Name: Genoma toda la pantalla de los genes miARN objetivos mediante el objetivo de la misión Carnet de identificación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprende a realizar un cribado genómico de alta producción para identificar objetivos de microARN utilizando la biblioteca Target ID. Este método permite establecer líneas celulares estables y analizar secuencias mediante PCR y secuenciación profunda.

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Damos las gracias a toda la vida Sigma Misiones Científicas de la ID de destino Biblioteca equipo de desarrollo, especialmente Kevin Gutshall para encontrar la tecnología y la negociación de los términos de licencia, y Holemon Heather por su apoyo y participación en los debates fructíferos de solución de problemas. También agradecemos al Dr. Joop Gäken del King College de Londres por haber compartido los resultados no publicados y sugerencias, y Qazi Hamid de RxBiosciences para la preparación de un lote grande de cDNA y su persistencia en conseguir que clonado. Nos gustaría agradecer Nan Lin y Bahr Scott de SAFC para la realización de las matrices de cDNA y análisis de datos. MISIÓN es una marca registrada de Sigma-Aldrich Biotecnología LP

<ol><li>Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.sigma-aldrich.com">http://www.sigma-aldrich.com</a> (2012).</li>
<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li>
<li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li>
<li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li>
<li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+microRNAs%3A+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li>
<li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperately+seeking+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li>
<li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li>
<li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li>
<li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li>
<li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-221+and+miR-222%2C+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas%2C+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li>
<li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+noncoding+RNA%2C+miR-126%2C+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chrom.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li>
<li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li>
<li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.</li>
<li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620(2009).</li>
<li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8%2F200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li>
<li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP%5BTitle%5D)+AND+%22L.+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li>
<li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran las relaciones financieras con entidades comerciales que tienen un interés en los trabajos presentados.

