Purificación de proteínas ortogonales Facilitado por un marcador de afinidad biespecíficos pequeños

El objetivo general del siguiente experimento es producir proteínas recombinantes muy puras mediante un procedimiento de purificación por afinidad en dos pasos. Para lograrlo, se clona una etiqueta de purificación biespecífica basada en un dominio de unión a albúmina en un vector de expresión que contiene el gen de interés, seguido de la expresión de la proteína de fusión en e coli. Como segundo paso, el lisado bacteriano que contiene la proteína diana se somete a purificación en una columna cromatográfica con albúmina sérica humana inmovilizada o HSA.

A continuación, se realiza una purificación adicional en una columna MAB select superior resistance o sure que contiene un dominio Z inmovilizado, derivado de la proteína A estafilocócica. Esto da como resultado un producto altamente puro, adecuado para aplicaciones exigentes. A continuación, se evalúa la pureza mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y, si es necesario, mediante espectrometría de masas, con el fin de asegurar que la proteína de interés se ha purificado con éxito hasta la homogeneidad. Los resultados muestran una purificación eficiente tras dos etapas sucesivas, en comparación con una sola etapa utilizando la etiqueta de purificación bispecífica novedosa empleada en este protocolo. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la purificación por afinidad en un solo paso, es que se puede obtener proteína pura mediante un protocolo sencillo que utiliza una única manija de afinidad, independientemente de las propiedades o del tipo de proteína diana.

Este método puede utilizarse con proteínas que presentan características muy diversas. Además, dado que la etiqueta es muy pequeña, es fácilmente producida por el huésped bacteriano. Por lo general, las personas nuevas en este procedimiento de purificación lo encontrarán muy sencillo y directo.

Un paso crítico consiste en ajustar el pH de su muestra antes de cargarla en la segunda columna. Se desarrolló una etiqueta pequeña de purificación con dos afinidades intrínsecas mediante la incorporación de un sitio de unión adicional en un dominio de unión a albúmina existente derivado de la proteína G estreptocócica. El dominio de unión a albúmina de 46 aminoácidos se pliega en un haz estable de tres hélices y contiene un sitio de unión para la albúmina sérica humana, localizado principalmente en la segunda hélice; aleatorizando genéticamente 11 aminoácidos expuestos en la superficie ubicados en la primera y tercera hélice, se diseñaron nuevas superficies de unión. Varios ciclos de biopanning frente a un dominio Z derivado de la proteína A estafilocócica, utilizando una biblioteca combinatoria expresada en fagos, dieron lugar a una molécula bispecífica denominada ABDZ1, con afinidad tanto por HSA como por el dominio Z. Para preparar el plásmido de expresión de la etiqueta de fusión bispecífica, prepare los fragmentos de PCR del gen ABDZ1 flanqueados por sitios de restricción adecuados para la clonación al inicio y al final del gen diana en el plásmido de expresión. Corte los fragmentos de PCR de ABDZ1 y el vector de expresión purificado que contiene el gen de interés con las enzimas de restricción elegidas en un tampón de reacción adecuado, y purifique los productos antes de la ligación.

A continuación, ligue el fragmento A BDZ digerido al vector de expresión que contiene el gen de interés y transforme el producto de la ligación en e coli. Siembre las células transformadas en placas de agar, suplementadas con antibióticos adecuados para la selección. Seleccione mediante PCR algunas colonias y verifique mediante secuenciación de ADN el casete de expresión resultante.

Finalmente, prepare el plásmido a partir de un cultivo nocturno de una colonia con secuencia verificada y transfiéralo a la cepa de expresión preferida para expresar la proteína diana. Con la nueva etiqueta fusionada a sus extremos, inocule primero una colonia bacteriana individual en 10 mililitros de caldo de soya tripticasa suplementado con cinco gramos por litro de extracto de levadura y los antibióticos apropiados; incube a 150 RPM y 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, inocule un mililitro del cultivo nocturno en 100 mililitros de medio fresco e induzca la expresión de la proteína.

Cuando las células alcancen la fase de crecimiento logarítmico, después de la inducción de la proteína, incubar las células a 150 RPM y 25 grados Celsius durante la noche, y al día siguiente recolectar las células por centrifugación. La purificación por afinidad ortogonal de la proteína de fusión A BDZ uno se logra mediante una purificación inicial en una columna con HSA inmovilizada o zoma. Luego se realiza un paso sucesivo de purificación, empleando la segunda afinidad de la etiqueta bispecífica.

