Celular del cáncer colorrectal superficie de la proteína perfiles con un microarray de anticuerpos y la multiplexación de fluorescencia

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar el microarreglo de anticuerpos DOT scan para realizar un perfil molecular de los antígenos de superficie en tejido de cáncer colorrectal. Además, se emplea la multiplexación fluorescente para distinguir los tipos celulares con perfiles específicos dentro de la población mixta. Los antígenos de diferenciación celular o antígenos CD han sido identificados como posibles biomarcadores pronósticos o metastásicos en el cáncer colorrectal.

Estos antígenos son biomarcadores ideales, ya que su expresión suele cambiar con la progresión del tumor o la interacción con otros tipos celulares. En este video, empleamos la matriz microscópica de anticuerpos DOT scan para capturar células vivas mediante los antígenos superficiales expresados. La matriz microscópica de anticuerpos DOT scan consiste en un portaobjetos de vidrio con una capa de nitrocelulosa.

El panel de micromatriz de anticuerpos DOT scan está delimitado por puntos de alineación compuestos por CD29 y CD44. También se colocan matrices duplicadas a cada lado de la matriz. El primer panel consiste en los 82 anticuerpos originales de la micromatriz de leucemia DOT scan, y se seleccionaron 40 anticuerpos adicionales en función de su potencial pronóstico para conformar la micromatriz satélite de cáncer colorrectal.

Y el último panel consiste en anticuerpos de control de tipo isotópico. Aquí, el tejido de cáncer colorrectal y la mucosa intestinal normal se digieren y filtran para obtener una suspensión viable de células individuales. La suspensión puede congelarse o almacenarse para su uso posterior.

La suspensión celular se utiliza para la captura de células en un microarreglo de anticuerpos DOT scan; los antígenos expresados en diferentes subtipos celulares se perfilan mediante multiplexación por fluorescencia. Los perfiles de expresión resultantes muestran un cambio significativo en la expresión de antígenos entre las células de cáncer colorrectal y la mucosa intestinal normal. Esta diferencia también se refleja en la población de leucocitos asociada al tumor.

El agrupamiento jerárquico de varios perfiles tumorales muestra la agrupación de firmas de enfermedad con los estadios del cáncer colorrectal. Hola, soy Jerry de la Escuela de Biotecnología Molecular de la Universidad de Sydney, Australia, y hoy les mostraré un experimento para el perfilado de antígenos de superficie en tejido de cáncer colorrectal. Mediante una matriz microperforada de anticuerpos y multiplexación por fluorescencia, las matrices microperforadas permiten el perfilado de aproximadamente 140 antígenos de superficie en células cancerosas vivas junto con los leucocitos inflamatorios asociados.

Los subconjuntos de células capturados en microarreglos pueden distinguirse mediante anticuerpos marcados con fluorescencia que se unen a un antígeno marcador altamente expresado en las células de interés. Se pueden analizar hasta tres subconjuntos diferentes de células en un solo microarreglo utilizando etiquetas fluorescentes adecuadas en anticuerpos con tres especificidades distintas. El ensayo de microarreglo DOT scan es un método relativamente sencillo y ya se ha utilizado para el perfilado de la superficie celular en varios tipos de cáncer.

Una característica clave del análisis DOT es su capacidad para capturar células vivas mediante sus antígenos de superficie, por lo que el patrón de unión que obtenemos refleja el perfil de superficie celular. Los antígenos de superficie desempeñan un papel importante en el desarrollo tumoral y en la metástasis, así como en la respuesta inflamatoria para combatir el cáncer. Perfiles extensos de superficie o inmunofenotipos pueden utilizarse como firmas de enfermedad para mejorar la clasificación del cáncer, permitiendo un tratamiento óptimo tras la cirugía.

Vale, comencemos. En el experimento que se muestra aquí, se recogen muestras tumorales clínicas de cáncer colorrectal, grados A a D, en tampón de Hank. Para comenzar, usando dos escalpelos, se corta cuidadosamente el tumor en rebanadas delgadas de un milímetro de grosor.

Coloque las secciones en una solución de colagenasa tipo cuatro al 2 % y ADN al 10 % para la digestión. Se recogen secciones de mucosa intestinal normal del mismo paciente a 10 centímetros de distancia del sitio del tumor primario. Esto sirve como nuestro control y se procesa de manera idéntica a la muestra tumoral.

La digestión del tumor se lleva a cabo a 37 grados Celsius durante una hora para favorecer la degradación del tejido conectivo; las D ns eliminarán el ADN de cualquier célula dañada. Tras la incubación, la suspensión de tejido se filtra a través de una malla metálica, lavando con buffer de Hanks sobre la muestra mientras se utiliza el émbolo de una jeringa de 10 ml para ayudar a hacer pasar las células a través de la malla. Este proceso se repite varias veces hasta que la mayoría de las células hayan atravesado la malla metálica.