microRNAs son 20-24 ARN de nucleótidos que regulan la expresión de genes post-transcripcional por la inhibición de la traducción del ARNm, y con frecuencia, la desestabilización del ARNm diana (revisado en [6]). Una sola miARN puede regular varios cientos de ARNm para controlar la respuesta de una célula a las señales de desarrollo y medio ambiente. La identificación y validación de mRNAs objetivo es fundamental para determinar el papel de un miRNA y la función de estas vías. Sin embargo, la identificación de objetivos no es fácil porque, en los animales, los miRNAs y sus sitios de destino no son totalmente complementarias. La &quot;semilla&quot; región, basa 2 a 7 desde el extremo 5 &#39;del miARN, es generalmente complementaria de sus objetivos. Sin embargo, hay muchas excepciones a la regla de la semilla, y aguas abajo de apareamiento de bases puede compensar un partido de la semilla imperfecta. Una serie de algoritmos computacionales se han desarrollado para predecir los genes miARN objetivos basados ​​en la correspondencia de la semilla y la compensación aguas abajo, una estructura de destinoposición D, la secuencia de conservación, y varios otros parámetros que se hayan observado en los objetivos validados experimentalmente (revisado en [7]). Si bien las predicciones in silico son convenientes y hacer válidos los objetivos de identificar muchos genes miARN, la mayoría de los genes no predijo las pruebas experimentales de validación, y muchos objetivos reales no se predijo. Por otra parte, ya que los algoritmos informáticos se basan en las características de destino previamente determinados, que no permiten el descubrimiento de los objetivos que se apartan de lo ya conocido. Un número de sistemas experimentales se han utilizado con éxito para identificar o descubrir los objetivos funcionales miARN en células vivas. Estos métodos de detección globales incluyen microarrays y la secuenciación del ARN, el ARN co-inmunoprecipitación (RIP), y el etiquetado de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular (SILAC), un método de proteómica (revisado en [7]). Cada método tiene ventajas y desventajas. Desde miARN objetivo suele desestabilizar un ARNm y conduce a su degradación, pérdida oel aumento de r en el nivel del mRNA después de la introducción de un miARN imitar o inhibidor, respectivamente, pueden identificar los genes miARN objetivos. Esta pérdida o ganancia de ARNm es fácilmente detectada por microarrays o la secuenciación de profundidad. Mientras que los métodos de detección de mRNA son más simples y más sensibles que los métodos de detección de proteínas, la detección de mRNA se falte a ninguna de los genes miARN objetivos que no se degradan. Los últimos informes del laboratorio comparando los resultados Bartell miARN objetivo de la detección de RNA con los de SILAC [8] o el perfil del ribosoma [9] indican que los miRNAs mamíferos principalmente actúa reduciendo los niveles de mRNA diana. Sin embargo, muchos otros laboratorios que trabajan con los genes miARN objetivos individuales se han detectado cambios en proteínas, pero ningún cambio en el nivel del mRNA. Los informes de lo que parece ser la regulación de traducción sin pérdida de ARNm detectable incluyen: miR-10b en la HOXD10 [10], en miR221/222 p27kip1 [11], miR-21 en Pdcd4 [12], miR-126 en p85β [13] , miR-34 en la SIRT1 [14], miR-21 en el PTEN [15], el miR-302d en Arid4b [16], el miR-200c en JAG1 [17], y miR-299, 297, 567, unº 609 de VEGF [18]. Por otra parte, Clancy et al [19] informó recientemente que la regulación de traducción por let-7 fue detectado sólo cuando las isoformas individuales de ARNm que contienen el sitio de destino vamos-7 se detectaron de forma selectiva. Lo anterior sugiere que, al menos en algunos casos, la regulación de traducción puede ser pasado por alto en un perfil compuesto - es decir, cuando todas las isoformas de mRNA se detectan como un ARNm - tal como se obtiene con microarrays muchos y los análisis de secuencias. Co-inmunoprecipitación de los complejos de mRNA de los genes miARN-a través de Argonauta (por lo general ago2) u otra proteína asociada (ARN inmunoprecipitación, o RIP) va a aislar los genes miARN objetivos con independencia del mecanismo de regulación. Además, PIR detecta endógeno, y, presumiblemente, biológicamente relevante, las interacciones. Sin embargo, no se sabe si todas las interacciones de mRNA miARN-son funcionales, y el PIR se pierda ninguna mRNA objetivos que se asocian sólo transitoriamente o se degradan rápidamente. Además, específicas de ARNm miRNA-socios debe inferirse bioinformaticamente, porque todos los pares de ARNm de miRNA-co-precipitado juntos. Finalmente, SILAC directamente identifica el producto final de la regulación miARN, la propia proteína, pero es insensible y por lo tanto se pierde proteínas raras y pequeños cambios en los niveles de proteína de plegado. A la luz de las limitaciones con los métodos actuales de identificación de los genes miARN objetivo, nos sentimos un ensayo adicional global para identificar los objetivos funcionales miARN por un mecanismo alternativo que se necesitaba. Para cumplir con esta necesidad, la licencia de una tecnología inventada por Joop Gaken y Azim Mohamedali del King College de Londres. Su invención es una proteína de fusión de selección doble, en concreto, una timidina quinasa zeocin fusión, regulado por una biblioteca de cDNA de las posibles secuencias de miRNA en su objetivo 3&#39;UTR. Las células transfectadas de manera estable y expresar TKzeo-cDNA construcciones se pueden seleccionar con zeocin, como se ilustra en la figura 2. Después de expresar un miARN de interés, los objetivos que Mirna se puede seleccionar wiª ganciclovir, como se ilustra en la figura 3. Ganciclovir mata las células que expresan la timidina quinasa, es decir, cualquier célula que expresa TKzeo-cDNA carece de un objetivo para el miARN de interés. Dirigida ADNc se puede aislar mediante amplificación por PCR del ADN de las células que sobreviven ganciclovir cebadores que flanquean utilizando los productos de cDNA, y la PCR puede ser secuenciado para identificar dianas. Hemos desarrollado la tecnología del King &#39;s College en una nueva herramienta para la identificación global y el descubrimiento de los genes miARN objetivos funcionales humanos - el objetivo de la misión Carnet de identificación. Con la Biblioteca ID de destino, los usuarios pueden aislar los genes miARN objetivos por una serie de transfección de mamífero cultivo de células y los pasos de drogas de selección. La Biblioteca es amplio, y contiene 66-79% de los genes humanos. Los resultados iniciales indican que tanto descubierto anteriormente, así como nuevos objetivos pueden ser aislados de la biblioteca MISIÓN ID de destino. Aunque el protocolo es de cierta extensión,el uso de la Biblioteca de ID de destino requiere de técnicas estándar de laboratorio moleculares, cultivo de células mamíferas, la transfección, selección de medicamentos, PCR y secuenciación - y por lo tanto, debe estar bien al alcance de la mayoría de los biólogos. Se sugiere que se preste suficiente atención a un diseño experimental adecuado, optimizando las condiciones de cultivo, y lo más importante, antes de la prueba de cada nuevo tipo de células para determinar los niveles óptimos de drogas para los pasos de selección (kill-curvas) para asegurar el éxito con el Carnet de identificación de destino. Al igual que con todos los métodos de identificación de genes miARN objetivo, se recomienda que los objetivos identificados por cribado de la Biblioteca de ID de destino debe ser validado con un segundo método, tales como microarrays, QRT-PCR, reportero de ensayo (es decir, la luciferasa), o el análisis occidental.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> JumpStart RedTaq Readymix </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> El ganciclovir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> GenElute mamíferos ADN genómico Miniprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> Celular k nucleofection específicolo </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> ID de destino Biblioteca </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

