estéril filtrada.En este sistema, el agua en la jeringa se presuriza mediante un tanque de aire comprimido ajustado a una atmósfera para garantizar que el aire estéril se filtre antes de entrar en la jeringa. Este sistema también está equipado con dos válvulas de encendido y apagado que permiten controlar la presión cuando sea necesario. Sujete el extremo de salida de la fluidica con un hemostato.A continuación, abra la válvula del tanque de aire comprimido para presurizar la solución. Luego, abra el hemostato en el extremo de salida de la fluidica para enjuagar el chip con agua desionizada estéril fresca. Sujete el extremo de salida de la fluidica con un hemostato para forzar el paso del agua a través de la abertura.Para evitar el drenaje de agua, sujete la entrada de la fluídica con el hemostato y cierre las válvulas de encendido-apagado. A continuación, desacople el extremo de entrada del tubo de la jeringa. Tape ambos extremos del tubo y retire los hemostatos.Llene el vial superior con agua desionizada estéril filtrada. A continuación, coloque la tapa de un recipiente estéril de 35 milímetros sobre la base de un recipiente estéril de 100 milímetros. Posteriormente, coloque un chip encima de la tapa de 35 milímetros y cúbralo con la tapa de un recipiente de 100 milímetros.Para asegurarse de que la membrana y la abertura de los chips estén libres de residuos o burbujas de aire, se realizan imágenes de los chips. Si hay residuos o burbujas de aire, se lavan repetidamente el canal fluidico y el vial superior con agua estéril.Si no es posible eliminar los residuos o las burbujas de aire, se descarta el chip. Una vez que se han obtenido las imágenes de los chips, regrese estos al flujo laminar. Desconecte ambos extremos del tubo. Conecte un extremo del tubo a una jeringa presurizada que contenga medio fisiológico y sujete el extremo de salida del tubo con el hemostato para enjuagar el sistema subterráneo de fluidos con medio fisiológico. Abra las válvulas de encendido/apagado y retire el hemostato del extremo de salida del tubo para forzar al medio fisiológico a ascender a través de la abertura; sujete nuevamente el extremo de salida del tubo con el hemostato, luego el extremo de entrada del tubo con el hemostato y cierre las válvulas de encendido/apagado. A continuación, retire el extremo de entrada del tubo de la jeringa y tape ambos extremos del tubo con tapones de vidrio.Luego retire los hemostatos. Posteriormente, retire el agua del frasco superior. Llene el frasco superior con medio estéril filtrado.Coloque el chip nuevamente en la placa de 100 milímetros. A continuación, coloque la base de la placa de 35 milímetros dentro de la placa de 100 milímetros y llénela con agua desionizada estéril filtrada para aumentar la humedad. Luego tape la placa hasta el momento del siembra.Para comenzar este procedimiento, retire la concha externa de li sags de dos a tres meses de edad con un par de pinzas romas. Luego anestesie los animales en solución salina limba que contenga 10% de Listerine en una cabina de flujo laminar. Fije los caracoles en un recipiente tipo cell guard lleno con solución salina limba y extraiga el cerebro completo.A continuación, trate los cerebros aislados en medio definido con enzima tripsina durante 18 minutos. Después, trátelos en medio definido y con inhibidor de tripsina. Durante 15 minutos, sujete los cerebros a un pequeño platillo con rejilla celular lleno de medio definido de alta osmolaridad utilizando un par de pinzas finas y un par de tijeras de disección.Retire la vaina externa e interna de los ganglios de interés y exponga las neuronas. A continuación, sujete una pipeta de vidrio pulida al fuego, llena con un medio definido de alta osmolaridad, a una microsseringa e induzca suavemente succión cerca de la célula de interés hasta que la neurona se desprenda del cerebro y quede suspendida en la pipeta. Después de cambiar el medio en el sistema de fluidos del chip neuronal por una solución adecuada para el registro, introduzca la punta de la pipeta de vidrio en un vial de cultivo y coloque suavemente la neurona sobre la abertura del chip.Deje las células en reposo sin perturbar durante un mínimo de dos horas a temperatura ambiente para favorecer su adhesión a la superficie del chip alrededor de la abertura. Reemplace la solución en la placa de cultivo con la solución de registro adecuada para obtener estabilidad. Pegue el chip sobre un portaobjetos de vidrio y colóquelo bajo un microscopio para conectar los chips al amplificador.Corte el extremo largo del tubo e inserte el alambre plateado conectado al cabezal. A continuación, coloque el electrodo de referencia en el recipiente de cultivo del chip. El chip ya está listo para la grabación.Aquí se muestra un ejemplo de las respuestas de voltaje de una neurona dorsal del pedal izquierdo a series graduadas de pulsos de corriente intracelular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo registrar la actividad electrofisiológica de células cultivadas con un chip de parche plano. Recuerde que en el primer paso seleccionamos chips para asegurarnos de que los no utilizados para sembrar células tengan tapado el orificio; los usuarios de Ture Biology comienzan desde el paso de carga y generalmente aún encuentran algunos chips bloqueados por cada lote.Este nuevo método representa un avance importante en el desarrollo de una tecnología económica que permite el análisis de redes neuronales in vitro con un nivel de resolución sin precedentes. Esta tecnología puede conducir a ensayos avanzados para la identificación de dianas terapéuticas, el desarrollo de fármacos y la evaluación diagnóstica. El desarrollo adicional de esta tecnología proporcionará nuevos medios para que los investigadores en salud exploren terapias novedosas para enfermedades o trastornos neurológicos.Su potencial se extiende a células cardíacas, cáncer y otras células que tienen propiedades electrogenas.

