Objetivos la identificación de los microARN humanos con el sistema de ensayo con luciferasa LightSwitch reportero 3'UTR-Construye y microRNA un imitador de las células adherentes

El objetivo general de este procedimiento es realizar una transfección conjunta de construcciones reporteras junto con un mimético de microARN para validar dianas predichas de microARN en UTR 3' humanos. Esto se logra primero diseñando un experimento que incluya la selección de una línea celular y la elección de miméticos de microARN, junto con construcciones reporteras experimentales y de control de UTR 3' Go Clone. Las células adherentes se siembran aproximadamente 24 horas antes de la transfección. El siguiente paso del procedimiento consiste en transfectar conjuntamente cada construcción reportera experimental o de control de UTR 3' Go Clone con un mimético de microARN o un control no dirigido, seguido de una incubación de 24 a 48 horas. Como paso final, se añade directamente el reactivo del ensayo de luciferasa Light Switch a las células y al cultivo, y la señal luminiscente se mide en un luminómetro de placas.

Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran qué UTR 3' humanos son dianas de un microARN determinado mediante la medición de la reducción de la señal de luciferasa con tecnología de ensayos de reportero. Este método puede ayudar a responder preguntas clave para investigadores de microARN porque proporciona un ensayo funcional para validar interacciones predichas entre microARN y regiones UTR 3' en células vivas. El diseño experimental comienza con la selección de una línea celular adecuada con alta capacidad de transfección; los ensayos basados en miméticos de microARN funcionan mejor en líneas celulares con bajos niveles endógenos de expresión del microARN.

Luego, seleccione el par de mimético de microARN y control no dirigido; incluir un control no dirigido es fundamental, ya que la transfección simultánea de un plásmido y un oligonucleótido de ARN pequeño produce una señal más baja que la transfección del plásmido por sí solo. A continuación, seleccione los constructos informadores previamente clonados del UTR 3' Go Clone de la colección a escala genómica de Switchgear. Vaya al catálogo en línea y haga clic en el botón de búsqueda de UTR.

Después de ingresar la lista de nombres de genes, símbolos génicos o números de acceso, el resultado de la búsqueda proporcionará información sobre el vector y la secuencia, junto con el estado de inventario. Ahora seleccione los constructos reporteros de control. Elija constructos de control con regiones ur en la región tres prima, poco probables de ser dianas del microARN elegido, como urs de genes de mantenimiento o fragmentos aleatorios, para controlar los efectos no específicos de la sobreexpresión de microARN sobre la salud celular general o la señal del ensayo.

Considere también el uso de un reportero sintético de microARN diana como control positivo para la actividad del mimético en células de adherencia de bajo pase el día uno, de modo que alcancen una confluencia del 80 al 100 % para la transfección 24 horas después. Utilizar células altamente confluentes es fundamental para obtener buenos resultados. Siembre las células en una placa de cultivo celular blanca de 96 pocillos con un volumen total de 100 microlitros.

En paralelo. Observe el número adecuado de células en una placa transparente para una confluencia repentina el día 2, 24 horas después del sembrado celular. Prepárese para el descongelamiento previo a la transfección.

Clone los constructos del gen informador y los microARNs a temperatura ambiente. Una vez descongelados, mezcle bien y diluya los microARNs a una concentración de trabajo de dos micromoles por litro en agua libre de ARN. El ADN plasmídico se suministra a 30 nanogramos por microlitro y no requiere dilución adicional. Para preparar la mezcla de transfección, tenga en cuenta que cada combinación de ADN-ARN debe transfectarse por triplicado; el volumen debe ajustarse según el número de ensayos que se vayan a realizar.

Cree la mezcla del reactivo de transfección combinando 9,85 microlitros de medio sin suero y 0,15 microlitros de DharmaFECT DUO por cada transfección. Deje que la mezcla incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego, prepare la mezcla de ADN-ARN para cada ensayo combinando 3,33 microlitros del constructo reportero GoClone con la cantidad suficiente de mimético de microARN para alcanzar la concentración final deseada.

Lleve el volumen a 10 microlitros con medio sin suero. A continuación, combine 10 microlitros de la mezcla del reactivo de transfección con 10 microlitros de cada mezcla de ADN-ARN y mezcle bien. El volumen final es de 20 microlitros para cada ensayo.

Cubra bien y incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, agregue 80 microlitros de medio completo sin antibiótico previamente calentado. El volumen final será de 100 microlitros por pocillo individual en el ensayo, lo que resulta en concentraciones finales de mimético entre 10 y 15 nanomolares.

Como paso final, retire cuidadosamente el medio de cada pocillo de células sembradas y sustitúyalo con 100 microlitros de la mezcla final de transfección adecuada. Devuelva la placa al incubador e incube durante 24 a 48 horas. La mayoría de las mezclas producirán resultados significativos dentro de las 24 horas.

Un período de incubación de 48 horas dará como resultado una mayor variación entre pocillos en la señal. En el día 3, 24 horas después de la transfección, realice ensayos de luciferasa utilizando los reactivos del ensayo de luciferasa Light Switch; las células pueden analizarse inmediatamente o congelarse a menos 80 grados Celsius y analizarse posteriormente. Agregar el ciclo de congelación y descongelación provocará una mayor lisis celular y una señal del reportero más alta. Lleve la placa de células transfectadas a temperatura ambiente.

Luego prepare la solución del ensayo de luciferasa conmutador de luz según las instrucciones del kit y viértala en un depósito estéril. Utilice un pipetador multicanal para añadir 100 microlitros de la solución del ensayo de conmutador de luz directamente a cada muestra. Coloque en los pocillos de la placa blanca de 96 pocillos, tape la placa, proteja de la luz e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente tras la incubación.

Lea cada pocillo durante dos segundos en un luminómetro de placas; la reducción de la actividad del reportero luciferasa del UTR tres primas por LE siete A se midió en células HT 10 80 mediante la transfección simultánea de cada construcción reportera con un análogo de let siete A o un control no dirigido. Para analizar los resultados, considere que la señal del control no dirigido es del 100 % para cada construcción.

Calcule el porcentaje de silenciamiento dividiendo la señal del mimético específico de microARN por la señal del control no dirigido. Cualquier mimético de microARN puede tener efectos no específicos sobre la viabilidad celular general o la señal del ensayo; corrija para compensar cualquier efecto no específico. Compare el silenciamiento observado con una diana experimental de UTR con el silenciamiento observado con un control de mantenimiento o una secuencia aleatoria T, como se muestra aquí.

El PONC y el arid tres B humano tres prima URS son dianas de las señales de microARN let siete A. Las señales provenientes de los reporteros del UTR tres prima humanos para los genes PUNC y arid tres B se reducen significativamente en presencia del mimético de microARN let siete A, mientras que las señales para el URS de secuencia aleatoria y de genes de mantenimiento no lo son. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo establecer una cotransfección exitosa de miméticos de microARN y constructos reporteros del UTR tres prima en células vivas, y cómo leer la señal en un luminómetro para medir la supresión de la señal.