Name: Electroporación de mesénquima craneofacial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprende a electroporar macromoléculas cargadas en el mesénquima craneofacial de Xenopus laevis. Esta técnica permite control temporal y espacial para estudiar el desarrollo craneofacial in vivo.

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Estamos muy agradecidos a Nancy Papalopulu y Boyan Bonev de asistencia con la electroporación Xenopus. También queremos agradecer a Marc Dionne para la lectura crítica, Green y Jeremy John Wallingford útil para los debates y los miembros del laboratorio de Liu por su apoyo. Este trabajo fue financiado por becas de la BBSRC (BB/E013872/1) y el Wellcome Trust (081880/Z/06/Z) para KJL.

Parte 1A. Equipo Microscopio: alcance vertical estéreo disección con el objetivo de baja potencia <ul><li> Tensión / generador de impulsos: BTX 830 ECM sistema de electroporación de onda cuadrada </li><li> Pipeta extractor: P-87 Micropipeta Extractor (Compañía Sutter Instrument, CA) </li><li> Manipulador: grueso, o combinarse gruesa y fina en función de la preparación. </li><li> Titular de la micropipeta: Herramientas de Bellas Ciencia </li><li> Electrodo: hechos en casa </li><li> Electroporación de cámara: en casa </li></ul> Electrodos en forma de L: <ol><li> Cortar 8 cm de alta pureza 0,4 mm de alambre de tungsteno (Goodfellow) y colocará en el punto medio de una jeringa de 1 ml con masilla (usamos Blu-Tack). Deja 4 cm de alambre de tungsteno expuestos desde la punta de la jeringa y la punta curva en forma de L, de 1 cm desde el extremo (Fig. 1A). </li><li> Recortar la punta para que el extremo mide 0,5 mm de longitud. Tsu punta es la terminal del electrodo. </li><li> En paralelo el exceso de alambre de tungsteno a la jeringa y la utilizan para conectar el generador de impulsos del electrodo. </li><li> Repita el proceso de hacer un par de electrodos. </li><li> Conecte los electrodos al generador de pulso cuadrado de onda a través de cables de CC. </li></ol> Electroporación cámara <ol><li> Línea inferior de 90 mm plato con ~ 5 mm de plastilina no tóxica. </li><li> Rellene plato con los medios de comunicación de la electroporación. </li><li> Usando N º 5 pinzas de relojero hacerse un bien en forma de T (Fig. 2). El bien siempre debe medir ~ 2 mm x 2 mm x 10 mm y el corto ~ 2 mm x 2 mm x 5 mm. El plato de electroporación se pueden lavar y reutilizar. </li></ol> Parte 1B. Reactivos ADN o macromoléculas cargadas <ul><li> Micropipetas: 1 mm de ancho, 4 "de largo capilares de vidrio de borosilicato (WPI, TW100-F) </li><li> Los medios de cultivo: Normal Medios Anfibios (NAM) </li><li> &gt; 10 X stock: 1100 mM NaCl, 20mM KCl, 10 mM de Ca (NO 3) 2 • 4H 2 O, 1 mM EDTA. <ul><li> Autoclave y almacenar a 4 ° C. </li><li> 1 X NAM: Diluir 10 veces desde el almacén de amortiguación, con 0,1 mM NaHCO 3 y 0,2 mM Na 3 PO 4. </li></ul></li><li> Renacuajos Xenopus laevis, etapa 28 </li></ul> Preparación del ADN: <ol><li> Prepare plásmidos de expresión a través de protocolos estándar. </li><li> Resuspender el ADN a una concentración final de 1 mg / l en la nucleasa libre de H 2 0. </li></ol> * Hemos tenido éxito con vectores que contienen un fuerte promotor de CMV, como pCS2 + [16]. Para el análisis de linaje, por lo general incluyen el ADN que codifica la proteína verde fluorescente (GFP pCS2 +) a una concentración final de 0,1 mg / l. Concentraciones [de ADN entre 0.1-3 mg / l también fueron probados. Se encontró que las concentraciones por debajo de 0,8 mg / l células ineficiente etiqueta, mientras que las concentraciones de ADN de más de 2 mg / m yu, l no ha mejorado la eficiencia de la electroporación]. Morfolino oligonucleótidos preparación: (Nota:. OM deben ser fluoresceinado (3'-carboxifluoresceína modificados) o acusado de otro tipo) <ol><li> Resuspender morfolino oligonucleótidos (OM) (GeneTools, <a href="http://www.genetools.com" target="_blank">www.genetools.com</a> ) a una concentración de 2 mM de nucleasa libre de H 2 0. </li><li> Alícuota de la solución madre de calor a 65 ° C durante 5 minutos. </li><li> Se diluye a la concentración final de 0,5 mM en agua libre de nucleasa. </li></ol> * 0.1-1mm soluciones MO fueron probados. 