Name: LentiPlex MISIÓN combinados de detección del shRNA biblioteca en células de mamífero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprende a realizar cribados de selección positiva con la biblioteca de shRNA LentiPlex MISSION en células de mamífero. Este método permite identificar genes que promueven la supervivencia celular frente a agentes terapéuticos.

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La misión es una marca registrada de Sigma-Aldrich Biotecnología LP LentiPlex es una marca comercial de Sigma-Aldrich Biotecnología LP

LentiPlex pantalla de configuración agrupados Para identificar las secuencias del shRNA de interés, es fundamental para configurar la pantalla de tal manera que la mayoría de las células reciben una sola ARNhc construir. Mediante el uso de una baja MOI (multiplicidad de infección), la probabilidad de que varios integrantes de cada célula es mucho menor. Sin embargo, la eficiencia de la transducción, y por lo tanto, las MOI deseado, dependerá en gran medida del tipo de célula diana. Por lo tanto, es imperativo que la determinación del momento de inercia óptimo se lleva a cabo antes de iniciar la pantalla en un nuevo tipo de células. 1. Transducción de las células diana con la Misión LentiPlex agrupados ARNhc Biblioteca <ol><li> El actual momento de inercia utilizados variarán para diferentes tipos de células. Si se desea se replica entonces el número de placas debe ser aumentado. Además, por lo general no va a ser ventajoso combinar los diferentes subpools. Mantener el subpools separado la ayuda en el proceso de deconvolución. Garantizar proper el etiquetado de cada plato de cultivo de tejidos con el número de subagrupación que se aplica durante la transducción. Una baja MOI se recomienda para reducir la probabilidad de que varios integrantes por celda. </li><li> Día 1 - Alimentar la semilla del número apropiado de 60 mm platos con cantidad suficiente de células para obtener ~ 70% de confluencia en el día siguiente (10 piscinas en total, cada uno realizado por triplicado = 30 platos en total). Para nuestro estudio, placas de 60 mm fueron sembradas con 6 x 105 células A549 para lograr una confluencia del 70% antes de transducción. Esto asegura que las células están todavía en fase de crecimiento exponencial. Las tasas de crecimiento varían según el tipo celular y debe ser determinado antes de comenzar la pantalla. </li><li> Permiten a las células a adherirse mediante la incubación de la noche a 37 ° C en un incubador humidificado en una atmósfera de CO2 al 5%. </li><li> (Opcional) Incluya otros dos de 60 mm para la transducción de platos con shRNAs control negativo. Etiqueta de los platos "Control A" para SHC001H y "Control B" para SHC002H. </li><li> Día 2 - º transducirlas células con las partículas e LentiPlex viral. En el día de la transducción, descongelar las partículas lentiviral en el hielo. </li><li> La transferencia de las partículas de descongelado a una campana de flujo laminar y mantener en hielo si no se utilizan inmediatamente. </li><li> Calcular cuánto de cada individuo viral sub-grupo que añadir a las células para obtener el MOI de 1 en todos los platos de cultivo celular. <ol><li> Ejemplo: 1 x 10 6 células / plato, título viral = 5 x 10 8 TU / ml, un deseado MOI de 1. i.) 1 x 10 6 células / plato x (MOI de 1) = 1 x 10 6 unidades de transducción (TU) necesarios ii.) 1 x 10 6 TU / (5,0 x 10 8 TU / ml) obtenidos de la C de A = 2 l de solución de reserva lentiviral se debe agregar al plato apropiado. Diluir la cantidad calculada del virus en 100-300 l de medio completo con el fin de asegurar una mejor distribución de los virus cuando se añade a la placa de cultivo celular. </li></ol></li><li> Retire los medios de comunicación de las células pre-semilla. Añadir completa conta los medios de comunicaciónHexadimetrina