Name: Un ensayo funcional de sangre completa para medir la viabilidad de las micobacterias, usando Reporter-Gene Tagged BCG o M. tuberculosis (BCG Lux / M. Tb Lux) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprende a medir la actividad metabólica de micobacterias en sangre completa mediante bioluminescencia en tiempo real. Este ensayo evalúa las interacciones entre micobacterias y células inmunitarias del huésped.

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Este trabajo fue financiado por becas de personal de la Wellcome Trust para Beate Kampmann (056.608, GRO77273).

1. Preparación de las acciones de BCG reportero lux micobacterias <ol><li> Crecer BCG lux (M. bovis BCG cepa Montreal transformadas con el plásmido lanzadera pSMT1) con agitación a 200 rpm hasta mediados de la fase logarítmica en caldo Middlebrook 7H9 que contenía 0,2% de glicerol, 0,05% entre 80 y 10% de enriquecimiento ADC. </li><li> Prepare 1 ml de una dilución de 1:10 de la BCG cultura lux en PBS estéril en un tubo luminómetro (900μl PBS + 100μl BCG cultura lux) por duplicado. </li><li> Carga del tubo que contiene N-decil aldehído (sustrato de la enzima luciferasa) en la parte posterior de la máquina y asegurarse de que la tapa esté asegurada y los tubos en su lugar. </li><li> Primer luminómetro inyector con el sustrato a través del programa principal, ajustado a inyectar 100 UCL x 3 en cada uno de 3 tubos de cebado vacío colocado en el luminómetro. </li><li> La carga de los 2 tubos en el luminómetro y tomar las lecturas a través de un programa conjunto de inyectar 100 UCL de sustrato en cada tubo y leer durante 20 segundos en intervalos de 1 seg. </li><li> Cuando la acción ha llegado a 1x10 8 RLU / ml a 2x10 8 RLU / ml (esto tarda unos 3-4 días de crecimiento), añadir un volumen igual de glicerol estéril al 30% a la cultura en un tubo de 50 ml de halcón y mezclar suavemente. </li><li> Alícuota de 1,5 ml los volúmenes de 2 ml en un recipiente etiquetado con tapón de rosca microtubo y almacenar a -80 ° C. </li></ol> 2. La determinación de valores de RLU / UFC correlación y el contenido de las alícuotas <ol><li> Añadir 15 ml de medio Middlebrook 7H9 cultura con un 10% suplemento ADC a un matraz Erlenmeyer de 200 ml con un tapón ventilado. </li><li> Añadir 15μl de higromicina y 30μl de 20% de Tween. </li><li> Saca una ampolla de la vacuna BCG lux del congelador y descongelar a temperatura ambiente (TA) en el gabinete de seguridad. Añadir el contenido del vial en el medio y apretar la tapa. </li><li> Incubar con agitación a 200 rpm a 37 ° C durante 4 días. </li><li> En cada día, conforman serie de 10 diluciones (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 y 1:100.000) para la determinación de UFC. </li><li> Establecer las mismas diluciones en paralelo y duplicado para determinar la luminiscencia (véase la parte 1.2 hasta 1.6). </li><li> Prepare dos de 3 compartimientos placas de agar Middlebrook 7H11 (1 l de medio líquido que contiene 0,5% de glicerol, 10% de suplemento OADC, 1 ml de Tween 20% y 1 ml de higromicina). </li><li> Placa de 100μl de cada dilución en un segmento de cada placa con crucetas por separado, la distribución del líquido por igual a través de la cámara individual. </li><li> Sellar cada placa con parafilm, colóquela en una bolsa de plástico estéril, selle con cinta de autoclave, y se incuba a 37 ° C durante 2 semanas con las tapas hacia abajo. </li><li> Inspeccione periódicamente hasta UFC aparecen (2-3 semanas). </li><li> Para contar las colonias, quitar las placas de la incubadora y el lugar en un contador de colonias. Calcular la media para cada dilución de las placas duplicadas. </li><li> Calcular la razón de RLU / UFC utilizando equivalente RLU y el recuento de UFC por cada dilución. La relación debe ser de entre 3 y 5 RLU / UFC. </li></ol> 3. Preparación de la vacuna BCG cultura lux para su inoculación en sangre total <ol><li> Añadir 15 ml de medio Middlebrook 7H9 cultura con un 10% suplemento ADC a un matraz Erlenmeyer de 200 ml con un tapón ventilado. </li><li> Añadir 15μl de higromicina y 30μl de 20% de Tween. </li><li> Saca una ampolla de la vacuna BCG lux del congelador y descongelar a temperatura ambiente en el gabinete de seguridad. Añadir el contenido del vial en el medio y apretar la tapa. </li><li> Incubar con agitación a 200 rpm a 37 ° C durante 2 a 4 días. </li><li> Prepare 1 ml de una dilución de 1:10 de la BCG cultura lux en PBS estéril en un tubo luminómetro (900μl PBS + 100μl BCG cultura lux) por duplicado. </li><li> Primer luminómetro con el sustrato (como se describió anteriormente), suavemente vórtice de los 2 tubos y carga en el luminómetro y tomar las lecturas (como se describió anteriormente). </li><li> Use esta lectura para diluir por la cultura en PBS para dar un equivalente de 7x10 6 RLU (esto le dará un inóculo de aproximadamente 2x10 5 UFC / ml de sangre y una relación de BCG a los monocitos de aproximadamente 1:1, asumiendo un recuento de monocitos de de 2x10 5 4x10 5 de monocitos por ml de sangre). </li></ol> 4. Preparación de sangre entera <ol><li> Tomar de 3 a 5 ml de sangre venosa en un tubo con heparina sin conservantes. </li><li> La transferencia de la sangre a un tubo de 50 ml halcón y diluir con un volumen igual de RPMI 1640 con HEPES 25 mM de glutamina y (no penicilina / estreptomicina). </li><li> 900μl alícuota de sangre diluida por triplicado en tubos estériles bijou para cada momento (6 tubos en total: 3. 