0,5 mM soluciones MO fueron suficientes para la electroporación de muchas células mesenquimales. Micropipetas <ol><li> Prepare micropipetas de vidrio de borosilicato capilares (1 mm de ancho, 4 "de largo, no WPI. TW100-F). Utilice extractor de aguja para preparar micropipetas con un cono 8-12 mm de largo y de punta fina. </li><li> Aplastar a punta de ~ 2 mmde la punta con las pinzas, la creación de una ruptura irregulares. </li></ol> Medios de comunicación <ol><li> Medio de incubación: Preparar fresca 3.4 normal de Medios Anfibios (NAM) de 1x de valores. Añadir 0,025 mg / ml de gentamicina. </li><li> Los medios de comunicación de la electroporación: como el anterior, con el 0,1% de benzocaína (Sigma, 06950). </li></ol> 2. Electroporación Micropipeta de configuración <ol><li> Rellene micropipeta con una solución inyectable ~ l. </li><li> Seguro micropipeta en micromanipulador y se unen a microinyector (Picospritzer II). </li><li> Micropipeta ángulo a 50 ° de la mesa. </li><li> Ajuste la presión de inyección a 20 PSI. </li><li> Calibrar micropipeta para inyectar 30 nl por impulso. </li></ol> Tadpole preparación <ol><li> Anestesiar etapa 28 larvas de Xenopus incubando en los medios de comunicación de la electroporación por 5 minutos. </li><li> Transferencia de renacuajo anestesiado en la cámara de electroporación llena de medios de comunicación de la electroporación. La posición del embriónen el tiempo y modo que la cabeza se apoya en el cruce con la cara dorsal hacia abajo y la parte ventral expuesta. La cabeza debe estar ligeramente elevada en comparación con la cola. </li><li> Con unas pinzas, suavemente seguro renacuajo bien en los alrededores de plastilina. (Nota:.. Si el renacuajo no está asegurada, puede contracción y contacto de los electrodos durante la electroporación En este caso, descartar el renacuajo como pañuelos de papel se verá seriamente dañada) </li></ol> Electroporación <ol><li> Inserte la punta de micropipeta inmediatamente posterior a la glándula de cemento y en mesénquima facial. </li><li> Inyectar la solución de 30 nl en mesénquima. </li><li> Retraer micropipeta. </li><li> Alinear rápidamente puntas de los electrodos paralelos a la cabeza del embrión (Fig. 3). </li><li> Aplicar 8 50 ms, legumbres 20mV cuadrados. </li><li> Retraer los electrodos. </li><li> El uso de pinzas cuidadosamente liberación renacuajo de bien y de transferencia de hasta 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml de gentamicina. </li><li> Los renacuajos pueden ser incubados en 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml Overnight, o más. </li><li> Seleccionar embriones para la electroporación eficiente mediante microscopía de fluorescencia después de 24 horas. </li></ol> 3. Los resultados representativos: El uso de moléculas fluorescentes permite la detección fácil de embriones electroporated. La figura 4 muestra un lote típico de MO electroporated renacuajos ~ 12, 48 y 96 horas después de la electroporación, se incubaron a 14,5 ° C. Mediante microscopía de fluorescencia, OM se puede visualizar inmediatamente después de la electroporación y persistir durante varios días después de la electroporación. En nuestra experiencia, la fluorescencia es débilmente evidente en la etapa 46 (~ 5 días después). En los cartílagos, la fluorescencia disminuye dramáticamente después de la aparición de la diferenciación (~ º 42), sin embargo, MO fluorescencia persiste con más fuerza en otros tipos celulares, como el endodermo faríngeo. Microscopía de fluorescencia muestra que los oligonucleótidos se incorporan en varios tejidos craneofaciales incluyendo el cartílago. Oligonucleótidos c fluorescenciaa menudo un ser visualizado en el tejido en ambos lados de la cabeza. Esto es probablemente debido a la rápida difusión de la solución inyectable en todo el mesénquima craneofacial sueltos antes de la electroporación. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig1.jpg"> Figura 1 electrodos hechos en casa. En forma de L de alambre de tungsteno es conectada a una jeringa de 1 ml con no-tóxico de barro o masilla. (A) El término del electrodo mide 5 mm. (B) Coloque un par de electrodos, de modo que los extremos son paralelas. Electrodos se conectan al generador de impulsos a través de cables de CC. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig2.jpg"> Figura 2 cámara de electroporación. (A) 90 mm plato forrado con plastilina está lleno de medios de comunicación y una cámara en forma de T tallada con fórceps No relojero de 5 años. (B) El lado más largo mide 2 mm x 2 mm X10 mmmientras que las medidas sólo 2 mm x 2 mm x 5 mm. La cabeza del embrión se basa en el cruce, la parte ventral hacia arriba. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig3.jpg"> Figura 3 Esquema que ilustra el procedimiento de electroporación. St. 28 renacuajo se coloca en la cámara de electroporación, lado ventral hacia arriba. Micropipeta se inserta en la glándula de cemento facial mesénquima subyacente. Inyectar. Micropipeta se elimina en forma de L y los electrodos están alineados en paralelo que flanquean la cabeza. Aplicar ocho de 50 ms, 20 mV pulsos cuadrados. Retraer los electrodos. Renacuajos crecen en etapas deseado. Visualizar OM o la expresión de GFP mediante microscopía de fluorescencia. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig4.jpg"> Figura 4 renacuajos Representante 12 (A), 48 (B) y 96 (C) horas después de la electroporación (etapas 30, 34 y 44, respectivamente). (A "B") MO fluorescente se puede visualizar en mesénquima craneofacial en el ciervoes 30 y 34. La fluorescencia se puede detectar en los cartílagos en la etapa 44 (punta de flecha, C '-C "). El intestino es muy autofluorescentes.

