Electroporación de mesénquima craneofacial

El objetivo general de este procedimiento es electrooperar macromoléculas cargadas en el mesénquima facial craneal. Esto se logra colocando primero un embrión anestesiado en etapa 28 dentro de la cámara de electroporación. El siguiente paso es microinyectar la solución que contiene macromoléculas cargadas en el mesénquima craneofacial C.

A esto le sigue rápidamente la aplicación de una corriente eléctrica, introduciendo así los nucleótidos de carga en otras células. El paso final del procedimiento es visualizar el tejido electroporado mediante microscopía de fluorescencia. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cambios en los tejidos faciales craneales.

Estos resultados pueden analizarse in vivo o en tejido fijo mediante fluorescencia, microscopía o inmunohistoquímica. La principal ventaja de la electroporación sobre los métodos existentes como la microinyección y la mutación es el control tisular y temporal de nuestras herramientas moleculares, lo que demostrará nuestro procedimiento hoy en día será Jackie Tabler, un postdoc en mi laboratorio. El par de electrodos en forma de L necesarios para este procedimiento está hecho de alambre de tungsteno de alta pureza de 0,4 milímetros para cada electrodo, primero corte ocho centímetros del alambre.

Luego, el uso de masilla como la tachuela azul afecta una jeringa de un mililitro en el punto medio del alambre de tungsteno, dejando cuatro centímetros de alambre expuestos desde la punta de la jeringa. Dobla la punta en forma de L a un centímetro del extremo. Recorta la punta para que el extremo mida 0,5 centímetros de longitud.

Esta punta es el extremo del electrodo para pasar el exceso de alambre de tungsteno en paralelo a la jeringa. Se utilizará para conectar el generador de pulsos de electrodo después de que se haya fabricado el segundo electrodo. Sujete el par de electrodos entre sí con cinta adhesiva de modo que el terminal del electrodo que ejecute en paralelo, a un centímetro de distancia.

Finalmente, conecte los electrodos a un generador de pulsos de onda cuadrada a través de cables de CC. Para preparar la cámara de electroporación hecha a medida, forre el fondo de un plato de 90 milímetros con alrededor de cinco milímetros de arcilla de modelado de escenas de yeso no tóxica. Llene el plato con medios de electroporación sumergiendo la escena de yeso.

A continuación, utiliza las pinzas de relojero número cinco para tallar un pozo en forma de T en la escena del yeso para formar la electroporación. Bueno, el lado largo del pozo debe medir alrededor de dos milímetros por dos milímetros por 10 milímetros, y el lado corto debe ser de dos milímetros por dos milímetros por cinco milímetros. Las micropipetas para este procedimiento están hechas de capilares de vidrio de silicato.

Utilice un extractor de agujas para preparar micropipetas con un cono de ocho a 12 milímetros de largo y una punta fina, triture la punta a unos dos milímetros de la punta con pinzas, creando una rotura dentada para configurar la micropipeta. Primero, llénelo con aproximadamente un microlitro de solución inyectable, que en esta demostración contiene oligonucleótidos marcados con fluorescencia. A continuación, fije la micropipeta en un ángulo del micromanipulador a 50 grados de la mesa.

Ajuste la presión de inyección a 20 PSI y calibre la micropipeta para inyectar 30 litros por pulso. En preparación para la electroporación, anestesia una xenolarva de etapa 28 incubándola durante cinco minutos. En los medios de electroporación, que son medios anfibios normales que contienen 0,1% de benzocaína, transfiera el renacuajo anestesiado a la cámara de electroporación.

Que está lleno de medios de electroporación. La parte más complicada del procedimiento es insertar la micro mascota en el renacuajo. Por lo tanto, para garantizar el éxito, debe asegurar el embrión con mucha fuerza y luego aplicar rápidamente la corriente después de la microinyección.

Coloque el embrión dentro del pocillo largo de modo que la cabeza descanse en la unión T. Con el lado dorsal hacia abajo y el lado ventral expuesto, la cabeza debe estar ligeramente elevada en comparación con la cola con pinzas, asegure suavemente el renacuajo en el pozo con la escena de yeso circundante. Es importante asegurar el renacuajo para evitar que se mueva durante la electroporación, lo que podría provocar daños graves en los tejidos faciales.

Para comenzar este procedimiento, inserte la punta de la micropipeta inmediatamente después de la glándula de cemento y en el mecanismo facial. Inyecte 30 nanolitros de solución en el mesénquima, retraiga la micropipeta. Alinee rápidamente las puntas de los electrodos paralelas a la cabeza del embrión y aplique ocho pulsos cuadrados de 50 milisegundos y 20 milivoltios.

A continuación, retraiga los electrodos con pinzas. Suelta con cuidado al renacuajo del pozo. Luego use una pipeta para transferir el renacuajo a tres cuartos de nom con 0,025 miligramos por mililitro.

Los renacuajos de gentamicina se pueden incubar en este medio durante la noche o más después de 24 horas. Cribado de renacuajos por microscopía fluorescente para una electroporación eficiente. El uso de moléculas fluorescentes permite un fácil cribado de los embriones electroporados.

Esta figura muestra un lote típico de renacuajos electroporados con oligonucleótidos morfos alrededor de 1248 y 96 horas después de la electroporación. En las etapas 30, 34 y 44 respectivamente. Los oligonucleótidos morfo fluorescentes se pueden visualizar dentro del cuerpo craneal facial en las etapas 30 y 34.

En la etapa 44, el fluorescente se puede detectar en los cartílagos, indicado por las puntas de flecha blancas. El área altamente autofluorescente es el intestino. Siguiendo este procedimiento, podemos rastrear el linaje de las electrocélulas, así como los requisitos moleculares de las proteínas de interés.

Este enfoque se puede combinar con técnicas de imagen en vivo para estudiar la función de los genes a lo largo del tiempo durante el desarrollo craneofacial.