0hrs de 96 horas y 3 para Establecer tubos adicionales para los puntos de tiempo adicional, si es necesario. </li><li> 900μl alícuota del medio Middlebrooks cultura 7H9 con ADC de 10% de suplemento higromicina + 50μg/ml (el mismo medio que utiliza para la cultura de la BCG lux) por duplicado para los controles de crecimiento. </li><li> Agregar 100μl de los gases de BCG lux a cada tubo de sangre, y para el control de un crecimiento del 2los tubos. </li><li> Mezclar bien y colocar el 3 bijous para el 96 h de duración punto y el 2, controla el crecimiento de su lado en la incubadora oscilante a 37 ° C, 20 rev / min (CO 2 no es obligatorio). </li></ol> 5. Luminiscencia de medición (a 0hr y 96 horas) <ol><li> Centrifugar los 3 bijous a 2000 g durante 10 minutos. </li><li> Retire con cuidado 300μl de sobrenadante sin perturbar el precipitado y el lugar de 2 ml con tapa de rosca microtubos para congelar a -80 ° C para el análisis posterior de citocinas. </li><li> Agregar 300μl de PBS a cada uno de bijou para reemplazar el volumen de sobrenadante retirado. </li><li> Aspirar el contenido de cada joya en el correspondiente tubo Falcon de 50ml y añadir 8 ml de agua destilada a cada tubo. Iniciar un temporizador de 10 minutos. Nota: Este es un paso sensible al tiempo, y la incubación no debe haber más de 10 minutos, a partir de cuando las primeras células entran en contacto con el agua. </li><li> Enjuague cada bijou con 2 ml de agua destilada y agitar durante 5 segundos antes de inflexión en el correspondiente tubo Falcon. </li><li> Al final de la incubación de 10 minutos, centrifugar los tubos falcon en 2000 g durante 10 minutos. </li><li> Decantar el sobrenadante en Surfanios desinfectante. </li><li> Añadir algunas perlas de vidrio para cada pastilla y agitar. </li><li> Añadir 1 ml de PBS estéril a cada tubo y agitar. </li><li> En los tubos de luminómetro, hacer diluciones 1:10 de cada muestra por duplicado con PBS (900μl PBS + 100μl de la muestra) y 96 h en el momento de punto. Hacer las mismas diluciones de cada uno de los controles de crecimiento. </li><li> Suavemente en el Vórtex y la carga en el luminómetro y tomar las lecturas (como se describió anteriormente) Nota: Las lecturas entre triplicado de la misma muestra deben estar dentro del 15% de uno a otro. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Es importante la utilización de bacterias en fase logarítmica de crecimiento para toda la sangre de los ensayos de lux, es decir, creció más de 48-72 horas antes de la inoculación de las muestras, como la actividad metabólica no es óptima, si bien en línea recta de la nevera o en fase estacionaria. El crecimiento antes debe estandarizarse para una serie de experimentos a 48 o 72 horas para evitar la variabilidad. La figura 1 muestra la curva de crecimiento de una cultura de representante de BCG lux. El tiempo de duplicación es de aproximadamente 24 horas hasta que se alcanza la fase estacionaria. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Representante de la curva de crecimiento de BCG lux durante 96 horas en medio 7H9 y la correlación de RLU y UFC. Aunque los valores de RLU siempre se correlaciona con la UFC, el número de RLU que corresponde a una sola UFC puede variar dependiendo de las acciones, por lo que es una buena práctica para utilizar el stock congelado misma a través de una serie de experimentos para garantizar una multiplicidad de infección constante ( MOI). La Tabla 1 muestra un ejemplo de la fecha de primas en el momento de la inoculación (T 0) y en 96 horas. Los ratios de crecimiento se calculan utilizando la fórmula T 96 / T 0, pero los intervalos de tiempo de otros, por supuesto, también puede ser medido. Es, sin embargo, no se recomienda el uso de las culturas más allá de 96 horas, como la muerte celular significativa. <img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/3332/3332table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabla 1"> Tabla 1. Ejemplo de los datos en bruto en el momento de la inoculación (T0) y en 96 horas (T96) y se calcularon los cocientes de crecimiento de 3 donantes adultos. Dependiendo de las respuestas antígeno-específicas de la memoria disponible y el recuento de neutrófilos, posiblemente, también, las tasas de crecimiento varían entre los individuos, como se muestra en la Figura 2 en la sangre de los niños con y sin infección por el VIH. En promedio, los niños pequeños tienen mayores tasas de crecimiento que los adultos, prueba de la tuberculina (TST) + personas han tienen menores tasas de crecimiento que las personas han TST-, y los pacientes con VIH tienen altas tasas de crecimiento debido a la deficiencia de la población de células T CD4, uno de los principales mediadores de la respuesta inmune celular a la micobacteria. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 variabilidad entre los donantes:. Ratios de crecimiento de T 0 frente a 96 horas por un grupo de pacientes, dependiendo de la situación subyacente de VIH. Reproducibilidad de los ratios de crecimiento durante un período de tiempo se muestra en la figura 3, que resume los resultados de 64 donantes sangrado dos veces en un período de 12 meses y de un solo donante sangrado varias veces para los experimentos de control. Entre las posibles causas de la variabilidad podría haber cambios en la sensibilidad de micobacterias o la variabilidad en los niveles de citocinas de acogida, como se observa en muchos bioensayos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. (A) solo donante en 12 ocasiones en 12 meses. (B) varios (64) donantes en 2 ocasiones más de 12 meses.

