Una introducción a las avispas parasitarias de Drosophila Y la respuesta inmune antiparasitario

Los objetivos generales de este procedimiento son mostrar cómo mantener cultivos de avispas parasitoides en huéspedes de Drosophila y cómo diseccionar la glándula linfática y el cuerpo graso. Esto se logra primero cultivando avispas en larvas de Drosophila. Luego, los animales se diseccionan para aislar las glándulas linfáticas de las larvas, lo que implica pelar la cutícula y eliminar los cuerpos de grasa y otras estructuras más finas para aislar las glándulas linfáticas.

Del mismo modo, los propios cuerpos grasos pueden aislarse mediante un procedimiento similar que utiliza inmunocitoquímica y microscopía de fluorescencia. La expresión génica y los cambios específicos de las células se visualizan en los tejidos inmunitarios. Después de la infestación de avispas, estudiamos un sistema único de infección e inmunidad que utiliza la manguera de Drosophila y su avispa parásita.

Nuestro laboratorio es uno de los pocos donde se mantienen cultivos vivos de parasitoides de Drosophila. Por lo tanto, a menudo se nos pide que compartamos nuestras técnicas. Los parasitoides son enemigos naturales de muchos insectos.

Las especies que estudiamos atacan las etapas larvales de muchas especies de Drosophila. En el laboratorio, utilizamos Drosophila melan gastro para comprender cómo el sistema inmunológico de los insectos se ve afectado por el parasitoide atacado. En segundo lugar, queremos descubrir las estrategias que utilizan los wass para superar la defensa del anfitrión.

En general, las personas que son nuevas en las disecciones para el cuerpo graso y las glándulas linfáticas luchan porque, si bien las larvas de oph son fáciles de cultivar, son bastante pequeñas en tamaño y se necesita una familiaridad considerable para diseccionar rutinariamente estos órganos de laval con facilidad. Después de descubrir que la activación constitutiva de la señalización de NF kappa B conduce a una encapsulación autoinmune de los tejidos celulares, sentimos curiosidad por saber cómo se produciría esta reacción en los mutantes oph fla. Así que planteamos la hipótesis de que la encapsulación inducida es su contraparte natural y desarrollamos estos protocolos estándar que demostraremos hoy, ahora demostraré cómo preparar y mantener cultivos de avispas.

Comience preparando un vial de comida fresca para moscas con un poco de pasta de levadura recién preparada. Transfiera de 50 a 60 moscas jóvenes de tipo silvestre al vial para que pongan huevos durante 48 horas a 24 grados centígrados. Después de dos días de puesta de huevos, retire las moscas del vial y agregue una gota de miel al tapón de zumbido.

Y finalmente, vuelva a tapar el vial. Reduzca el flujo de dióxido de carbono antes de anestesiar a las avispas porque son más sensibles al gas que las moscas. Una vez que esté listo para anestesiar las avispas, clasifique de seis a ocho avispas hembras y de seis a ocho machos y agréguelas al vial.

Con los huevos y larvas de Drosophila. Coloque suavemente el frasco de lado hasta que las avispas se despierten. A continuación, coloque el vial en una incubadora a 24 grados centígrados.

El host gilo no afectado y los hosts que se defiendan con éxito arrojarán pintura de cachorro en el punto de tiempo de desarrollo normal. Se pueden quitar antes de la explosión de avispas e. Las avispas suelen cerrar alrededor de 25 a 30 días para preparar a las avispas en la misma etapa de desarrollo.

Cría las avispas con huevos del huésped puestos durante un período de dos a seis horas en lugar de un período de 48 horas para recolectar larvas infectadas para disecciones de tejidos inmunológicos o parásitos. Transfiera el contenido de los viales para moscas a una pequeña placa de Petri de vidrio o plástico. Luego, usando un microscopio estereoscópico y fórceps para encontrar fórceps, elija cuidadosamente de seis a 10 larvas.

Coloque las larvas en un pozo con un XPBS primero, luego transfiéralas al agua, agua con etanol al 70% y un XPBS sucesivamente. El propósito de estos pasos es liberar a los animales de la comida para moscas y limpiar y esterilizar a fondo su superficie. En la platina de disección de un microscopio de disección Zes 1000, coloque una caja de luz que permita transmitir la luz incidente a través de la muestra.

Con pinzas finas, seleccione una larva de tercer estadio errante limpia del PBS. Coloque las larvas en un portaobjetos de microscopio. Con pinzas, coloque al animal con el lado ventral hacia arriba.

Aleje la fuente de luz de la muestra para que el organismo parezca transparente y los órganos internos sean visibles. A medida que transfiera las larvas al portaobjetos, asegúrese de que no haya un exceso de PBS, ya que esto a veces puede dificultar la sección. Con dos pares de pinzas, sujete al animal a cada lado del extremo posterior y tire suavemente de la cutícula para introducir un pequeño desgarro superficial en la cutícula.