<ol><li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev. Cell. 20, 19-32 (2011).</li>
<li>Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li>
<li>Drinjakovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+ligase+Nedd4+promotes+axon+branching+by+downregulating+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">E3 ligase Nedd4 promotes axon branching by downregulating PTEN.</a> Neuron. 65, 341-357 (2010).</li>
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<li>Khoury, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+intra-articular+versus+systemic+gene+electrotransfer+in+experimental+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene.+Med%22%5BJournal%5D)">A comparative study on intra-articular versus systemic gene electrotransfer in experimental arthritis.</a> J. Gene. Med. 8, 1027-1036 (2006).</li>
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<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+Development+of+Xenopus+laevis%3A+A+Laboratory+Manual%22">Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbour Laboratories Press. (2000).</li>
<li>Wheeler, G. N., Brandli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+vertebrate+models+for+chemical+genetics+and+drug+discovery+screens%3A+lessons+from+zebrafish+and+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: lessons from zebrafish and Xenopus.</a> Dev. Dyn. 238, 1287-1308 (2009).</li>
<li>Turner, D. L., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+achaete-scute+homolog+3+in+Xenopus+embryos+converts+ectodermal+cells+to+a+neural+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.</a> Genes. Dev. 8, 1434-1447 (1994).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflicto de intereses.