<ol><li>Cheng, S. H., Walker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+increased+anti-mycobacterial+activity+in+peripheral+blood+monocytes+after+BCG+vaccination+in+British+school+children%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children.</a> Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).</li>
<li>Cheng, S. H., Walker, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+antimycobacterial+activity+before+and+after+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+in+Chingleput%2C+India%2C+and+London%2C+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom.</a> Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).</li>
<li>Silver, R. F., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+human+monocytes%3A+virulence+correlates+with+intracellular+growth+and+induction+of+tumor+necrosis+factor+alpha+but+not+with+evasion+of+lymphocyte-dependent+monocyte+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions.</a> Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).</li>
<li>Hoft, D. F., Worku, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+relationships+between+immune-mediated+inhibition+of+mycobacterial+growth+and+other+potential+surrogate+markers+of+protective+Mycobacterium+tuberculosis+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity.</a> J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).</li>
<li>Worku, S., Hoft, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+control+and+antigen-specific+T+cells+on+intracellular+mycobacterial+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth.</a> Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).</li>
<li>Kampmann, B., Gaora, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+human+antimycobacterial+immunity+using+recombinant+reporter+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria.</a> J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).</li>
<li>Cheon, S. H., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).</li>
<li>Janulionis, E., Sofer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+activity+of+orally+administered+clofazimine+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis+in+whole-blood+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).</li>
<li>Kampmann, B., Tena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+human+in+vitro+system+for+evaluating+antimycobacterial+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines.</a> Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).</li>
<li>Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+antimycobacterial+immune+responses+in+HIV-infected+children+receiving+HAART%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART.</a> Aids. 20, 1011-1018 Forthcoming.</li>
<li>Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+dose+of+vitamin+D+enhances+immunity+to+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria.</a> Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Ensayos bactericidas en el contexto de la investigación vacunas contra la tuberculosis están bien establecidos en modelos animales, donde se aplican a la pantalla de vacunas potencialmente prometedores. La reducción de la carga bacteriana en las funciones de varios órganos como la principal lectura de la inmunogenicidad. La primera generación de humanos ensayos bactericidas fueron diseñados utilizando los macrófagos solo, infectadas con el M. tuberculosis. UFC sirvió como la princip...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> No gato </td></tr><tr><td> BCG lux </td><td> Varios </td><td> n / a </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H11 agar </td><td> Becton Dickinson </td><td> 283810 </td></tr><tr><td> Caldo de Middlebrook 7H9 </td><td> BD Biosciences </td><td> 271310 (500g) </td></tr><tr><td> Middlebrook ADC enriquecimiento </td><td> BD Biosciences </td><td> 212352 </td></tr><tr><td> Middlebrook OADC suplemento </td><td> Becton Dickinson </td><td> 212240 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 274364 </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G5150 </td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 (20 ml) </td></tr><tr><td> N-decil aldehído </td><td> Sigma </td><td> D7384-100G </td></tr><tr><td> Etanol (&gt; 99,7%) </td><td> VWR </td><td> 101077 </td></tr><tr><td> PBS estéril </td><td> En Casa </td><td> n / a </td></tr><tr><td> RPMI-1640 con L-Glutamina, HEPES 25 mM </td><td> Sigma </td><td> R0883 </td></tr><tr><td> El agua destilada estéril </td><td> En Casa </td><td> n / a </td></tr><tr><td colspan="3"> Equipo </td></tr><tr><td> Tubo luminómetro (puerto inyectable obligatorio) </td><td> Berthold AutoLumat LB953 o de un solo tubo de Sirius luminómetro </td><td></td></tr><tr><td> Tubos luminómetro, 12 x 75 mm, pyrex sin montura </td><td> Corning de VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Erlenmeyer con tapones ventilados, estéril 250 ml de policarbonato </td><td> Corning a través de Fisher Scientific </td><td> 2150329 </td></tr><tr><td> BD Vacutainer tubos de extracción de sangre (heparina sin conservantes) </td><td> BD </td><td> 367676 </td></tr><tr><td> 50 ml Falcon tubos cónicos </td><td> BD </td><td> 352077 </td></tr><tr><td> 7ml Sterilin muestra de polipropileno bijou tubos </td><td> VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Sterilin Universal de los contenedores (30 ml) </td><td> Laboratorio de Análisis LTD </td><td> 128C </td></tr><tr><td> Cuentas de vidrio de 2 mm de diámetro </td><td> SigmaAldrich </td><td> Z143928 </td></tr><tr><td> 10 ml pipetas y pipetas niño </td><td> cualquier </td><td></td></tr><tr><td> 1000μl y 200μl pipetas y puntas con filtro </td><td> cualquier </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Equipo de laboratorio: </td></tr><tr><td> Clase II gabinete de seguridad del gabinete </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Refrigerador (4 ° C) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrífugo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mecedora agitador de plataforma (180 0) para mezclar los tubos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agitador incubadora a 37 ° C para crecer cultivos bacterianos </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo funcional de sangre completa para medir la viabilidad de las micobacterias, usando reporter-gene tagged bcg o m. tuberculosis (bcg lux / m. tb lux)

