Name: Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprende a diseñar un biorreactor de presión cíclica para estudiar la mecanobiología de válvulas aórticas ex vivo. Este método permite analizar respuestas biológicas a diferentes condiciones de presión en tejido cardíaco.

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Los autores agradecen a Shad y Schipke Chesser Daniel por su ayuda con el diseño y fabricación del sistema y Myles Valtresa de asistencia con la preparación del manuscrito.

1. Tejido de cosecha y preparación <ol><li> Válvulas aórtica deben ser tomadas de cerdos adultos que no pesen más de 120 libras inmediatamente después de la muerte. </li><li> Lave las válvulas de dos veces con solución salina estéril tamponada de fosfato (PBS) y el transporte al laboratorio en hielo. </li><li> Todos los pasos posteriores se deben realizar bajo condiciones estériles. </li><li> Asegúrese de que los folletos no muestran ningún signo de degeneración, lagrimeo o calcificación. Quitar folletos de la raíz aórtica mediante la reducción de 1 / 3 de la distancia desde el anillo. </li><li> Folletos a cabo en los distintos pozos de una placa de seis pocillo e incubar durante la noche con 3 ml de Dulbecco modificado medio de Eagle suplementado con 1% de solución anti-biotic/anti-mycotic y el 10% de suero fetal bovino a 37 ° C y 5% CO 2. </li><li> Como una alternativa de células, aisladas pueden ser sembradas en placas de cultivo de seis pozos y se utiliza en el dispositivo de presión. Válvula de aislamiento de las células endoteliales y células intersticiales puede llevar a cabo como se describió previamente 13, 14. </li></ol> 2. Estudios de presión <ol><li> Un sistema de presión a medida ha sido diseñado para estudiar los efectos de la presión mechanobiological cíclico en el tejido de la válvula aórtica 15. </li><li> Inicie sesión en el ordenador y abrir el programa LabVIEW (Figura 1). </li><li> Calibración: <ol><li> Antes de la experimentación, el sistema debe estar bien calibrados. </li><li> Conecte la fuente de alimentación a la placa de circuito. Esto proporciona energía a las válvulas solenoides que controlan el flujo de aire dentro y fuera de la cámara. </li><li> Asegúrese de que el aire comprimido está conectado al sistema y abrir el suministro de aire a velocidad plena. </li><li> Encienda el amplificador de señal. Asegúrese de que la lectura de voltaje es de 0,00. Realice los ajustes necesarios </li><li> La interfaz de LabVIEW tiene un interruptor marcado "TEST / RECORD". Asegúrese de que el interruptor está en "TEST". Haga clic en el botón "Air Supply" para abrir la válvula solenoide de entrada. </li><li> Usando el regulador de presión de gas, presurizar la cámara con aire comprimido a un ISP. La presión en la cámara se pueden leer con el medidor de presión digital en la parte posterior de la placa terminal de la cámara. Una vez que la presión se equilibra, se registra la lectura de voltaje del amplificador de la señal. Repita el procedimiento para la ISP 2, 3, 4 y 5. </li><li> Construir una curva de calibración de presión función de la tensión. La presión debe ser convertida de PSI para mmHg. La ecuación de la gráfica se puede colocar en el código del programa LabVIEW </li></ol></li><li> Retire la placa frontal de aluminio de la cámara de presión y rocíe la cámara con un 70% de etanol. Deja por un mínimo de 10 minutos para permitir que los gases residuales de etanol a disiparse. </li><li> Coloque la placa de seis pozos que contienen las muestras de hoja en la cámara y vuelva a colocar la placa frontal. Asegúrese de que el sello hermético de apretar las tuercas ubicadas en las cuatro varillas roscadas (que se encuentra en cada esquina de la placa final) con la mano. Coloque la cámara de presión en la incubadora a 37 ° C. Un diagrama esquemático de la cámara de presión se muestra en la figura 2. </li><li> La interfaz le pedirá al usuario que proporcione la cantidad de tiempo entre los ciclos del sistema entrada de aire comprimido y de salida. Estos deben ser reguladas para las condiciones diastólica y sistólica y 0,6 s 0,4 s para imitar, respectivamente, a una frecuencia de 1Hz. El usuario debe entrar en una ruta de archivo de datos. </li><li> En LabVIEW, haga clic en Ejecutar y el interruptor "TEST / RECORD" cambiar a "RECORD". </li><li> Asegúrese de que la presión está en el nivel deseado con el gráfico de la interfaz de LabVIEW. La presión se puede ajustar con el regulador de presión de gas. </li><li> Ejecute el programa de tiempo deseado. </li><li> Una vez que el experimento se haya completado, haga clic en el botón de parada en LabVIEW, a su vez el suministro de aire y abra la válvula de escape en la cámara de presión. </li><li> Retire la placa frontal de la cámara y recuperar muestras de seis pozos placa que contiene. Muestras que ahora se puede analizar la expresión de genes, expresión de la proteína, la histología, propiedades mecánicas, etc </li></ol> 3. Los resultados representativos: El sistema de presión es capaz de simular las presiones máximas transvalvular observado en normotensos, la etapa I y II etapa de las condiciones de hipertensos. Sin embargo, la presión no era capaz de imitar el gradiente de presión sistólica, que es esencialmente cero en vivo. La frecuencia se mantiene a 1 Hz, con un tiempo de entrada de aire de 0,6 s y un tiempo de 0,4 s de escape. Formas de onda representante presión de las condiciones normales de presión y elevados obtenidos del sistema se puede ver en la figura 3. <img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1: Captura de pantalla de la interfaz de LabVIEW. <img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig2.jpg" alt="Figura 2"> Figura 2: Esquema de la cámara de vista de la presión A. isométrica de la cámara de presión, ver B. secundarios de la cámara de presión;C. Vista superior de la cámara de presión. <img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig3.jpg" alt="Figura 3"> Figura 3: Gráfico de simulación de la presión dentro de la cámara de presión en (A) normotensos, (B) Fase I hipertensos, y (C) Fase II las condiciones de hipertensos.