culturing-and-electrophysiology-of-cells-on-nrcc-patch-clamp-chips

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Vamos a demostrar la forma de estudiar el efecto de un único punto de mutación en la función de un canal iónico.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

Este protocolo describe una técnica llamada electrofisiología de pinza de parche de célula completa, que es un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas de Mauthner y otras células reticuloespinales en embriones de pez cebra.

Electrofisiología de pinza de parche de célula completa: un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas

En este video, los cultivos de células embrionarias de riñón que expresan proteínas de canal iónico dependientes de la luz fusionadas con un reportero fluorescente demuestran el efecto de la luz en el movimiento de los iones. La pinza de parche de celda completa se utiliza para monitorear el movimiento de iones.

Registro de electrofisiología optogenética de células con canales iónicos dependientes de la luz

Se describe la disección del sistema nervioso de la liebre de mar...

El aislamiento de las neuronas sensoriales de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Se Patch clamp grabaciones de Corrientes glutamatérgicos

Las neuronas sensoriales aferentes envían información sensorial desde la periferia al sistema nervioso central. La identificación de neuronas aferentes específicas ayudará a comprender su fisiología. Describimos un método de marcaje retrógrado para identificar neuronas aferentes y estudiamos los canales iónicos dependientes de voltaje en estas neuronas utilizando electrofisiología e inmunocitoquímica de patch clamp.

Identificación de poblaciones específicas de neuronas sensoriales para el estudio de los canales iónicos expresados

Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Los protocolos de bucle cerrado están cada vez más extendidos en la electrofisiología moderna. Presentamos una forma sencilla, versátil y económica de realizar protocolos electrofisiológicos complejos en neuronas piramidales corticales in vitro, utilizando un ordenador de sobremesa y una placa de adquisición digital.

En tiempo real Electrofisiología: Usando protocolos de bucle cerrado para sondear neuronales Dinámica y allá

Se describe un método para la estimulación de la actividad eléctrica de cultivos celulares in vitro con luz visible, basado en el uso de polímeros semiconductores orgánicos.

Control óptico de células vivas Actividad Eléctrica por conjugadas Polímeros

Este artículo describe cómo se determina la selectividad iónica de la canalrodopsina con registros electrofisiológicos de patch-clamp de células completas utilizando células HEK293. Aquí, se demuestra el procedimiento experimental para investigar la selectividad del cloruro de una canalrodopsina selectiva de aniones. Sin embargo, el procedimiento es transferible a otras rodopsinas de clara selectividad.

Grabaciones con abrazadera de parche de células enteras para la determinación electrofisiológica de la selectividad iónica en canalrhodopsins

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) se han convertido en un modelo in vitro prometedor para la detección de cardiotoxicidad inducida por fármacos y el modelado de enfermedades. Aquí, detallamos un protocolo para medir la contractilidad y electrofisiología de hiPSC-CMs.

Aplicaciones técnicas de la matriz de microelectrodos y los registros de pinza de parche en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos

Aprenda a registrar la actividad electrofisiológica de neuronas cultivadas utilizando chips de patch-clamp planar. Este método permite estudiar funciones de canales iónicos y realizar cribados de fármacos con alta resolución.

El cultivo y la electrofisiología de las células en NRCC de patch-clamp chips

Explorar más videos