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Ensayos funcionales han desempeñado un papel clave en la medición de la inmunogenicidad de una vacuna administrada. Esto se expresa convencionalmente como suero títulos bactericidas. Los estudios de títulos bactericidas séricos en respuesta a las vacunas infantiles nos han permitido desarrollar y validar niveles de corte de la respuesta inmunitaria protectora y como corte-offs son de uso rutinario. No hay tales pruebas se han llevado adelante en la evaluación de rutina de las vacunas que inducen principalmente inmunidad mediada por células en forma de respuestas de células T efectoras, tales como vacunas contra la tuberculosis. En el modelo animal, el rendimiento de un candidato a vacuna dada es evaluada en forma rutinaria en los ensayos normalizados bactericida, y todos los actuales nueva vacuna contra la tuberculosis, los candidatos han sido sometidos a este paso en su evaluación antes de la fase 1 de ensayos humanos. La evaluación de la inmunogenicidad y por lo tanto, la probabilidad de eficacia protectora de la novela de vacunas contra la tuberculosis idealmente deben ser sometidos a un similar paso a paso la evaluación de los modelos humanos ahora, incluyendo las mediciones en los ensayos de bactericidas. Ensayos bactericidas en el contexto de la investigación sobre la tuberculosis vacuna ya están bien establecidos en los modelos animales, donde se aplican a la pantalla de vacunas potencialmente prometedores. La reducción de la carga bacteriana en las funciones de varios órganos como la principal lectura de la inmunogenicidad. Sin embargo, estos ensayos no han sido incorporados en los ensayos clínicos de nuevas vacunas contra la tuberculosis hasta la fecha. Aunque todavía hay incertidumbre sobre los mecanismos exactos que llevan a la muerte de las micobacterias interior de los macrófagos humanos, la interacción de los macrófagos y las células T con micobacterias es claramente necesario. El ensayo se describe en este documento representa una generación nueva de ensayos bactericidas que permite a los estudios de estos componentes celulares claves con todos los demás factores humorales y celulares presentes en la sangre entera sin hacer suposiciones acerca de su contribución individual relativa. El ensayo descrito por nuestro grupo utiliza pequeños volúmenes de sangre total y ya ha sido empleado en los estudios de adultos y niños en las zonas endémicas de TB-configuración. Hemos demostrado la inmunogenicidad de la vacuna BCG, un mayor crecimiento de las micobacterias en pacientes VIH-positivos, así como el efecto de la terapia anti-retroviral y la vitamina D en la supervivencia de micobacterias in vitro. Aquí un resumen de la metodología, y presentar nuestros datos de reproducibilidad utilizando este modelo relativamente simple, de bajo costo y el campo de usar. Nota: Las definiciones / abreviaturas BCG lux = M. bovis BCG, cepa de Montreal, transformada con pSMT1 plásmido lanzadera que lleva los genes luxAB de Vibrio harveyi, bajo el control de la micobacteria GroEL (hsp60) promotor. UFC = unidades formadoras de colonias (una medida de la viabilidad de micobacterias).