Los medios cromatográficos con el dominio Z inmovilizado, como MA select sure, están fácilmente disponibles para la purificación de anticuerpos. Mientras que el HSA puede acoplarse químicamente a los medios para proporcionar la segunda matriz y proceder con la purificación de afinidad ortogonal Resus, suspenda el precipitado en 25 mililitros de tampón de corrida. Luego, rompa las células mediante sonicación al 60 % de amplitud y pulsos de un segundo, seguidos de una pausa de un segundo, durante un total de tres minutos.

Después de centrifugar la muestra, filtre el sobrenadante que contiene la proteína diana a través de un filtro de 0,45 micrones antes de la purificación adicional. A continuación, equilibre una columna de esferas de HSA de un mililitro o una columna activada con NHS acoplada a HSA con 10 volúmenes de columna de tampón de corrida a un mililitro por minuto en un sistema adecuado de purificación de proteínas. Una vez equilibrada, cargue el lisado bacteriano a 0,5 mililitros por minuto, restablezca la velocidad de flujo a un mililitro por minuto y lave la columna con cinco volúmenes de columna de tampón de corrida, seguido de cinco volúmenes de columna de tampón de lavado.

Eluir la muestra con tampón de elución a un mililitro por minuto y recoger las fracciones. Monitorear la absorción a 280 nanómetros para seleccionar las fracciones del pico eluido. Para una mayor purificación, reunir las fracciones con la mayor concentración de proteína y luego diluirlas dos veces.

Asegúrese de que el tampón de corrida esté funcionando y de que el pH sea aproximadamente neutro. Este paso es fundamental para la unión de la proteína al dominio Z. Agregue tris HCl 1 M, pH 8, para aumentar el pH si es necesario.

A continuación, cargue la muestra a 0,5 mililitros por minuto en una columna MA de atrapamiento alto de un mililitro que haya sido equilibrada con sure. Después de que la velocidad de flujo se haya reajustado a un mililitro por minuto, se lava la columna con cinco volúmenes de columna del tampón de elución sure. Luego, eluya las proteínas con ácido acético 0,2 molar, pH 2,7, para proteínas diana sensibles.

El EIT puede neutralizarse directamente tras la recopilación mediante la adición de T tris. La página H-C-L-S-D-S puede utilizarse para evaluar la pureza de la proteína. Es importante reducir completamente la muestra, ya que un citosol libre en un A BDZ puede provocar la dimerización del producto en condiciones no reductoras.

Como paso final, se puede analizar el peso molecular del producto purificado mediante espectrometría de masas tras la purificación mediante el protocolo ortogonal en una columna de HSA, seguida de una columna MA select sure. Diferentes muestras recogidas en varios puntos de purificación se analizaron mediante electroforesis en gel de SDS. Las muestras incluyeron la propia etiqueta A BDZ one, así como tres proteínas diana humanas diferentes fusionadas a AB DZ one, que representan distintas clases de solubilidad, pesos moleculares y puntos isoeléctricos.

Las calles uno a cuatro muestran lisados proteicos antes de la purificación de las tres proteínas de fusión diferentes de AB DZ uno y de la etiqueta AB DZ uno misma. Las calles cinco a ocho muestran los resultados del paso de purificación de HSA de las proteínas. Finalmente, las calles nueve a doce corresponden al paso final de purificación mediante selección con mAb Sure.

Además, en este análisis se incluyeron muestras obtenidas de los mismos lisados purificados en orden inverso en las mismas columnas. Los carriles del uno al tres muestran lisados antes de la purificación, mientras que los carriles del cuatro al seis se tomaron después del primer paso de purificación en la columna MAB Select Sure. Los productos de alta pureza en los carriles del siete al nueve resultan de la purificación final de HSA.

Los resultados muestran claramente la utilidad de una doble etiqueta y de dos pasos de purificación altamente específicos. Aunque se logra una pureza razonable tras el paso inicial de purificación, como se observa en los geles, el paso sucesivo produce un producto muy puro, adecuado para aplicaciones altamente exigentes. Una vez dominado, el paso de purificación central en este método puede realizarse en cuestión de horas por una sola persona, obteniendo una proteína recombinante altamente pura, adecuada para muchas aplicaciones diferentes.

Por ejemplo, tras seguir este procedimiento, las biomoléculas purificadas pueden utilizarse en otras aplicaciones, como estudios de interacción, con el fin de responder preguntas como la fuerza de unión de un complejo. Después de ver este video, debería tener una comprensión muy clara de cómo obtener un producto proteico verdaderamente puro utilizando esta etiqueta de afinidad dual.