En este vídeo, hemos demostrado la viabilidad de la entrega de genes mediada por electroporación en el mesénquima facial de los renacuajos Xenopus. El uso de este enfoque, podemos evitar los primeros efectos del desarrollo de la manipulación de la función del gen que nos permite apuntar tejidos específicos en momentos posteriores. Nuestros estudios muestran que la población heterogénea de células mesenquimales craneofacial puede verse afectada, lo que nos permite estudiar el linaje de las células por electroporación, así como los requisitos de la célula autónoma de las proteínas de interés. Combinado con imágenes en vivo, se puede utilizar este método para estudiar la función génica, con el tiempo, durante el desarrollo craneofacial. Este nuevo método pone de manifiesto la maleabilidad de Xenopus para el estudio de la organogénesis. Creemos que este método puede ser adaptado ampliamente para estudiar la morfogénesis y la diferenciación de otros tejidos.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3381">Electroporation of Craniofacial Mesenchyme</a>. There was an incorrect unit used for the voltage.

Erratum: Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

electroporación de mesénquima craneofacial

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

La electroporación es un método eficaz para el suministro de ADN y otras macromoléculas cargadas en los tejidos en los puntos precisos de tiempo y en lugares precisos. Por ejemplo, la electroporación se ha utilizado con gran éxito para estudiar el desarrollo neuronal y de la retina en Xenopus, pollo y ratón 1.10. Sin embargo, es importante señalar que en todos estos estudios, los investigadores no estaban dirigidas a los tejidos blandos. Debido a que estamos interesados ​​en el desarrollo craneofacial, adaptamos un método para apuntar mesénquima facial. Cuando se realizaron búsquedas en la literatura, encontramos, para nuestra sorpresa, muy pocos informes de la transferencia de genes con éxito en el tejido cartilaginoso. La mayoría de estos estudios fueron estudios de terapia génica, como la entrega de siRNA o de proteínas en líneas celulares condrogénica, o, en modelos animales de artritis 11-13. En otros sistemas, como el pollo o el ratón, la electroporación de mesénquima facial ha sido un desafío (COMUNICACI personaliones, Departamento de Desarrollo Craneofacial, KCL). La hipótesis de que la electroporación en los tejidos cartilaginosos y procartilaginous en Xenopus podría funcionar mejor. En nuestros estudios, nos muestran que la transferencia de genes en los cartílagos faciales se produce de manera eficiente en las etapas iniciales (28), cuando el primordio facial sigue siendo compuesto de los tejidos blandos antes de la diferenciación del cartílago. Xenopus es un sistema de vertebrados muy accesible para el análisis del desarrollo craneofacial. Estructuras craneofaciales son más visibles en Xenopus que en cualquier modelo de otros vertebrados, principalmente debido a embriones de Xenopus son fertilizados externamente, lo que permite el análisis de las etapas más tempranas, y facilitar imágenes en vivo a una resolución única célula, así como la reutilización de las 14 madres. Entre los modelos de vertebrados desarrollo externo, Xenopus es más útil para el análisis craneofaciales que el pez cebra, Xenopus, como las larvas son más grandes y más fáciles de dissect, y el desarrollo de la región facial es más accesible a las imágenes de la región equivalente en pescado. Además, Xenopus es evolutivamente más cerca de los humanos que el pez cebra (~ 100 millones años más) 15. Por último, en estas etapas, los renacuajos Xenopus son transparentes, y la expresión simultánea de proteínas fluorescentes o moléculas que permiten una fácil visualización de los cartílagos en desarrollo. Creemos que este enfoque nos permitirá poner a prueba rápida y eficiente las moléculas candidatas en un sistema modelo in vivo.

Cartílagos craneofaciales en estrecho contacto con otros tejidos, y son difíciles de manipular en animales vivos. Estamos utilizando electroporación para ofrecer herramientas moleculares durante el crecimiento del esqueleto craneofacial sin pasar por los primeros efectos de embriones. Este enfoque nos permite analizar de manera eficiente las moléculas candidatas<em&gt; In vivo.</em

Electroporación de mesénquima craneofacial

La electroporación es un método eficiente para administrar ADN y otras macromoléculas cargadas en los tejidos en puntos temporales y ubicaciones precisos. ...