Se describe un método alternativo para la enumeración de las micobacterias<em&gt; In vitro</em&gt;, Que utiliza el reportero de genes etiquetados micobacterias en lugar de unidades formadoras de colonias (UFC). &quot;Survival&quot; de los organismos así como el anfitrión de respuesta se miden los marcadores simultáneamente, proporcionando un bajo costo, un sistema versátil y funcional para el estudio de las interacciones hospedante / patógeno en el contexto de la tuberculosis.

Un ensayo funcional de sangre completa para medir la viabilidad de las micobacterias, usando Reporter-Gene Tagged BCG o M. tuberculosis (BCG Lux / M. Tb Lux)

Los ensayos funcionales han desempeñado durante mucho tiempo un papel fundamental en la medición de la inmunogenicidad de una vacuna determinada. Convencionalmente, esto se expresa como la capacidad bactericida del suero...

Este ensayo in vitro mide la actividad metabólica de micobacterias en sangre total para evaluar el efecto de las interacciones entre micobacterias y células inmunitarias del huésped. Primero, añada micobacterias marcadas con un gen reportero a sangre humana total con el fin de obtener una lectura en tiempo real durante un período de tiempo. Recolecte los sobrenadantes de las muestras para mediciones de citocinas y los paquetes celulares para análisis de ARN, continúe lisando los glóbulos rojos y, mediante diluciones seriadas y bioluminiscencia, mida la actividad metabólica de las micobacterias.Finalmente, calcule la razón entre la señal de bioluminiscencia final expresada en unidades relativas de luz y la señal de bioluminiscencia en el momento de la inoculación. Los resultados indican la capacidad del huésped para contener las micobacterias. Este ensayo génico con sangre completa puede ayudar a responder preguntas clave en el campo.Por ejemplo, ¿tiene el estado de ciertas células inmunitarias efectoras en una muestra de sangre un impacto funcional sobre los organismos en este caso? Microbacterias. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que la enume

a-functional-whole-blood-assay-to-measure-viability-mycobacteria

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video demuestra la preparación y cuantificación del inóculo de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux utilizando el ensayo de bioluminiscencia y la enumeración de unidades formadoras de colonias. El inóculo preparado se puede utilizar para estudios de infección.

Preparación y cuantificación de Mycobacterium bovis BCG lux Inóculo para la infección

Este vídeo muestra la medición de la carga bacteriana in vivo utilizando larvas de insectos infectadas con Bacillus Calmette-Guérin, BCG, lux. El proceso implica la homogeneización de las larvas, el tratamiento con un sustrato de luciferasa y la medición de la bioluminiscencia para determinar las unidades de luz relativas que se correlacionan con la carga bacteriana.