La malla separa las células del tejido conectivo no digerido. A continuación, filtre aún más la suspensión celular aspirándola con una jeringa de 10 mL y filtrándola a través de un filtro de 200 micrómetros seguido por un filtro de 50 micrómetros. Estos filtros más finos deben garantizar la eliminación del exceso de moco o ADN, así como la disgregación de los agregados celulares para obtener una suspensión viable de células individuales.

El mismo tratamiento se realiza para la mucosa normal. Descubrimos que la mucosa normal tiende a contener más tejido conectivo y, como resultado, requiere algunos lavados adicionales para pasar a través de la malla. Centrifugar la suspensión celular a 410 G durante cinco minutos a 20 grados Celsius. En preparación para el almacenamiento en frío, se suspende el pellet celular con 750 microlitros de suero de ternero fetal, seguido de volúmenes ecológicos de suero de ternero fetal con DMS.

Entonces, agregue la solución gota a gota en este DMS, con mezcla constante. Transfiera alícuotas del sobrenadante a un tubo criogénico y coloque en un recipiente aislante. Estas muestras pueden almacenarse a menos 80 durante hasta un año.

El aislamiento y el DMSO deben garantizar que las células se congelen lentamente sin romperse. Un efecto secundario del almacenamiento es la lisis de la población de glóbulos rojos. Afortunadamente para nosotros, no son necesarios.

Para el experimento, retire las muestras del almacenamiento y deséchelas rápidamente. En un baño de agua a 37 grados Celsius, re suspenda el suspensión celular en 10 mL de tampón de Hank; el tampón ayudará a diluir el 10 % de DMSO y el suero de ternero fetal. Incube las células durante cinco minutos a 410 ×g y 20 grados Celsius.

A continuación, decante el sobrenadante y resuspenda en 500 microlitros de tampón de Hank; algunos pocos células pueden romperse durante el proceso de congelación y descongelación, provocando la liberación de ADN en la suspensión. Para contrarrestar este problema, incube la muestra con 0,1 % DNAsa a temperatura ambiente. Durante este tiempo, se puede realizar un recuento de viabilidad celular.

Mezcle cantidades iguales de triam azul con 10 microlitros de suspensión celular y pipete 10 microlitros de la mezcla en un contador de células. Bajo el microscopio, las células sanas y viables aparecen transparentes. Por otro lado, las células no viables, cuyas membranas están interrumpidas, aparecerán en color azul.

Se requiere un mínimo de 4 millones de células viables para la captura celular en el anticuerpo DOT scan. MICRORAY cayendo. El tratamiento con ADN lavó las células por segunda vez con 10 mils de tampón de Hank y centrifugó a 410 G durante cinco minutos y 20 grados Celsius.

Suspendemos la paleta celular final con 200 microlitros de medio RPMI. Este medio contiene relativamente más nutrientes que el tampón de Hanks y se utiliza para facilitar la captura celular en la matriz microsabrida de anticuerpos, manteniendo al mismo tiempo la viabilidad celular. La matriz microsabrida de puntos de anticuerpos para detección de cáncer colorrectal consta de 140 puntos de anticuerpos diferentes duplicados sobre nitrocelulosa.

Cada punto en la matriz contiene 10 nanolitros de un anticuerpo monoclonal contra el antígeno de superficie celular. Para preparar la matriz de anticuerpos, sumérjala en una bandeja de PBS para humedecer el nitrocelulosa y limpie el borde de vidrio de la matriz. Con toallas Kim, tenga cuidado de no tocar la sección de nitrocelulosa, coloque la matriz en una bandeja e introduzca la suspensión celular sobre la nitrocelulosa mediante pipeta.

Una distribución uniforme de la suspensión celular garantizará que todos los anticuerpos tengan la posibilidad de capturar células. Incube el microarreglo a 37 grados Celsius durante una hora. Durante la incubación, diferentes células descenderán y entrarán en contacto con los anticuerpos sobre las células del arreglo.

Presentar antígenos superficiales correspondientes a su anticuerpo permitirá la unión y captura de la célula tras la incubación. Lave las células no unidas sumergiendo suavemente las matrices en tres cambios de PPS fresca. Fije las células rebotadas en una solución de PPS al 10% desde la altura exterior.

Pipetee suavemente una cantidad generosa de fijador para cubrir la sección cargada de la nitrocelulosa. Incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, sumerja los microarreglos tres veces en PBS fresco.