genoma toda la pantalla de los genes miarn objetivos mediante el objetivo de la misión carnet de identificación

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

La Biblioteca de ID de destino está diseñado para ayudar en los objetivos de descubrimiento e identificación de los microARN (miRNA). La Biblioteca de ID de destino es un plásmido basado en el genoma biblioteca de cDNA clonado en el 3&#39;UTR aguas abajo de la proteína de fusión de dos de selección, la timidina quinasa zeocin (TKzeo). La primera ronda de selección es para transformantes estables, seguido con la introducción de un miARN de interés, y finalmente, la selección de ADNc que contienen el objetivo de miARN. ADNc seleccionados se identificaron mediante la secuenciación (véase la Figura 1-3 para flujo de trabajo de la Biblioteca de ID y los detalles). Para asegurar una cobertura amplia del transcriptoma humano, Target ID Biblioteca cDNA se generaron a través de oligo-dT cebado con un grupo de ARN total preparado a partir de múltiples tejidos humanos y líneas celulares. Resultando gama de ADNc de 0,5 a 4 kb, con un tamaño medio de 1,2 kb, y se clonaron en el p3TKzeo doble selección plásmido (véase la Figura 4 Mapa de plásmido). Los objetivos de genes representados en la liblioteca se puede encontrar en la página web de Sigma-Aldrich. Los resultados de la secuenciación de Illumina (Tabla 3), muestran que la biblioteca cuenta con 16.922 de los 21,518 genes únicos en la UCSC RefGene (79%), o 14.000 genes con 10 o más lecturas (66%).

La Biblioteca de ID de destino es un plásmido basado en el genoma colección de cDNA clonado utiliza para identificar los genes miARN objetivos. Aquí nos demuestran su uso y aplicación.