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El sistema de presión con éxito la válvula aórtica folletos expuestos a las presiones cíclicas que eran representativos de la presión diastólica transvalvular. Sin embargo, no fue capaz de imitar la presión sistólica transvalvular, como la única presión se redujo a 40 mmHg. Presión transvalvular es la diferencia entre la presión en la aorta ascendente y el ventrículo izquierdo. Durante la diástole, cuando la válvula está cerrada, la diferencia de presión es 80 mmHg en condiciones normotensos y 90 mmHg y 100 mmHg en la e...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5671 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco PBS </td><td> Sigma </td><td> D5652 </td><td></td></tr><tr><td> Solución Anti-mycotic/antibiotic </td><td> Sigma </td><td> A5955 </td><td></td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> Viton Las válvulas de diafragma de solenoide </td><td> McMaster Carr </td><td> 4868K11 </td><td></td></tr><tr><td> Transductor de presión </td><td> Omega Engineering, Inc. </td><td> PX302-200GV </td><td></td></tr><tr><td> De carga acondicionado celular </td><td> Encore Electronics, Inc. </td><td> 4025-101 </td><td></td></tr><tr><td> Adquisición de Datos (DAQ) Módulo </td><td> Measurement Computing </td><td> PMD1608 </td><td></td></tr></tbody></table>

diseño de un biorreactor de presión cíclica de la ex vivo estudio de las válvulas aórtica del corazón

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

La válvula aórtica, localizada entre el ventrículo izquierdo y la aorta, permite un flujo unidireccional de sangre, evitando el reflujo hacia el ventrículo. Folletos de la válvula aórtica se componen de células intersticiales suspendido dentro de una matriz extracelular (MEC) y se alinean con una monocapa de células endoteliales. La válvula resistente a un ambiente duro, dinámico y está constantemente expuesto a corte, flexión, tensión y compresión. Las investigaciones han demostrado lesiones calcificadas en las válvulas enfermas se producen en zonas de alto esfuerzo mecánico como consecuencia de la alteración del endotelio o daño de la matriz intersticial 1-3. Por lo tanto, no es de extrañar que los estudios epidemiológicos han demostrado que la hipertensión es un factor de riesgo en la aparición de la enfermedad de la válvula aórtica 4. La única opción de tratamiento actualmente disponibles para la enfermedad de la válvula es la cirugía de reemplazo de la válvula enferma por una válvula mecánica o bioprótesis 5. Una mejor comprensión de la biología de la válvula en respuesta a las tensiones físicas que ayudan a dilucidar los mecanismos de la patogénesis de la válvula. A su vez, esto podría ayudar en el desarrollo de terapias no invasivas, como la intervención farmacéutica o la prevención. Biorreactores varios han sido previamente desarrollado para estudiar la mecanobiología de las válvulas del corazón nativo o ingeniería 6-9. Biorreactores pulsátil también se han desarrollado para estudiar una amplia gama de tejidos incluyendo el cartílago 10, 11 huesos y la vejiga 12. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un sistema de presión cíclica que puede ser utilizado para dilucidar la respuesta biológica de la válvula aórtica a las cargas de mayor presión. El sistema consistía en una cámara de acrílico en el que colocar las muestras y producir una presión cíclica, viton válvulas de solenoide del diafragma para controlar el tiempo del ciclo de presión, y un ordenador para controlar los dispositivos eléctricos. La presión se controlará mediante un transductor de presión, y la señal se acondicionó con un acondicionador de la célula de carga. Un programa LabVIEW regula la presión usando un dispositivo analógico a la bomba de aire comprimido en el sistema a la velocidad adecuada. El sistema imita la dinámica de los niveles de presión transvalvular asociados con la válvula aórtica, una onda de diente de sierra produce un aumento gradual en la presión, típico de la gradiente de presión transvalvular que está presente a través de la válvula durante la diástole, seguida de una fuerte caída de presión que representa la apertura de la válvula en sístole. El programa LabVIEW permite a los usuarios controlar la magnitud y la frecuencia de presión cíclica. El sistema fue capaz de someter a las muestras de tejido de las condiciones de presión fisiológicos y patológicos. Este dispositivo se puede utilizar para aumentar nuestra comprensión de cómo las válvulas del corazón responder a los cambios en el entorno mecánico local.