nando una solución de bromuro de cada plato. La concentración final recomendada de bromuro Hexadimetrina en los medios de comunicación es de 8 mg / ml. Use menos bromuro de Hexadimetrina si usted encuentra que sea tóxico para las células de su objetivo. </li><li> Añadir partículas ARNhc lentiviral a los platos apropiados de acuerdo con el diseño predeterminado experimental. Remover con suavidad las placas para distribuir uniformemente el virus a través de las células. </li><li> Incubar 18-20 horas a 37 ° C en un incubador humidificado en una atmósfera de 5% de CO 2. </li><li> (Opcional) Repita 3-8 en el momento de inercia con idéntica SHC001H (vector vacío del shRNA de control) en el plato de control A y SHC002H (revueltos siRNA control) en el plato de control B. Tratar estos platos de forma idéntica a los platos experimentales en todo el experimento. </li><li> Día 3 - Cambiar los medios de comunicación. Aspirar virus que contienen los medios de comunicación y añadir nuevos medios de comunicación completo (sin bromuro de Hexadimetrina). Se incuban las células a 37 ° C durante la noche. </li></ol> 2. El tratamiento de chapadocélulas con componentes terapéuticos y / o reactivos <ol><li> Día 4 - Aspirar los medios de comunicación de los pozos y añadir medio fresco que contiene componente terapéutico en la concentración óptima. Al igual que con las condiciones de cultivo, los tratamientos varían y las concentraciones adecuadas y la duración debe ser determinado de antemano. En nuestro estudio, hemos utilizado 100 ng / ml de TRAIL y 1 M de paclitaxel. Las células fueron tratadas durante 48 horas. </li><li> Las células supervivientes deben ser re-sembradas en frascos T75 y se permite que se expanda hasta confluir casi el 100%. </li><li> (Opcional) Al final de la selección, inspección de control de un plato y plato de control del plato B. A y B del plato debe tener cada pocas colonias que por lo menos uno de los platos de la biblioteca común. Si hay un número inesperadamente alto de colonias en un plato, ya sea que el proceso de transducción ha afectado a una vía de relación con el fenotipo deseado o la presión selectiva no es lo suficientemente fuerte y volver a la optimización de la prueba pueden ser requeridos. Si B plato contiene demasiadas colonias, Entonces la expresión de shRNA y el compromiso de la vía de RNAi puede tener un efecto sobre el fenotipo de interés. Si este es el caso de repetir con SHC001H, para asegurarse de que el efecto no es específico de SHC002H. </li></ol> 3. Deconvolución de una población de células policlonales <ol><li> Cosecha de la población heterogénea de células de cada subagrupación y aislar el ADN genómico. En nuestro estudio, las células fueron lavadas brevemente en PBS y trypsinized antes de ADN genómico se aisló utilizando el GenElute mamíferos Genómica Miniprep kit y el protocolo suministrado (Sigma-Aldrich, G1N70). Por otra parte, los kits de purificación genómica otros que están actualmente disponibles en el mercado puede ser utilizado para el aislamiento de ADN. Es importante seguir las recomendaciones del protocolo de la cantidad a partir de células cultivadas. </li><li> Amplificación por PCR de los objetivos. La plantilla del shRNA procedimiento de recuperación permite la amplificación de todo el conjunto de inserciones del shRNA de la población de células seleccionadas, o la recuperación de los individos plantillas del shRNA de las colonias que fueron recogidos de forma individual y ampliado. Después de la amplificación de las inserciones del shRNA de control y celdas seleccionadas de destino, los productos de PCR puede ser secuenciado. </li><li> Este paso de amplificación de PCR fue optimizada utilizando Sigma Readymix, Catalog No. P2893. Otros reactivos pueden ser utilizados para la amplificación, pero las condiciones de la