Medición de la carga in vivo de bacterias que expresan luciferasa en una larva de insecto

Se describe un método para el seguimiento de la ruptura del endomembrane provocada por las bacterias...

Sola célula Medidas de Ruptura Vacuolar causadas por patógenos intracelulares

Aquí, se describe un ensayo fenotípico aplicable a las pantallas de alto rendimiento / alto contenido de ARN sintético de interferencia pequeña (siRNA), compuesto químico, y bibliotecas de mutantes de Mycobacterium tuberculosis. Este método se basa en la detección de tuberculosis de la micobacteria fluorescentemente etiquetada dentro de la célula huésped etiquetada fluorescentemente usando microscopia confocal automatizada.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

Hemos desarrollado un sistema de cribado de alto rendimiento modular para el descubrimiento de nuevos compuestos contra Mycobacterium tuberculosis, la orientación intracelular y en caldo creciente bacterias, así como la citotoxicidad contra la célula huésped de mamífero.

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Son muy deseables nuevos modelos y ensayos que mejorarían el proceso de desarrollo temprano de fármacos antituberculosos de próxima generación. Aquí, describimos un ensayo rápido, económico y compatible con BSL-2 para evaluar la eficacia de un fármaco contra Mycobacterium tuberculosis que se puede adaptar fácilmente para el cribado de alto rendimiento.

Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Se presenta una nueva técnica para la visualización rápida de antígeno en una superficie bacteriana, que implica la Biotinilación superficial seguida por la exposición a las proteínas de interés en fusión con avidina monomérica. Carga del BCG con antígenos seleccionados con éxito mejora su inmunogenicidad, lo que sugiere que la decoración superficial puede sustituir los métodos genéticos tradicionales.

Expresión de antígenos exógenos en la vacuna de BCG de Mycobacterium bovis por genética no decoración de superficie con el sistema avidina-biotina

Galleria mellonella se estableció recientemente como un modelo de infección reproducible, barato y éticamente aceptable para el complejo Mycobacterium tuberculosis. Aquí describimos y demostramos los pasos dados para establecer una infección exitosa de G. mellonella con Bioluminiscente Mycobacterium bovis BCG lux.

Uso de la Invertebrada Galleria mellonella como Modelo de Infección para Estudiar el Complejo Mycobacterium tuberculosis

Describimos una prueba de ensayo de carga bacteriana molecular de tuberculosis realizada después de la inactivación térmica del esputo. La inactivación del calor hace que las muestras de esputo no sean infecciosas y evita la necesidad de laboratorios de nivel 3 de contención para las pruebas moleculares de la tuberculosis.

Un ensayo de carga bacteriana molecular de la tuberculosis (TB-MBLA)

La determinación de las unidades formadoras de colonias (UFC) es la técnica de referencia para cuantificar las bacterias, incluida la Mycobacterium tuberculosis , que puede tardar semanas en formar colonias visibles. Aquí describimos una micro-UFC para la determinación de UFC con mayor eficiencia de tiempo, menor espacio de laboratorio y costo de reactivos, y escalabilidad a experimentos de rendimiento medio y alto.

Ensayo de la unidad formadora de microcolonias para la evaluación de la eficacia de las vacunas contra la tuberculosis

Este estudio desarrolló un ensayo para el cribado de alto rendimiento contra Mycobacterium abscessus con una cepa doble reportera de reciente creación, utilizando fluorescencia y luminiscencia para evaluar rápidamente la viabilidad bacteriana. Este protocolo será relevante para los investigadores que buscan cribar nuevos fármacos contra esta bacteria resistente a los fármacos.

Desarrollo de ensayos para el cribado de fármacos de alto rendimiento contra micobacterias

Aprende a medir la actividad metabólica de micobacterias en sangre completa mediante bioluminescencia en tiempo real. Este ensayo evalúa las interacciones entre micobacterias y células inmunitarias del huésped.

Un ensayo funcional de sangre completa para medir la viabilidad de las micobacterias, usando Reporter-Gene Tagged BCG o M. tuberculosis (BCG Lux / M. Tb Lux) (Video) | JoVE Journal

Un ensayo funcional de sangre completa para medir la viabilidad de las micobacterias, usando Reporter-Gene Tagged BCG o M. tuberculosis (BCG Lux / M. Tb Lux)

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