Imágenes de detección de feromonas en una preparación de ratón Vomeronasal aguda lámina de tejido

El objetivo general de este procedimiento es establecer una preparación de cortes agudos de tejido del órgano nasal RO o del órgano vomeronasal (VNO) de ratón, con el fin de realizar experimentos de imagen de calcio en subpoblaciones y/o neuronas individuales en tejido vivo. Esto se logra primero extrayendo el VNO del hocico del ratón y luego diseccionándolo microscópicamente de su cápsula cartilaginosa bajo un microscopio estereoscópico en LCR frío. A continuación, el VNO aislado se coloca verticalmente en un bloque de agar y se cortan secciones coronales agudas del tejido utilizando un microtomo para verificar la integridad del tejido.

Se observan algunas secciones tras la inmunohistoquímica mediante microscopía confocal. Otras secciones se cargan con un colorante sensible al calcio y luego se perfunden con ligandos putativos de feromonas, observándose la activación neuronal mediante imágenes de calcio. Este método puede ayudar a resolver cuestiones clave en el campo olfativo.

Por ejemplo, se expresan cientos de receptores de feromonas en el órgano nasal romo, pero muy pocos de ellos tienen ligandos identificados. Los receptores de feromonas son muy difíciles de expresar en un sistema heterólogo. Necesitábamos desarrollar un ensayo eficiente in vivo para asignar feromonas específicas a receptores específicos.

Podemos utilizar ratones táctiles en los que una subpoblación específica de neuronas expresa receptores desconocidos y puede identificarse mediante la expresión de GFP. También podríamos usar este ensayo para investigar farmacológicamente los canales iónicos y enzimas implicados en la cascada de transducción de Fairmont, demostrando el procedimiento. Hoy serán Julian y Fabian, dos investigadores de mi laboratorio, quienes realicen el procedimiento antes de comenzar la disección.

Prepare líquido cefalorraquídeo artificial, A CSF, fresco y frío, saturado con oxycarb, combinando todos los ingredientes excepto el cloruro de calcio. Sature la solución burbujeando directamente oxycarb en ella. Luego agregue el cloruro de calcio y ajuste con agua doblemente destilada al volumen deseado.

Mantenga la solución de LCR A en hielo hasta su uso. Tras la eutanasia y la decapitación de un ratón adulto, prepare una placa de Petri con LCR A frío y continuamente oxigenado y carbonatado. Después de retirar la mandíbula inferior, coloque la cabeza del ratón en la placa de Petri.

Coloque la cabeza del ratón bajo el microscopio de disección para visualizar el paladar. A continuación, realice una incisión horizontal en la parte superior del paladar con tijeras microquirúrgicas y luego retire la membrana del paladar con pinzas microdisectoras. Hidrate y limpie la cavidad expuesta con un LCR.

Corte la parte superior e inferior del tabique nasal. Luego, extraiga delicadamente el tabique nasal que contiene el VNO y colóquelo directamente en A CSF limpio de forma vertical. Separe las dos partes del VNO utilizando fórceps microquirúrgicos.

Identifique la cápsula cartilaginosa del órgano vomeronasal y luego retírela cuidadosamente, asegurándose de que se eliminen todos los fragmentos cartilaginosos. El órgano vomeronasal aislado, los fragmentos cartilaginosos y el órgano vomeronasal no disecado se indican aquí. En primer lugar, prepare agarosa al 3 % de punto de fusión bajo y luego prepare el área de trabajo con las herramientas necesarias. Llene el molde de inclusión con agarosa y asegúrese de que la temperatura esté por debajo de 41 grados Celsius antes de sumergir el órgano vomeronasal disecado. Coloque el tejido verticalmente para obtener cortes coronales.

Coloque el molde de inclusión sobre hielo durante un minuto hasta que el cilindro se solidifique. Después de un minuto, retire el bloque cilíndrico, corte el agar en forma paramedial y luego péguelo al soporte del microtomo utilizando el microtomo para cortar secciones coronales del órgano vomeronasal a una velocidad de 0,5 milímetros por segundo, una amplitud de 0,7 milímetros y un grosor de 100 micrómetros en LCR frío.