Genoma toda la pantalla de los genes miARN objetivos mediante el objetivo de la misión Carnet de identificación

La biblioteca Target ID está diseñada para ayudar en el descubrimiento e identificación de dianas de microARN (miARN). La biblioteca Target ID se basa en plásmidos...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en realizar una criba de alto rendimiento a escala del genoma completo de los blancos de microARN mediante el uso de la biblioteca de identificación de blancos. Esto se logra mediante la transfección celular con el plásmido de la biblioteca. A la transfección con una colección a escala del genoma completo de ADNc clonados le sigue la selección de líneas celulares estables.Las células de la biblioteca establecida se transfectan luego con el constructo de expresión de ARN micro para permitir la coexpresión del blanco de ARN micro y la timidina quinasa. En este punto, se utiliza ganciclovir para seleccionar las células que expresan blancos específicos de ARN micro mediante la selección en contra de la expresión de timidina quinasa. Luego, los fragmentos de ADN que contienen los sitios diana de ARN micro se amplifican mediante PCR utilizando los cebadores de amplificación del identificador del blanco, con el fin de secuenciar e identificar los blancos de la biblioteca de ARN micro.Finalmente, se obtienen resultados que identifican dianas específicas de microARN en células basándose en el análisis de secuenciación profunda. La biblioteca de identificación de dianas de la misión está diseñada para ayudar en el descubrimiento y la identificación de dianas génicas para microARN. Aquí demostramos su uso y aplicación.Antes de comenzar este protocolo, seleccione una línea celular que no exprese o que exprese bajos niveles del IRA de interés, cultive y amplíe las células para obtener aproximadamente dos veces 10 a la siete células al 80 % de confluencia. Después de la tripsinización, transfiera las células a un tubo estéril de 15 mililitros con tapón de rosca y centrifugue las células a 200 × g durante cinco minutos para formar un pellet. Tras la eliminación del medio, resuspenda el pellet celular para lavar, centrifugue nuevamente las células y repita el lavado una segunda vez.Mientras tanto, prepare suficientes tubos de 0.5 mililitros para el número de transfecciones, añadiendo dos microgramos de la biblioteca de identificación diana a cada tubo. Ahora, re suspenda el sedimento celular dentro del tubo de 15 mililitros utilizando 600 microlitros de una solución de Nucle afectión Maxim por cada transfección. Una reacción a la vez.Añada 100 microlitros de células al alícuota, junto con dos microgramos de plásmido, mezclando con la punta de pipeta. Transfiera cada mezcla a un vete de efector nuclear. Inserte un vete en el instrumento de efector nuclear y ejecute un programa optimizado adecuado para la línea celular.A continuación, llene una pipeta de transferencia con medio precalentado. Aspire las células transfectadas con la misma pipeta y transfiera a un solo pocillo de una placa de seis pocillos previamente preparada. Repita este proceso para cada afectación nuclear de NU siguiendo cada afectación nuclear de NU.Devuelva las células a la cámara de crecimiento para una incubación nocturna hasta el día siguiente. Reemplace el medio y permita que las células se recuperen durante tres a cinco días. Una vez que las células se hayan recuperado, retire el medio y agregue medio completo que contenga el nivel adecuado de eosina para seleccionar la integración estable y la expresión de la proteína de fusión TKZO.La concentración de eosina puede determinarse previamente como se describe en el texto. Monitoree las células para la selección con eosina mediante la viabilidad celular. Reemplace el medio con medio fresco que contenga eosina cada dos o tres días.Una vez que las células alcancen confluencia en la placa de seis pocillos, páselas y amplíe el cultivo a matraces más grandes. Se realiza un análisis de curva de letalidad para establecer la dosis letal mínima de los reactivos de selección utilizados en el estudio. Para evitar respuestas fenotípicas no deseadas, realice primero las curvas de letalidad sembrando las células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos que contenga 120 microlitros de medio fresco al día siguiente.Añada el