Deje las matrices en PBS para que se remojen durante 30 segundos en cada lavado, ya que el exceso de altura anterior puede interferir con la multiplexación de fluorescencia. Ahora podemos verificar si tenemos unión celular sosteniendo una micromatriz bajo cierta luz para un análisis mucho más preciso. El escáner DOT y el software de análisis nos permiten escanear el patrón de unión y producir resultados cuantificados de la expresión de antígenos en una población mixta de células.

El software compara la intensidad de la unión celular con el ruido de fondo en una escala de grano de ocho bits. Las unidades de intensidad se normalizan a un valor máximo de 256. Para facilitar la comparación entre un arreglo, cualquier unión positiva del control de tipo de hielo se deduce de los anticuerpos con los isotipos IG correspondientes.

Añada 200 microlitros de tampón de bloqueo al microarreglo e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Como preparación para la multiplexación de fluorescencia, en 118 microlitros de tampón de bloqueo añada 10 microlitros de CD tres conjugado con fiery y 20 microlitros de epam conjugado con Alexa. Además, se añaden también dos microlitros de suero inactivado al medio para evitar la unión no específica.

Una vez completado el bloqueo, el tampón de bloqueo se reemplaza con la solución de multiplexación y se incuba a oscuras durante 30 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, los tres anticuerpos conjugados CD se unirán a las células T que expresan CD tres unidas a la matriz, mientras que el anticuerpo conjugado con EPAM se unirá a las células epiteliales o a las células de cáncer colorrectal en la matriz. A continuación, lave la micromatriz tres veces con PBS fresco, déjela secar a oscuras antes de escanear la fluorescencia.

La fluorescencia se detecta con un escáner Typhoon FLA 9,000 cd. El perfil de FICO ery se escanea utilizando un láser de 523 nanómetros y un filtro de emisión 580 BP 30 EP camm Alexa 647 se escanea utilizando un láser de 633 nanómetros y un filtro de emisión de 670 BP 30. Las imágenes fluorescentes resultantes se convierten al formato tip para su análisis.

Mediante el uso de un software de escaneo DOT. La multiplexación fluorescente nos permite distinguir los perfiles de antígenos de diferentes poblaciones celulares dentro de la misma muestra de tejido. Las imágenes mostradas aquí provienen de una muestra de cáncer colorrectal.

Estas tres imágenes corresponden a una exploración óptica, una exploración fluorescente para células que expresan CD3 y una exploración fluorescente para células que expresan EPAM. Los resultados del microrayo DOT deben mostrar patrones de unión celular consistentes entre los dos portaobjetos duplicados. La unión intensa de puntos de alineación a lo largo del borde del portaobjetos indica que se capturaron cantidades adecuadas de células.

Se puede generar un informe en formato PDF para proporcionar valores cuantitativos de la unión celular. El gráfico de barras. La representación de la unión celular muestra una diferencia en la expresión de antígenos entre la mucosa normal y la muestra tumoral.

Los resultados ópticos dieron una representación general de la expresión de antígenos en todos los tipos celulares dentro de la muestra; los resultados de multiplexación AAM muestran una imagen más clara de la diferencia en la expresión de antígenos entre las células epiteliales normales y las células cancerosas. Aunque muchos de los antígenos expresados diferencialmente son biomarcadores conocidos del cáncer colorrectal como grupo, proporcionan una firma de enfermedad mucho más precisa para la estratificación de lo que cualquier biomarcador individual puede lograr. Los resultados de multiplexación CD tres muestran más células T en la muestra cancerosa en comparación con la normal.

A menudo, los linfocitos T de cáncer expresan marcadores de activación, lo que sugiere la posibilidad de que estos linfocitos T sean linfocitos infiltrantes del tumor o linfocitos T asociados a inflamación. Se puede realizar un análisis a gran escala mediante el visor de múltiples experimentos versión 4.4, un software de código abierto para mapas de calor y análisis de datos. El agrupamiento jerárquico de muestras de cáncer colorrectal puede utilizarse para correlacionarlo con la etapa de la enfermedad o el pronóstico del paciente.

Una biblioteca extensa de firmas de enfermedad es una herramienta valiosa para la predicción del pronóstico en pacientes con cáncer colorrectal o para determinar el curso del tratamiento posoperatorio. Acabamos de mostrarle el procedimiento para analizar la expresión de antígenos de superficie en una población celular mixta en tejido de cáncer colorrectal, utilizando la matriz microperforada de anticuerpos DOT scan y la multiplexión por fluorescencia. Un aspecto importante de este experimento que debe recordarse es que siempre se debe usar tejido fresco y se requieren al menos 4 millones de células viables para que este experimento funcione. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.