Un biorreactor presión cíclica capaz de someter a los tejidos del corazón de la válvula de presión a las condiciones fisiológicas y patológicas ha sido diseñado. Un programa LabVIEW permite a los usuarios para controlar la presión magnitud, amplitud y frecuencia. Este dispositivo puede ser utilizado para estudiar el tejido mecanobiología de las válvulas del corazón o células aisladas.

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

La válvula aórtica, situada entre el ventrículo izquierdo y la aorta, permite el flujo unidireccional de la sangre, evitando el reflujo hacia el ventrículo. Aórtica...

El objetivo general de este procedimiento es determinar la respuesta biológica del tejido de la válvula cardíaca aórtica, o de sus células, a la presión cíclica. Esto se logra primero aislando el tejido valvular de corazones con signos deficientes e incubándolo en medio de cultivo tisular durante la noche. El segundo paso del procedimiento consiste en asegurar que el sistema de presión esté calibrado. A continuación.El tejido o las células valvulares se colocan en el sistema de presión. La cámara se coloca en un incubador a 37 grados Celsius y se inicia el régimen de presión cíclica durante el período deseado, a la magnitud y frecuencia deseadas. Finalmente, el tejido se retira del sistema para su análisis biológico.Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran cómo la presión elevada afecta la expresión génica y proteica mediante PCR en tiempo real, inmunotransferencia Western o microscopía. La principal ventaja de esta técnica es que podemos separar los efectos de la presión mecánica de otras fuerzas mecánicas y estimulantes bioquímicos. Esta es una ventaja frente a otras técnicas, como los modelos animales, aunque esta última puede utilizarse para ayudarnos a comprender la manera en que las fuerzas mecánicas influyen en la biología y en la patogénesis de las válvulas cardíacas.También se puede utilizar para desarrollar construcciones con tejidos ingenierizados. Demostrando este procedimiento para nosotros ahora es Toy Fate, un estudiante de posgrado en mi laboratorio, para preparar el tejido bajo presión.Los estudios recolectan válvulas aórticas de cerdas adultas que pesen no más de 120 libras inmediatamente después de la muerte. Lave las válvulas dos veces con PBS estéril, luego colóquelas sobre hielo y trasládelas al laboratorio. Todos los pasos subsiguientes deben realizarse bajo condiciones estériles.Asegúrese de que los velos no presenten signos de degeneración, desgarro o calcificación. Retire los velos de la raíz aórtica cortando un tercio de la distancia desde el anillo. Coloque los velos en pozos individuales de una placa de seis pozos e incube con tres mililitros de DMEM suplementado con una solución antibiótico antimicótica al 1% y suero bovino fetal al 10% durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.Este sistema de presión es personalizado y ha sido diseñado para estudiar los efectos mecanobiológicos de la presión cíclica en el tejido de la válvula aórtica. Para utilizar el sistema, inicie sesión en la computadora y abra el programa LabVIEW. Verifique que el aire comprimido esté conectado al sistema y abra el suministro de aire a máxima velocidad.Encienda el amplificador de señal. Asegúrese de que la lectura de voltaje sea 0.00. Ajuste según sea necesario.La interfaz de vista de laboratorio tiene un interruptor marcado como prueba de registro, con el interruptor en posición de prueba. Haga clic en el botón marcado como suministro de aire para abrir la válvula solenoide de entrada. Mediante el regulador de presión de gas, presurice la cámara con aire comprimido a una PSI. Lea la presión dentro de la cámara utilizando el manómetro digital ubicado en la placa trasera de la cámara.Una vez que la presión haya equilibrado, registre la lectura de voltaje del amplificador de señal. Repita para 2, 3, 4 y cinco PSI. A continuación, construya una curva de calibración de presión versus voltaje.Convierta la presión de PSI a milímetros de mercurio. Introduzca la ecuación del gráfico en el código del programa LabVIEW. Retire la placa frontal de aluminio de la cámara de presión y rocíe la cámara con etanol al 70 %.Coloque la placa de seis pocillos que contiene las muestras de folíolos en la cámara y reemplace la placa frontal. Asegúrese de que el sello sea hermético apretando las tuercas ubicadas en las cuatro varillas roscadas con la mano. Coloque la cámara de presión en el incubador a 37 grados Celsius.Introduzca la duración del ciclo del sistema entre la entrada y salida de aire comprimido. Estos valores deben establecerse en 0,6 segundos y 0,4 segundos para simular las condiciones diastólica y sistólica, respectivamente, a una frecuencia de un hercio. A continuación, introduzca una ruta de archivo de datos en LabVIEW.Haga clic en ejecutar y cambie el conmutador de grabación de prueba para iniciar la grabación. Verifique que la presión esté al nivel deseado utilizando la gráfica en la interfaz de LabVIEW. Si es necesario, ajuste la presión utilizando el regulador de presión de gas.Una vez que el experimento haya finalizado, haga clic en detener en la vista del laboratorio, apague el suministro de aire y abra la válvula de escape en la cámara de presión. Finalmente, retire el sistema de presión del incubador. Luego, retire la placa frontal de la cámara y saque la placa de seis pocillos.Las muestras ya pueden analizarse para evaluar la expresión génica, expresión proteica, histología y propiedades mecánicas que representan formas de onda de presión normales y elevadas. Las condiciones obtenidas del sistema se muestran aquí bajo condiciones in vivo. Existe una diferencia de presión entre el ventrículo izquierdo y la aorta ascendente durante la diástole que permite que la válvula aórtica permanezca cerrada bajo condiciones fisiológicas normales.Esta presión transvalvular es de 80 milímetros de mercurio. Sin embargo, en la etapa uno y la etapa dos de hipertensión, la presión transvalvular puede aumentar a 90 y 100 milímetros de mercurio, respectivamente. El sistema de presión es capaz de simular las presiones transvalvulares máximas observadas bajo condiciones normotensivas, de hipertensión en etapa uno y en etapa dos.Se muestran aquí formas de onda de presión representativas de condiciones normales y de presión elevada obtenidas a partir del sistema. Así, siguiendo este procedimiento, podemos realizar otros métodos como PCR, inmunotransferencia western y microscopía sobre los velos valvulares. Esto nos ayuda a comprender aspectos como los cambios en la expresión génica y la síntesis de proteínas, y nos permite entender la mecanotransducción en las válvulas cardíacas.Esta técnica ha sido muy útil para ayudarnos a comprender la biología mecánica y los mecanismos de la enfermedad, y ha podido, o podrá en el futuro, ayudarnos a entender los cambios que ocurren en otros tejidos que podrían experimentar variaciones de presión in vivo.