fármaco a los pocillos seleccionados. Se utilizan antibióticos G cuatro 18 o puromicina para seleccionar la integración del constructo de expresión de mirna o frente a aciclovir para seleccionar contra la expresión de timidina quinasa. Durante la incubación, examine la viabilidad celular para cada concentración de fármaco cada dos días. Cambie el medio que contiene el reactivo de selección cada tres días.Se debe utilizar la concentración mínima del reactivo de selección que provoque la muerte celular completa después del tiempo deseado, una vez determinadas las concentraciones del fármaco, para ese tipo celular y experimento. Prepárese para la MI transfectando mediante el cultivo y expansión de las células del Banco de Identificación Objetivo para obtener dos veces 10 a la séptima células. Utilice tripsina cuando las células alcancen una confluencia mayor al 80 %.Transfiera las células a un tubo estéril de 15 mililitros con tapón de rosca y haga un pellet a 200 veces G durante cinco minutos. Retire el medio y lave el pellet celular dos veces como antes. A continuación, para cada transfección, agregue dos microgramos del plásmido de expresión MIRA a un tubo de 0,5 mililitros.Realice la transfección nuclear del ARNm en las células del banco mediante el mismo método utilizado para la transfección del banco de identificación diana. Después de que las células se hayan recuperado durante tres a cinco días, sustituya el medio por medio completo que contenga el nivel adecuado de antibiótico, según se determinó a partir de la prueba de curva de muerte.Supervise las células para la selección con antibiótico, reemplazando el medio con medio que contiene el antibiótico cada dos o tres días. Una vez confluentes en la placa de seis pocillos, pase el pool y expanda las células a frascos más grandes. Como antes, reemplace el medio con medio fresco que contenga los niveles adecuados de GCV y antibiótico.Monitoree las células para detectar la expresión de la timidina quinasa y la expresión de ARNm mediante la viabilidad celular y amplifique las células sobrevivientes en presencia de GCV y antibiótico. A continuación, prepare ADN genómico a partir de las células seleccionadas con GCV. Amplifique por PCR los insertos de la biblioteca seleccionados con cebadores del kit y subclónelos según se describe en el protocolo escrito.Posteriormente, se pueden realizar reacciones de secuenciación con cebadores de amplificación. Como paso final, identifique los genes diana mediante alineamiento BLAST de las secuencias con el transcriptoma humano para transcritos conocidos y con el genoma humano para transcritos novedosos. Un constructo expresando mere 3 73 fue transfectado establemente en la biblioteca MC seven y seleccionado en medio que contenía ganciclovir para enriquecer las células que expresan mere 3 73 dianas.GCV no tiene efecto sobre las células MCF siete sin biblioteca porque no expresan timidina quinasa. Por otro lado, las células de la biblioteca C siete sí expresan timidina quinasa, pero no son eliminadas completamente por la ganciclovir a ocho o 16 micromoles, como lo muestra las células vivas que incorporan azul brillante. Sin embargo, las células de la biblioteca dejan de crecer en GCV, como lo indica el color del indicador rojo de fenol en su medio.Las células detenidas no acidifican su medio y el color permanece rojizo. En lugar de cambiar a naranja, las secuencias diana se aislaron de las células sobrevivientes. Amplificadas por PCR y secuenciadas.Se obtuvieron casi 12 millones de lecturas de ADNc que se alinearon a casi 12.000 genes únicos. De estos genes únicos, 234 se consideraron aciertos confiables en virtud de la frecuencia de acierto y fueron específicos del mere 3 73. Una comparación inicial reveló que 10 de los genes únicos identificados con la biblioteca de identificación del objetivo también se encuentran en la lista de objetivos mere 3 73 previamente identificados en tar base.Por lo tanto, estos 10 son probablemente objetivos válidos de meras 3 73 y actualmente se están caracterizando para validar experimentalmente los aciertos seleccionados. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la biblioteca de identificación de objetivos de misión para realizar una pantalla de alto rendimiento a escala del genoma completo para objetivos génicos de microARN.