bicicleta y / o concentración de magnesio puede ser necesario modificar para la amplificación de éxito. Amplificación de los primers en la concentración de 20 mM se incluyen con el kit LentiPlex. </li><li> Establecer la reacción de PCR como se describe en la Tabla 1. Agregue los componentes en el orden indicado. Las cantidades descritas son para una reacción de 50 mL. Para más reacciones, la escala de los componentes de mezcla principal por el número deseado de reacciones e incluyen 10% de exceso. La cantidad de ADN plantilla recomendada es de 50 a 100 ng. </li><li> Se recomienda encarecidamente que por una reacción de la plantilla se compone de los vectores MISIÓN ARNhc Humanos control positivo diluido el parámetro adecuadoIATE concentración. Amplificación de éxito con esta plantilla indica que los componentes y las condiciones de ensayo de PCR en bicicleta son las adecuadas. NOTA: Para evitar la contaminación remanente de las muestras experimentales y reactivos, se sugiere que el control positivo se diluye en un lugar separado del lugar donde las posteriores reacciones de PCR se establezcan. </li><li> Guarde el programa de PCR en la Tabla 2 en el termociclador. </li><li> Para cada muestra, se combinan tres reacciones de PCR con l 1 l de medio de contraste y la electroforesis junto con 5 L de DirectLoad ™ PCR escalera de 100 pb de baja, número de catálogo D3687 en un 1% en gel de agarosa para confirmar la presencia de un amplicón de 309 pb. </li><li> Subclonación de PCR amplificados: productos de PCR fueron TOPO clonado utilizando el kit de clonación TOPO-TA, siguiendo el protocolo del fabricante (Invitrogen, K4575-01). El resultado es que un producto de PCR se encuentra en cada vector. </li><li> 250 colonias bacterianas individuales (cada uno con un individuo amplicón PCR) fueron aislados y crecern en dos culturas ml de LB con 100 mg / ml de ampicilina. Plásmido de ADN fue extraído utilizando el kit Miniprep GenElute plásmido (Sigma-Aldrich, PLN70). </li><li> Purificado el plásmido de ADN fue digerido con EcoRI y electroforesis para confirmar la presencia de la inserción. </li><li> Muestras de ADN del plásmido fueron secuenciados y el inserto del shRNA identificarse utilizando la secuencia de bases de datos del shRNA LentiPlex Buscar siempre con la biblioteca LentiPlex. </li></ol> 4. Objetivo la identificación y validación <ol><li> La secuencia se inicia con ARNhc 5'-GAAACACCGG-3 '. Escriba por lo menos los próximos 10 pero menos de 21 nucleótidos en la secuencia de consulta en el cuadro Buscar en la secuencia de forma cerrada del shRNA base de datos de búsqueda de acceso. </li><li> Seleccionar las especies de la shRNA común. Opcionalmente, active la subagrupación de la que se encontró la secuencia. </li><li> Ahora haga clic en "Buscar éxitos potenciales" para realizar la búsqueda. Se deben indicar la correspondiente secuencia de TRC shRNA (s) que coinciden con the secuencia de datos. Más información sobre la secuencia de TRC shRNA (s) identificados y los objetivos gen correspondiente se pueden encontrar fácilmente en Sigma-Aldrich es su gen favorito: <a href="http://www.sigma.com/yfg">http://www.sigma.com/yfg</a> </li><li> Identificaron los genes diana deberá ser validada por repetición de la prueba de detección original junto con el clon de la CVR y por lo menos dos shRNAs adicionales que se dirigen a un mismo gen con un siRNA 1 a 1 y el formato. Verdaderos hits mostrará el mismo fenotipo en la mayoría de los pozos. </li></ol> 5. Resultados representante Un ejemplo de un flujo de trabajo LentiPlex pantalla agrupados se detalla en la Figura 1. Células transducidas que proliferaron en la presencia de TRAIL y paclitaxel se les permitió expandirse hasta frascos fueron confluentes. ADN genómico fue extraído y sometido a la amplificación por PCR y la clonación, como se