El objetivo general de este procedimiento es electroinsertar macromoléculas cargadas en el mesénquima craneofacial. Esto se logra primero posicionando un embrión anestesiado en la etapa 28 dentro de la cámara de electroporación. El siguiente paso consiste en microinyectar la solución que contiene macromoléculas cargadas en el mesénquima craneofacial. Esto es seguido rápidamente por la aplicación de una corriente eléctrica, introduciendo así los nucleótidos cargados en las células. El paso final del procedimiento consiste en visualizar el tejido electroporado mediante microscopía de fluorescencia. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren cambios en los tejidos craneofaciales.Estos resultados pueden analizarse in vivo o en tejido fijado mediante fluorescencia, microscopía o inmunohistoquímica. La principal ventaja de la electroporación frente a métodos existentes como la microinyección y la mutación es el control espacial y temporal de nuestras herramientas moleculares. Quien demostrará nuestro procedimiento hoy será Jackie Tabler, una posdoctoranda en mi laboratorio. El par de electrodos en forma de L necesarios para este procedimiento están fabricados con alambre de tungsteno de alta pureza de 0,4 milímetros; para cada electrodo, primero corte ocho centímetros del alambre.Luego, utilizando una masilla como la plastilina azul, fije una jeringa de un mililitro en el punto medio del alambre de tungsteno, dejando cuatro centímetros de alambre expuesto desde la punta de la jeringa. Doble la punta en forma de L a un centímetro del extremo. Recorte la punta de modo que el extremo mida 0,5 centímetros de longitud.Esta punta es el extremo del electrodo; haga que el exceso de alambre de tungsteno corra paralelo a la jeringa. Se utilizará para conectar el generador de pulsos del electrodo después de que se haya fabricado el segundo electrodo. Sujete el par de electrodos uno al otro utilizando cinta, de modo que los terminales de los electrodos queden paralelos, separados un centímetro entre sí.Finalmente, conecte los electrodos a un generador de pulsos de onda cuadrada mediante cables de corriente continua. Para preparar la cámara de electroforesis casera, forre el fondo de una placa de 90 milímetros con aproximadamente cinco milímetros de arcilla no tóxica para modelado escénico. Llene la placa con medio de electroforesis, sumergiendo completamente la arcilla escénica.Luego, utilice pinzas de relojero número cinco para tallar un pozo con forma de T en la escena de yeso para formar la electroforesis. El pozo, cuyo lado largo debe medir aproximadamente dos milímetros por dos milímetros por 10 milímetros, y el lado corto debe ser de dos milímetros por dos milímetros por cinco milímetros. Las micropipetas para este procedimiento se fabrican a partir de capilares de vidrio de silicato.Utilice un extractor de agujas para preparar micropipetas con una punta cónica de ocho a doce milímetros de longitud y una punta fina; rompa la punta aproximadamente a dos milímetros del extremo usando pinzas, creando un rompimiento irregular para preparar la micropipeta. En primer lugar, llénela con alrededor de un microlitro de solución de inyección, que en esta demostración contiene oligonucleótidos marcados con fluorescencia. A continuación, sujete firmemente la micropipeta en un micromanipulador e incline la micropipeta a 50 grados con respecto a la superficie de la mesa.Establezca la presión de inyección en 20 PSI y calibre la micropipeta para inyectar 30 litros por pulso. Como preparación para la electroforesis, anestesie una larva de xeno en estadio 28 incubándola durante cinco minutos. En medio de electroforesis, que es medio anfibio normal que contiene 0,1 % de benzocaína, transfiera la rana bebé anestesiada a la cámara de electroforesis.Que está lleno de medio de electroforesis. La parte más complicada del procedimiento es insertar el microelectrodo en el renacuajo. Por lo tanto, para asegurar el éxito, debe fijar el embrión firmemente y luego aplicar rápidamente la corriente después de la microinyección.Coloque el embrión dentro del canal largo de manera que la cabeza quede en la unión en forma de T. Con su lado dorsal hacia abajo y el lado ventral expuesto, eleve ligeramente la cabeza con respecto a la cola utilizando fórceps y sujete suavemente el renacuajo en el canal con la escena de yeso circundante. Es importante asegurar bien el renacuajo para evitar que se estremezca durante la electroforesis, lo que podría provocar daños severos en los tejidos faciales.Para comenzar este procedimiento, inserte la punta de la micropipeta inmediatamente posterior a la glándula cementosa y dentro del mesénquima facial. Inyecte 30 nanolitros de solución en el mesénquima, luego retire la micropipeta. Alinee rápidamente las puntas de los electrodos paralelas a la cabeza del embrión y aplique ocho pulsos cuadrados de 50 milisegundos y 20 milivoltios.Luego, retire los electrodos utilizando pinzas. Libere cuidadosamente la renacuaja del pocillo. A continuación, use una pipeta para transferir la renacuaja a nom tres cuartos con 0,025 miligramos por mililitro.Las renacuajos con gentamicina pueden incubarse en este medio durante la noche o más tiempo después de 24 horas. Examinar los renacuajos mediante microscopía de fluorescencia para verificar una electrotransferencia eficiente. El uso de moléculas fluorescentes permite un cribado sencillo de los embriones electrotransferidos.Esta figura muestra un lote típico de renacuajos electroporados con oligonucleótidos morfolinos alrededor de las 12, 48 y 96 horas posteriores a la electroporación, en las etapas 30, 34 y 44, respectivamente. Los oligonucleótidos morfolinos fluorescentes pueden visualizarse dentro de la mesénquima facial craneal en las etapas 30 y 34.En la etapa 44, se puede detectar fluorescencia en los cartílagos indicados por las cabezas de flecha blancas. El área altamente autofluorescente es el intestino. Tras seguir este procedimiento, podemos rastrear la linaje de las células electro como así también los requisitos moleculares para proteínas de interés.Este enfoque puede combinarse con técnicas de imagen en vivo para estudiar la función génica a lo largo del tiempo durante el desarrollo craneofacial.