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La regurgitación aórtica es una enfermedad cardíaca de la válvula aórtica. Este manuscrito demuestra cómo las imágenes de resonancia magnética de flujo cuatridimensional pueden evaluar la regurgitación aórtica utilizando válvulas cardíacas in vitro que imitan la regurgitación aórtica.

In vitro Evaluación de la regurgitación aórtica mediante imágenes de resonancia magnética de flujo cuatridimensional

Los tejidos cardíacos tridimensionales biodiseñados con cardiomiocitos derivados de células madre han surgido como modelos prometedores para estudiar el miocardio humano sano y enfermo in vitro , al tiempo que recapitulan aspectos clave del nicho cardíaco nativo. Este manuscrito describe un protocolo para la fabricación y el análisis de tejidos cardíacos de ingeniería de alto contenido generados a partir de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas.

Diseño de un biorreactor para mejorar la adquisición de datos y el rendimiento del modelo de tejidos cardíacos diseñados

Este protocolo presenta la configuración y el funcionamiento de un biorreactor impreso en 3D recientemente desarrollado para el cultivo ex vivo de vasos sanguíneos en perfusión. El sistema está diseñado para ser fácilmente adoptado por otros usuarios, práctico, asequible y adaptable a diferentes aplicaciones experimentales, como biología básica y estudios farmacológicos.

Ex Vivo Cultivo de perfusión de grandes vasos sanguíneos en un biorreactor impreso en 3D

Presentamos un método para montar una válvula aórtica porcina en un duplicador de pulsos para probar sus propiedades hidrodinámicas. Este método se puede utilizar para determinar el cambio en la hidrodinámica después de la aplicación de un procedimiento experimental o un nuevo dispositivo médico antes de su uso en un modelo animal grande.

Un modelo porcino ex vivo para pruebas hidrodinámicas de procedimientos experimentales de válvulas aórticas y nuevos dispositivos médicos

Prueba Microtracción ambientalmente controlado mecánicamente de adaptación nanocompuestos poliméricos para<em&gt; Ex vivo</em&gt; Caracterización

Aprende a diseñar un biorreactor de presión cíclica para estudiar la mecanobiología de válvulas aórticas ex vivo. Este método permite analizar respuestas biológicas a diferentes condiciones de presión en tejido cardíaco.

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

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