ilustra en la Figura 1 A, antes de ser presentado para la identificación de la secuencia y del shRNA como se describe en Figure 1 C 250 clones fueron secuenciados, de estos 25 fueron representados por múltiples clones y los restantes 225 estaban representados por sólo una copia y no se persigue en este momento. Como se muestra en la Figura 2, varios genes candidatos, incluida TBX3, PPP2CA y AKT2 estuvieron representados por múltiples clones. El factor de transcripción T-box, TBX3 apareció en un total de cuatro clones y se ha implicado en el tumor de migración a PHP 5. Regulación a la baja PPP2CA se ha demostrado que mantener el crecimiento de las células LNCaP cultivadas en condiciones deficientes de andrógenos por el alivio de la privación de andrógenos inducidos por el ciclo celular detención y prevención de la apoptosis 6. AKT2 es una serina RAC-beta / treonina proteína quinasa y oncogen putativo demostrado que desempeñan distintas funciones en el desarrollo del cáncer 7, 8. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table1.jpg" alt="Tabla 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabla 1"> * La concentración final de Mg 2 + en la solución de 3 mm;1,5 mM se aporta desde el Readymix Taq y 1,5 mm de la solución de cloruro de magnesio. Tabla 1. Lentiplex Condiciones de reacción PCR <img src="/files/ftp_upload/3305/3305table2.jpg" alt="Tabla 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabla 2"> Tabla 2. Lentiplex programa de amplificación de PCR <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1a.jpg" alt="Figura 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1a"> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1b.jpg" alt="Figura 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1b"> <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig1c.jpg" alt="Figura 1c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1c"> Figura 1. (A) LentiPlex agrupados pantalla, (B) de flujo de trabajo deconvolución policlonales, y (c) la identificación de los objetivos del shRNA. LentiPlex A. agrupados pantalla. En primer lugar, las células de la semilla, a continuación, añadir subpools shRNA, (10 piscinas en total, cada uno realizado por triplicado, de 30 platos en total). A continuación, tratar con los componentes terapéuticos y / o reactivos (en nuestro caso, TRAIL y Paclitaxel, respectivamente). A continuación, sembrar de nuevo las células supervivientes en los frascos y dejar que se expanda. Cosecha heterogénea población de células de cada subagrupación y aislar el ADN genómico. Deconvolución B. policlonales. Realizar PCR para amplificar el ADN que contiene el inserto shRNA. El producto de PCR es uniforme en tamaño, pero policlonales en secuencia desde la ADNg plantilla también policlonales. Producto de PCR se clonaron en el vector y luego se transforma en bacterias competentes. C. Determinación de los objetivos del shRNA. Colonias individuales son aislados y el plásmido de ADN se extrae. Cada clon contiene el vector de clonación con un individuo fragmento de PCR. ADN plásmido se digiere para confirmar la presencia de la inserción y secuenciados. La inserción del shRNA se identifica con la secuencia de bases de datos del shRNA LentiPlex búsqueda. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Identificadas puedenLos genes candidato. 25 genes candidatos se identificaron que había muchos golpes. 225 genes candidatos sólo tenía un golpe y no fueron perseguidos. Por favor, véase la Tabla 1 suplementaria un desglose de los clones individuales por gen candidato. <img src="/files/ftp_upload/3305/3305suptable1.jpg" alt="Tabla 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabla 1"> Que complementa el cuadro 1. Individuales TRC clones Biblioteca identificados a partir de la secuenciación de genes ID policlonales Visitas clones detectados.