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Biología

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Los microARN (miRNA) son importantes reguladores de la expresión génica y se ha demostrado que juegan un papel importante en numerosos procesos biológicos. Para comprender mejor las interacciones entre UTR miRNA, hemos creado una colección de todo el genoma de tres periodistas UTR luciferasa se combina con un nuevo gen de luciferasa y reactivo de ensayo, el sistema de interruptor.

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La identificación luminiscente de elementos funcionales en regiones no traducidas 3' (3'UTRs) (3'LIFE) es una técnica para identificar la regulación funcional en 3'UTRs mediante miRNAs u otros factores reguladores. Este protocolo utiliza una metodología de alto rendimiento, como la transfección de 96 pocillos y los ensayos de luciferasa, para detectar cientos de interacciones putativas para la represión funcional.

La detección de los genes miARN objetivos en de alto rendimiento utilizando el ensayo 3&#39;LIFE

La identificación de nuevos objetivos farmacológicos que pasan de las pruebas preclínicas a los ensayos en humanos es una prioridad científica. Con ese fin, aquí describimos un enfoque de genómica funcional para examinar el impacto del agotamiento de genes en esferoides de líneas celulares cancerosas, que modelan más adecuadamente los cánceres humanos in vivo.

La utilización de la genómica funcional de selección para identificar dianas farmacológicas potencialmente nueva en la celda cáncer culturas Esferoide

Este informe describe un método rápido y confiable para la validación de blancos del mRNA de miRNAs celular. Los usos del método biotinilado sintético basado en la LNA de ácido nucleico bloqueado miRNA imita para capturar objetivo mRNA. Posteriormente, se emplean bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina para telecine blanco mRNA para la cuantificación por reacción en cadena de polimerasa qPCR.

Desplegable base de biotina de ensayo a validar mRNA miRNAs objetivos de celular

Aquí se describe un protocolo para caracterizar módulos de miRNAs biológicamente sinérgicos y su ensamblaje en transgenes cortos, lo que permite la sobreexpresión simultánea para aplicaciones de terapia génica.

Caracterización de los miRNAs asociados funcionalmente en el glioblastoma y su ingeniería en clústeres artificiales para la terapia génica

Aquí, presentamos una nueva y totalmente automatizada tubería de miARN, mirMachine que 1) puede identificar miARN conocidos y novedosos con mayor precisión y 2) está totalmente automatizada y disponible gratuitamente. Los usuarios ahora pueden ejecutar un breve script de envío para ejecutar la canalización mirMachine totalmente automatizada.

mirMachine: Una ventanilla única para la anotación de miARN de plantas

Este protocolo describe un flujo de trabajo de edición de genes de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) agrupadas regularmente interespaciadas de alto rendimiento para el análisis de redes de clústeres de microARN que permite la generación rápida de un panel de líneas celulares modificadas genéticamente que llevan combinaciones únicas de eliminación de miembros de grupos de miRNA de hasta 35 kb dentro de un solo experimento.

Herramienta de edición de genes CRISPR para el análisis de redes de clústeres de microARN

Hemos desarrollado un enfoque de oncogenómica comparativa entre especies que utiliza análisis genómicos y cribados genómicos funcionales para identificar y comparar dianas terapéuticas en tumores que surgen en modelos de ratón modificados genéticamente y el tipo de tumor humano correspondiente.

Perfiles genéticos y cribado de abandono a escala genómica para identificar dianas terapéuticas en modelos murinos de tumor maligno de la vaina de los nervios periféricos

El protocolo describe un ensayo de hibridación de inmunofluorescencia en tándem con tejido fijado en formol e incluido en parafina para detectar y cuantificar microARN y proteínas multiplexadas simultáneamente.

Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación

Aprende a realizar un cribado genómico de alta producción para identificar objetivos de microARN utilizando la biblioteca Target ID. Este método permite establecer líneas celulares estables y analizar secuencias mediante PCR y secuenciación profunda.

Genoma toda la pantalla de los genes miARN objetivos mediante el objetivo de la misión Carnet de identificación

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