La hemofinfa que contiene los citos, el intestino y los cuerpos grasos comenzará a escapar de la cavidad corporal. La hemolinfa se puede tomar con un pipeta de 10 microlitros para hacer frotis si es necesario, colocando ambas pinzas en el lado izquierdo del animal, justo debajo de los ganchos bucales, con cuidado. Haz un rasgado suave en la cutícula.

Mueva ambas pinzas en el lado derecho del animal, justo debajo de los ganchos bucales, y haga con cuidado otro pequeño desgarro. Ahora, mientras sostiene los ganchos bucales del animal, retire suavemente la cutícula hacia el extremo posterior del animal. A medida que se retira la cutícula, la grasa cerebral, los discos corporales, las glándulas salivales y el ventrículo comprobado quedarán expuestos.

La cutícula desprendida en el extremo posterior tiene el vaso dorsal con una glándula linfática unida a él. La glándula linfática se encuentra debajo del cerebro. Corta el ventrículo comprobado y aléjalo del área de la glándula linfática.

Retire con cuidado la grasa, el cuerpo, el intestino, las glándulas salivales y otras estructuras de la glándula linfática. Tenga cuidado de no separar la glándula flácida de la glándula anular y el vaso dorsal ubicados detrás del cerebro. Coloque la glándula linfática plana contra el portaobjetos del microscopio y extraiga con cuidado todos los tejidos adicionales hasta que toda la glándula se despliegue desde los lóbulos anteriores hasta el conjunto final de células pericárdicas.

La glándula ahora está lista para ser fijada y teñida en la etapa de disección de un microscopio de disección Zes 1000. Coloque una caja de luz que permita que la luz incidente se transmita a través de la muestra. Coloque una larva limpia del tercer estadio en un microscopio.

Deslice 200 microlitros de un XPBS. Incline la fuente de luz lejos de la muestra para que el organismo parezca transparente y los órganos internos sean visibles. Con pinzas, coloque al animal de manera que el extremo anterior esté lejos de usted.

En el siguiente paso, es importante tener en cuenta dónde colocas las pinzas para asegurarte de rasgar solo la cutícula sin tocar los órganos internos. Con un par de pinzas, sostenga la cutícula de las larvas en el lado izquierdo de la boca, enganche con las otras pinzas. Rasga suavemente la cutícula del otro lado hasta el extremo posterior.

Deténgase antes de arrancar la cutícula del cuerpo en el extremo posterior, comience a quitar muy suavemente la tripa hacia un lado. Retire suavemente el cerebro, los discos imaginales y la glándula anular, con la glándula linfática atravesando el vaso dorsal. Finalmente, retire suavemente la cutícula a cada lado del cuerpo graso.

No extirpe las glándulas salivales ya que hay cuerpos de grasa a ambos lados de estas glándulas. Antes de proceder a la fijación y tinción del tejido, asegúrese de retirar el PBS. Una muestra de cuerpo graso bien diseccionada debe mantener un contacto celular normal y debe tener glóbulos de grasa mínimos alrededor de la muestra disecada.

El efecto de la infestación de avispas en la expresión génica se visualiza in vivo. Utilizando un reportero de GFP unido al promotor de Theso Mycin en animales de control no infectados, no se detectó la expresión de GFP. Mientras que la señal GFP se detecta claramente en el citoplasma de cuerpos grasos disecados de animales infectados con l Victoria.

Se disecaron los ganglios linfáticos para visualizar los cambios celulares inducidos en los lóbulos anteriores después de la infección por El Victoria. En la periferia de los lóbulos se observan citos recién diferenciados marcados con GFP impulsada por el potenciador deforme. Normalmente, las glándulas rodean el lóbulo continuamente.

Sin embargo, la integridad de los lóbulos anteriores se alteró en estas glándulas ya que la membrana basal estaba discontinua después de la infección por avispas de estas mismas disecciones. Los citos de la hemolinfa se visualizaron en frotis. Algunos linfocitos se utilizaron en forma de cápsula para bloquear el desarrollo del parásito y detectar la expresión de betzel.

Los ganglios linfáticos disecados. Los ganglios linfáticos se tiñeron con anticuerpos policlonales anti schpeil in vivo. Los niveles de Schpeil aumentaron en las células de la glándula linfática después de la infección por avispas en comparación con los controles no infectados.

Al intentar este procedimiento, es importante preparar cultivos de esófagos a la edad biológica deseada. Trátelos con suavidad para que la manipulación manual no induzca reacciones inmunitarias. Siguiendo este procedimiento, podemos usar los órganos disecados, el cuerpo graso y la glándula linfática para extraer ARN y proteínas usando el ARN o proteína extraído.

Podemos realizar análisis PCR o Westin para estudiar la expresión génica y proteica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crecer. El parásito estaba en los huéspedes de Drosophila y realizaba disecciones de tejidos inmunes para inmunohistoquímica y otras aplicaciones.