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</ol>

Matthew J. Coussens, Corman Courtney, Ashley L. Fischer, Sago, Jack y John Swarthout son empleados por Sigma-Aldrich, lo que hace que las herramientas y los reactivos utilizados en este artículo.

En este estudio, se presenta una pantalla de todo el genoma para identificar genes implicados en la citotoxicidad de las células A549 después del tratamiento con paclitaxel / TRAIL. El uso de un enfoque combinado en una pantalla de todo el genoma reduce el tiempo, el costo y la inversión en equipo que normalmente se asocian con las pantallas convencionales dispuestos. Fundamental para el éxito de la pantalla son experimentos de optimización realizado de antemano. Condiciones de transducción y MOI debe ser determinado empíricamente. El método de selección debe permitir una selección sólida de células que presentan el fenotipo deseado (por ejemplo, la supervivencia, la expresión de proteínas de superficie, etc.) La optimización de estos parámetros se reducirá el número de falsos positivos detectados. Aquí, ADNg fue cosechado de la población mayor parte de las celdas seleccionadas y luego TOPO clonado para identificar inserciones individuales shRNA. Una posible mejora para este experimento habría sido para seleccionar las células en vivo usando FACS para asegurarque sólo las células vivas son recogidos. Los objetivos fijados, será validado por la transducción con el objetivo específico de shRNAs en un ensayo de cribado. Verdaderos hits mostrará el fenotipo de la mayoría de los pozos. La Biblioteca LentiPlex combinados es flexible en su aplicación. Es compatible con una amplia gama de aplicaciones posteriores y puede ser utilizado con las estrategias de selección positiva o negativa. Dependiendo de las condiciones de selección, deconvolución de los insertos del shRNA se lleva a cabo a través de PCR / clonación, microarrays, o secuenciación de próxima generación 9, 10. Aunque la potencia y velocidad de estas técnicas para deconvolute pantallas de RNAi está bien establecida, una preocupación por microarrays y próxima generación de métodos de secuenciación es la disponibilidad de recursos bioinformáticos y los conocimientos necesarios para analizar e interpretar correctamente los resultados experimentales. Los costos asociados con estas técnicas puede muchas veces ser un obstáculo para la realización de las pantallas de todo el genoma. APCR / enfoque basado en la clonación, aunque no tan poderoso como los microarrays y la secuenciación de próxima generación es una alternativa costo efectiva y de menor. Agilent ofrece ahora una gama personalizada basada en la biblioteca del shRNA TRC para ayudar aún más en las pantallas de LentiPlex. Estas opciones permiten a los investigadores a utilizar LentiPlex para estudiar una amplia gama de funciones celulares.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">LentiPlex agrupados matriz</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">SHPH01</a> </td></tr><tr><td> Las células A549 </td><td> ATCC </td><td> CCL-185 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T5694%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">TRAIL</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td><html> oductDetail.do? lang = es &amp; N4 = T5694% 7CSIGMA y N5 =% SEARCH_CONCAT_PNO 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;&gt; T5694 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Paclitaxel</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">T7402</a> </td></tr><tr><td> Topo TA kit de clonación </td><td> Invitrogen </td><td> K4575-01 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P2893%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">JumpStart Taq Readymix</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td>ONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY &amp; F = SPEC &quot;P2893&gt; </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Kit GenElute plásmido Miniprep</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">PLN70</a> </td></tr><tr><td> EcoR1 </td><td> New England Biolabs </td><td> R0101 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Hexadimetrina bromuro</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">Sigma-Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">H9268</a> &lt;/ Td&gt; </tr></tbody></table>

lentiplex misiÓn combinados de detección del shrna biblioteca en células de mamífero

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo intrínseco celular de la regulación de la expresión génica. Aprovechar el poder innato de este sistema nos permite niveles de caída expresión de genes en la pérdida de los estudios de la función del gen. Hay dos métodos principales para la realización de RNAi. La primera es el uso de pequeños ARN de interferencia (siRNAs) que son sintetizados químicamente, y la segunda utiliza a corto horquilla RNAs (shRNAs) codificados en plásmidos 1. Estos últimos pueden ser transfectadas en células directa o empaquetados en la replicación lentiviral partículas incompetente. Las principales ventajas de la utilización de shRNAs lentiviral es la facilidad de introducción en una amplia variedad de tipos de células, su capacidad de integrar de manera estable en el genoma de caída a largo plazo y la selección de genes, y su eficacia en la conducción de alto rendimiento de las pantallas de la pérdida de función. Para facilitar esto hemos creado la biblioteca del shRNA LentiPlex agrupados. El SIGBiblioteca SION LentiPlex Humanos del shRNA agrupado una piscina lentiviral genoma producido utilizando un proceso patentado. La biblioteca consta de más de 75.000 construcciones de la colección del shRNA TRC dirigidos 15,000 genes humanos 2. Cada biblioteca es la prueba de la representación del shRNA antes del lanzamiento del producto para asegurar una cobertura sólida biblioteca. La biblioteca se presenta en un formato listo para usar lentiviral en títulos de al menos 5 x 10 8 TU / ml a través de ensayo y p24 es pre-dividido en diez subpools de aproximadamente 8.000 ARNhc construye cada uno. Cebadores de amplificación y secuenciación también están disponibles para la identificación de objetivos intermedios. Estudios previos han establecido una actividad antitumoral sinérgica de TRAIL en combinación con paclitaxel en las células A549, un carcinoma de pulmón humano línea celular 3, 4. En este estudio se demuestra la aplicación de un LentiPlex agrupados biblioteca del shRNA para llevar a cabo rápidamente una pantalla de selección positiva de los genes involucrados en la citotoxicidad of A549 células cuando está expuesta a TRAIL y paclitaxel. Una barrera a menudo encontrados con alto rendimiento de las pantallas es el costo y la dificultad en la deconvolución, también los detalles de un enfoque policlonal rentable la utilización de la secuenciación tradicional.