Recolecte las secciones de tejido con un pincel y colóquelas en una placa de cultivo de tejidos llena con A CSF frío para verificar la integridad estructural de las secciones recolectadas, que pueden fijarse y luego inmunotincionarse para componentes del citoesqueleto u otras proteínas de interés. Aquí, la inmunotinción contra tubulina acetilada en púrpura demuestra la integridad estructural de la sección de tejido. Además, la observación de una población neuronal específica en la que un receptor de feromonas particular ha sido marcado con GFP muestra la morfología neuronal conservada: neuronas con cuerpos celulares pequeños y ovalados y largas dendritas que alcanzan la superficie del lumen, terminando en microvellosidades, que pueden observarse trabajando en una habitación oscura.

Incube cortes del órgano vomeronasal en una solución de carga de ACSF frío con siete micromoles de URA 2:00 AM y 0,1 % tónico durante una hora a 37 grados Celsius tras una hora. Mantenga los cortes cargados sobre hielo con oxigenación hasta su uso. Utilice un pincel para colocar los cortes cargados en una cámara de perfusión que contenga ACSF y asegúrelos con un anclaje para cortes de tejido.

Coloque la cámara de perfusión sobre la platina del microscopio de un sistema de imagen de calcio y perfunda continuamente con A CSF oxigenado y carbonatado a temperatura ambiente. Observe las secciones cargadas del órgano vomeronasal utilizando las longitudes de onda de fluorescencia correspondientes al colorante, que son de tres 40 a tres 80 nanómetros para cuatro O 2:00 AM. Utilice el software adecuado para registrar los cambios en la relación de calcio intracelular. Se requiere un sistema de perfusión para inducir la estimulación química.

Aquí, una sección coronal del tejido del órgano vomeronasal de un ratón, en la que la subpoblación de neuronas que expresa el receptor de feromonas V1Rb2 también expresa GFP, se inmunomarcó frente a la proteína tubulina acetilada mostrada en morado. Vistas con mayor aumento de la sección demuestran la conservación de la integridad del tejido. Se observan neuronas con largas dendritas que alcanzan la superficie del lumen, y la expresión de la proteína estructural puede verse en los botones dendríticos y en las microvellosidades para la imagen de calcio.

Primero se visualizan cortes de tejido cargados con FU utilizando contraste de fase Hoffman para localizar el campo de interés, comenzando desde el vaso sanguíneo, la primera flecha blanca; el observador avanza lentamente hacia la luz, la segunda flecha blanca, y la región neuroepitelial. El cuerpo celular ovalado de la neurona nasal RO. La tercera flecha blanca puede identificarse por su dita larga y delgada.

La cuarta flecha blanca que se extiende hacia la luz, el botón dendrítico neuronal. La quinta flecha blanca señala microvellosidades en contacto con células cargadas de feromonas RA; aquí se muestran tres estructuras de 80 nanómetros que luego se iluminan secuencialmente a tres longitudes de onda de 40 y tres de 80 nanómetros, y esta relación de longitudes de onda fluorescentes se grafica correspondiendo a los cambios intracelulares de calcio en las neuronas seleccionadas, representadas por círculos negros, rojos y azules. Se utiliza un TP para determinar la viabilidad de las neuronas.

Observe el rango de respuestas de calcio exhibidas en las tres neuronas seleccionadas y el hecho de que la neurona número dos, marcada con un círculo rojo, no responde a un TP y, por lo tanto, será descartada del análisis posterior. Luego, se logra la estimulación química utilizando orina y una mezcla de feromonas de ratón, observando en profundidad la porción de tejido. Puede localizarse una subpoblación de neuronas que expresan tanto GFP como el receptor V uno RRB dos.

Aquí, se muestra una neurona que expresa tanto GFP como el receptor V1RB2 junto con una neurona que no expresa V1RB2. Ambas células están cargadas con URA 2:00 AM y la neurona que expresa V1RB2 muestra un pico de calcio en respuesta a la perfusión del ligando del receptor, dos hep conocido. Curiosamente, la neurona que no expresa V1RB2 también responde al dos hep conocido, lo que demuestra la complejidad del recubrimiento de feromonas en el VNO.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer y microdiseccionar el ratón para obtener el órgano de células mar con el fin de realizar la preparación aguda de cortes de tejido. Este protocolo también es adaptable para investigaciones fisiológicas utilizando colorantes alternativos de calcio y configuraciones de microscopio. Buena suerte con su experimento.