Producción y Titulación de recombinantes adeno-asociado vectores virales

El objetivo de este procedimiento es producir virus adenoasociados recombinantes o r AAV para una administración efectiva de transgenes in vitro o in vivo. Esto se logra seccionando primero las células HEC 2 93 con plásmidos de ADN que codifican el gen trans y los genes virales. A continuación, las células transfectadas se raspan y se colocan para recolectar las partículas RAAV ensambladas.

A continuación, los R AAV se purifican a partir del lisado celular mediante la purificación de la columna de heparina. El paso final es endurecer las existencias virales. En última instancia, los resultados muestran una expresión génica trans fuerte y persistente mediada por virus a través de microscopía de inmunofluorescencia.

En este punto, los AAV de RA están listos para aplicaciones in vitro o in vivo. La principal ventaja de utilizar nuestra técnica frente a otros métodos de purificación, como la purificación en gradiente de cloruro de cesio, es que no requerimos utilizar una ultracentrífuga ni materiales tóxicos. También producimos vectores virales superiores y puros.

Antes del inicio de este protocolo, prepare plásmidos de alta calidad, existencias de ADN y grite por integridad como se describe en el protocolo escrito. Para comenzar, coloque dos matraces de 150 centímetros cuadrados 80%COFLUENT de células HEC 2 9 3 en cinco placas de cultivo de tejidos NOC de 15 centímetros de diámetro, células de cultivo. En el DMEM estándar con baja glucosa que contiene un 10% de suero fetal de ternero, aproximadamente 48 horas después de la siembra el día de la transfección, las células deben tener una confluencia del 70 al 80% tres horas antes de la transfección.

Retire el DMEM y reemplácelo con el medio dobe modificado CHO'S de ice cove o IMDM que contiene 5% de suero de ternera fetal. Prepare la mezcla de transfección para un solo lote de virus como se describe en el protocolo escrito: En una campana de cultivo de tejidos de clase dos, filtre estérilmente la mezcla de transfección en un tubo de 50 mililitros mientras vórtice la solución, agregue rápidamente 13 mililitros de dos veces. Ha amortiguado solución salina.

Vuelva a colocar la tapa del tubo de 50 mililitros y continúe girando en vórtice durante 15 segundos. Dejar reposar durante un minuto y 45 segundos. Se debe formar un precipitado blanco Agregue suavemente cinco mililitros de la solución de transfección a cada placa de cultivo de tejidos de 15 centímetros.

Agite las placas para mezclar después de incubar durante 16 horas. Retire el IMDM, reemplace con DMEM y continúe incubando las células. Para cosechar los R AAV.

Retire los medios de las placas de cultivo celular. 72 horas después de la transfección y el desecho siempre deben tratarse con una solución de vercon u otro desinfectante adecuado. Lave suavemente las células con solución salina tibia tamponada con una sola vez con fosfato.

Agregue 25 mililitros de PBS tibio a cada plato y retire suavemente las células con un raspador de células. Después de recoger la suspensión en tubos de 50 mililitros, granule las células a 800 veces G durante 10 minutos. Deseche el supinato y vuelva a suspender el pellet.

En 10 mililitros de tampón de cloruro de sodio de 150 milimolares por placa de cultivo de tejidos, divida la suspensión en dos tubos de 50 mililitros. A continuación, se encuentran las células con una solución recién preparada de desoxicoato de sodio al 10%. A continuación, añada la benzoato nucleasa para la eliminación de los ácidos nucleicos.

Después de mezclar bien los tubos, incubó a 37 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación, elimine los restos celulares por centrifugación a 3000 veces G durante 15 minutos. Transfiera el supinato a un tubo nuevo de 50 mililitros, asegurándose de que se hayan eliminado todos los restos celulares para evitar el bloqueo de la heparina.

Columnas para la purificación de r AAVs. Un tampón de cloruro de sodio de 10 mililitros a una jeringa y configura las columnas de heparina de alta trampa utilizando una bomba peristáltica para que las soluciones fluyan a través de la columna a un mililitro por minuto. Es importante asegurarse de que no se introduzcan burbujas de aire en la columna de heparina.

Equilibre la columna con 10 mililitros de tampón de cloruro de sodio de 150 milimolares. Aplique 50 mililitros de solución de virus a la columna y deje que la solución fluya a través de ella. A continuación, lavar la columna con 20 mililitros de tampón de cloruro de sodio de 100 milimolares.

Usando una jeringa de cinco mililitros. Continúe lavando la columna con un mililitro de tampón de cloruro de sodio de 20 milimolares seguido de un mililitro de tampón de 300 milimolares. Descartar el flujo a través.

Emplee jeringas de cinco mililitros y una presión suave para eluir el virus de la columna mediante la aplicación de tampones de elución de alta suru crecientes. Recoja el eluido en un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Concentre el vector utilizando cuatro unidades de filtro centrífugo AmCon Ultra con un límite de 100.000 pesos moleculares.

Cargue cuatro mililitros del eluido de la columna en el concentrador y centrifugue a 2000 veces G durante dos minutos. Después de repetir la centrifugación, el volumen concentrado debe ser de aproximadamente 250 microlitros. Deseche el flujo y vuelva a cargar el concentrador con la solución de virus restante.

Agregue 250 microlitros de PBS al virus para obtener un volumen final de 500 microlitros y retírelo del concentrador. Como paso final, filtre el vector a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras de 13 milímetros de diámetro para apretar el virus original. Prepare 18 cubreobjetos de vidrio recubiertos de poliol lisina sembrando células HEC 2 9 3 para que tengan un cofluido del 40 al 50% para la valoración de los R AAV dependientes de Cree.

Utilice células HEC 2 9 3 que expresen de forma estable la recombinasa Cree. Infectar cada pocillo con dilución en serie del vector RAAV como se describe en el protocolo escrito utilizando tres pocillos por dilución después de 72 horas, fijar las células HEC 2 9 3 añadiendo un volumen igual de 4% de potencia de formaldehído al medio durante 10 minutos a temperatura ambiente después de la incubación, enjuagar las células tres veces en PBS y una vez con agua destilada. Luego, usando un medio de montaje, coloque los deslizadores de la cubierta en las correderas.

Con la celda hacia abajo. Cuente el número de células excavadas de los tres pocillos que tienen el factor de dilución más alto pero que aún contienen células infectadas. Encuentre el promedio de estos y multiplíquelo por el factor de dilución para obtener el número de unidades infecciosas por microlitro de HEC 2 9 Se muestran 3 células transducidas con un virus que codifica una proteína fluorescente verde mejorada.

Por lo general, se logran títulos consistentes de alrededor de seis veces 10 a las seis partículas infecciosas por microlitro. A continuación se muestran ejemplos de inyecciones estereotáxicas de R AAV dependientes de Cree que codifican proteína verde fluorescente en diferentes regiones del cerebro de ratones transgénicos Cree par albúmina adultos. La expresión de la proteína fluorescente verde viral está restringida a las neuronas que expresan Cree en diferentes regiones objetivo.

En este ejemplo, se muestra la inmunorreactividad de la proteína fluorescente verde en el tálamo reticular y el globo palus, el giro dentado y la región del hipocampo una vez dominada. Esta técnica se puede realizar en siete u ocho días para la producción del virus y tres días para la tittering si se realiza correctamente.