Aquí se utiliza una biblioteca LentiPlex humano común y tradicionales métodos de secuenciación de genes para identificar los objetivos de promover la supervivencia celular. Demostramos cómo configurar y deconvolute una pantalla LentiPlex y validar los resultados.

LentiPlex MISIÓN combinados de detección del shRNA biblioteca en células de mamífero

La interferencia de ARN (ARNi) es un mecanismo celular intrínseco para la regulación de la expresión génica. El aprovechamiento del poder innato de este sistema nos permite...

El objetivo general del siguiente video es demostrar el uso de una biblioteca de genoma completo de ARN de horquilla corta o S-H-R-N-A para realizar rápidamente una pantalla de selección positiva. Esto se logra mediante la transducción de las células diana con 10 subpiscinas de la biblioteca Mission LentiPlex de genoma completo, S-H-R-N-A, seguida de la adición del componente terapéutico. Como segundo paso, se recupera el material de la plantilla de HRNA, lo que permite la desconvolución de la pantalla agrupada.El S-H-R-N-A recuperado se clona luego en el vector y se transforma en bacterias competentes. A continuación, se secuencian muestras de ADN plasmídico y se identifican los blancos de S-H-R-N-A utilizando la base de datos de búsqueda de secuencias lenti PLX, HRNA. Los resultados del experimento realizado en este video revelan los genes implicados en la citotoxicidad de una línea celular tumoral epitelial cuando se expone a agentes farmacológicos antitumorales, basándose en el número de lecturas de secuenciación. La misión.Lin Duplex agrupado. La biblioteca HRNA contiene el consorcio RNAI o la colección TRC en 10 tubos matriciales y puede utilizarse para realizar rápidamente estudios de alto rendimiento sobre la pérdida de función génica. En este estudio, se utiliza para llevar a cabo rápidamente una pantalla de selección positiva para identificar genes implicados en la citotoxicidad de las células 5 49 al exponerlas a TRAIL y paclitaxel antes de la transducción de las células diana.Siembre el número adecuado de placas de 60 milímetros con suficientes células para obtener aproximadamente un 70 % de confluencia al día siguiente. Incube las células a 37 grados Celsius durante la noche. Las tasas de crecimiento variarán según el tipo celular y deben determinarse antes de comenzar el ensayo, para prepararse para la transducción de células con la biblioteca Mission LentiPlex pooled shRNA. Derrita las partículas lentivirales sobre hielo y transfiera las partículas descongeladas a una cabina de flujo laminar, manteniéndolas sobre hielo si no se van a usar inmediatamente.Calcule cuánto de cada subpiscina viral individual debe agregarse a las células para obtener una multiplicidad de infección o MOI de uno en todos los platos de cultivo celular. Se utiliza una MOI baja para reducir la probabilidad de múltiples integraciones por célula; diluya la cantidad calculada de virus en 100 a 300 microlitros de medio completo para asegurar una mejor distribución del virus al agregarlo al plato de cultivo celular, luego retire el medio de las células previas. Agregue medio completo que contenga solución de polibreno a cada plato al medio.Agregue partículas lentivirales HRNA a las placas adecuadas de acuerdo con el diseño experimental predeterminado. Agite suavemente las placas para distribuir uniformemente el virus sobre las células. Incube de 18 a 20 horas a 37 grados Celsius en un incubador húmedo con una atmósfera de 5% de dióxido de carbono.Al día siguiente, aspire el medio que contiene el virus y agregue medio completo fresco sin poli-cerebro. Incube las células a 37 grados Celsius durante la noche, al cuarto día aspire el medio de las células y agregue medio fresco que contenga el componente terapéutico en una concentración óptima predeterminada. Luego, trate las células con el componente durante una duración predeterminada.En este estudio, las células se tratan con 100 nanogramos por mililitro de trail y un micromolar de paclitaxel durante 48 horas. Tras el tratamiento, las células sobrevivientes deben sembrarse nuevamente en matraces T 75 y dejarse expandir hasta alcanzar una confluencia cercana al 100 % para realizar la desconvolución policlonal. Se recolecta la población heterogénea de células de cada subgrupo y se aísla el ADN genómico.Comience el procedimiento de recuperación de la plantilla S-H-R-N-A con la preparación de la reacción de PCR según se describe en el protocolo escrito. Los cebadores de amplificación, con una concentración de 20 milimolares, se incluyen en el kit lenti plex. Prepare un control positivo utilizando el vector de control positivo humano mission SHRA diluido a la concentración adecuada como plantilla.La amplificación exitosa con esta plantilla indica que los componentes del ensayo de PCR y las condiciones de ciclado son adecuados. Guarde el programa de PCR indicado en el protocolo escrito en el termociclador y realice la amplificación del blanco. Una vez completado el ciclo, combine tres microlitros de cada reacción de PCR con un microlitro de colorante y realice electroforesis junto con un marcador de bajo peso molecular de 100 pares de bases en un gel de agarosa al 1 % para confirmar la presencia de un amplicón de 309 pares de bases.En este punto, los amplicones de PCR se clonan mediante subclonación Topo utilizando el kit de clonación TA Topo siguiendo el protocolo del fabricante. El resultado es que cada producto de PCR queda contenido en un vector individual. Una vez completada la subclonación, aíslese 250 colonias bacterianas individuales, cada una de las cuales contiene un amplicón de PCR individual.Cultivar las colonias individuales en cultivos de dos mililitros, a partir de los cuales se puede extraer el ADN plasmídico utilizando el kit Gen Elute de preparación rápida de plásmidos, tras la digestión del ADN plasmídico purificado con Eco RI; la presencia del inserto puede confirmarse mediante electroforesis. Finalmente, a partir de las muestras de ADN plasmídico secuenciadas, el inserto de S-H-R-N-A puede identificarse utilizando la base de datos de búsqueda de secuencias Plex HRNA proporcionada con la biblioteca PLX. Localice el cuadro de búsqueda en el formulario adjunto de la base de datos de acceso a la búsqueda de secuencias S-H-R-N-A al comienzo de la secuencia HRNA.Introduzca los siguientes 10 a 21 nucleótidos de la secuencia de consulta. Luego seleccione la especie del ARNH agrupado. Opcionalmente, seleccione el subgrupo del cual se encontró la secuencia.Ahora haga clic en el botón buscar posibles coincidencias para realizar la búsqueda. Esto debería identificar las secuencias correspondientes de TRCS HRA que coinciden con los datos de secuenciación. Luego, se puede utilizar el sitio web de Sigma-Aldrich, su sitio web favorito de genes, para obtener más información sobre las secuencias de TRCS HRA identificadas y los genes diana correspondientes. Los genes diana identificados deben validarse repitiendo el ensayo de cribado original con el clon TRC original, además de al menos dos ARN adicionales que dirijan el mismo gen, utilizando un formato de un ARN h para un plato de 60 milímetros.Los verdaderos positivos mostrarán el mismo fenotipo en la mayoría de las placas. Se aislaron clones que contenían el vector de clonación con un fragmento individual de PCR mediante el procedimiento de recuperación de plantilla SHRA, y se identificó el inserto HRNA utilizando la base de datos de búsqueda de secuencias lenti plex SHRA. Se secuenciaron 250 clones.De estos, 25 estaban representados por múltiples clones, y los 225 restantes estaban representados por un solo clone y no se siguieron. Como se muestra aquí, varios genes candidatos, incluidos TBX three, PPP two, ca y AKT two, estaban representados por múltiples clones. El factor de transcripción de la caja T TBX three apareció en un total de cuatro clones y se ha implicado en la migración tumoral.Se ha demostrado que la desregulación hacia abajo de PPP dos ca mantiene el crecimiento de células ln cap cultivadas en condiciones deficientes en andrógenos, aliviar el arresto del ciclo celular inducido por la privación de andrógenos y prevenir la apoptosis. Además, AKT dos es una proteína quinasa Arak Beta Siria tres Anina y un oncogén putativo que se ha demostrado que desempeña varios papeles en el desarrollo del cáncer. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo utilizar la misión.Biblioteca combinada de ARNip Len Plex para realizar rápidamente estudios de alto rendimiento sobre la pérdida de función génica.

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Biología

Aquí se utiliza una biblioteca esiRNA humanos en una pantalla de alto rendimiento de los genes implicados en la división celular. Demostramos cómo configurar y llevar a cabo una esiRNA pantallas, así como la forma de analizar y validar los resultados.

MISIÓN esiRNA sobre el cribado del ARNi en células de mamífero

La Biblioteca de ID de destino es un plásmido basado en el genoma colección de cDNA clonado utiliza para identificar los genes miARN objetivos. Aquí nos demuestran su uso y aplicación.

Genoma toda la pantalla de los genes miARN objetivos mediante el objetivo de la misión Carnet de identificación

Divulgamos una pequeña horquilla RNA (shRNA) y el siguiente protocolo basado en la secuencia de generación para la identificación de reguladores de la inactivación del cromosoma x en una línea celular murina con luciferasa de luciérnaga y genes de resistencia a Higromicina fusionado a la metil CpG Unión proteína 2 ( MeCP2) gen en el cromosoma X inactivo.

ShRNAs combinados pantalla para reactivación de MeCP2 en el cromosoma de X inactivo

Una biblioteca CRISPR/sgRNA ha sido aplicada a interrogar a genes de la proteína-codificación. Sin embargo, la factibilidad de una biblioteca sgRNA para descubrir la función de un límite CTCF en Regulación génica sigue siendo inexplorada. Aquí, describimos una biblioteca de sgRNA específicos HOX loci para aclarar la función de los límites CTCF en loci HOX .

HOX Loci enfocado CRISPR/sgRNA biblioteca proyección identificación crítica CTCF límites

La tecnología CRISPR-Cas9 proporciona un método eficiente para editar con precisión el genoma de mamíferos en cualquier tipo de célula y representa un medio novedoso para realizar pantallas genéticas en todo el genoma. Aquí se proporciona un protocolo detallado que analiza los pasos necesarios para el buen rendimiento de las pantallas CRISPR-Cas9 agrupadas para todo el genoma.

Pantallas genéticas basadas en CRISPR en células de mamíferos

Para identificar nuevos reguladores de los factores de transcripción, desarrollamos un enfoque para las bibliotecas de ARN lentivirales o retrovirales arrayed utilizando un ensayo de reportero transcripcional basado en doble luciferasa. Este enfoque ofrece una forma rápida y relativamente económica de examinar a cientos de candidatos en un solo experimento.

Identificación de reguladores de factores de transcripción mediante la proyección de rendimiento medio de bibliotecas de matriz y un reportero basado en la doble luciferasa

El cribado de interferencia de ARN (ARNi) de alto rendimiento utilizando un grupo de shRNAs lentivirales puede ser una herramienta para detectar dianas letales sintéticas terapéuticamente relevantes en neoplasias malignas. Proporcionamos un enfoque de detección de ARNt agrupado para investigar los efectores epigenéticos en la leucemia mieloide aguda (LMA).

Cribado agrupado de la biblioteca de shRNA para identificar los factores que modulan un fenotipo de resistencia a los medicamentos

Utilizando el polímero catiónico de bajo costo polietilenimina (PEI), producimos partículas lentivirales para la expresión estable de shRNAs en células madre embrionarias humanas H9 (hESC) y células progenitoras neurales derivadas de H9 (NPC) transducidas transitoriamente con alta eficiencia.

Administración mediada por lentiviral de shRNAs a hESCs y NPCs usando polietileno de polímero catiónico de bajo costo (PEI)

Hemos desarrollado un enfoque de oncogenómica comparativa entre especies que utiliza análisis genómicos y cribados genómicos funcionales para identificar y comparar dianas terapéuticas en tumores que surgen en modelos de ratón modificados genéticamente y el tipo de tumor humano correspondiente.

Perfiles genéticos y cribado de abandono a escala genómica para identificar dianas terapéuticas en modelos murinos de tumor maligno de la vaina de los nervios periféricos

Este protocolo describe un enfoque escalable de cribado intraductal CRISPR que permite estudios paralelos in vivo de eliminación y activación génica en la glándula mamaria del ratón.

Cribado in vivo paralelo de la eliminación y activación génica en la glándula mamaria del ratón

Aprende a realizar cribados de selección positiva con la biblioteca de shRNA LentiPlex MISSION en células de mamífero. Este método permite identificar genes que promueven la supervivencia celular frente a agentes terapéuticos.

LentiPlex MISIÓN combinados de detección del shRNA biblioteca en células de mamífero

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