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Biología

Una sola célula de electroporación (SCE) es una técnica especializada que permite la entrega de ADN u otras macromoléculas en las células individuales en el tejido intacto, incluso en los preparativos vivo. Aquí detallamos el procedimiento para la SCE de un colorante fluorescente o de ADN plásmido en las neuronas en el cerebro intacto de los renacuajos Xenopus laevis.

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Este procedimiento describe un método para el aislamiento y la cultura del órgano de Corti murino con o sin el limbo espiral y las neuronas del ganglio espiral. También demostramos un método para la expresión de un gen reportero exógenos en el órgano de Corti explante de la electroporación.

Cultura primaria y electroporación plásmido del órgano de Corti murino.

En el útero de la electroporación permite la entrega rápida de genes en un espacio-temporal y controlado de manera en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe una muy adaptable en el protocolo de electroporación in utero que puede ser utilizado para entregar las construcciones de expresión en múltiples dominios del SNC embrionario, incluyendo el telencéfalo, diencéfalo y la retina.

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Un método de transferencia de genes en el cerebro del ratón en desarrollo se describe mediante el uso de un método único quirúrgica y la forma especial de los electrodos. Esta técnica única permite la transfección de ADN de plásmido temporal y espacialmente, lo que ayudará a muchos neurocientíficos en el estudio de desarrollo del cerebro.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

Para llevar a cabo una evaluación rápida de la función de los genes en el desarrollo de la corteza cerebral, se describen procedimientos que implican...

Métodos de estudio de la morfogénesis neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporación en la corteza cerebral embrionario murino

¿Cómo las redes neuronales se establecen en el cerebro embrionario es una cuestión fundamental en la neurobiología del desarrollo. Aquí hemos combinado una técnica de electroporación con herramientas genéticas novedosas, tales como Cre / Lox-plásmidos y el sistema de transposición de ADN PiggyBac mediada por el cerebro posterior aviar para etiquetar interneuronas dorsal y seguimiento de sus proyecciones axonales y metas sinápticas en las diversas etapas de desarrollo.

La electroporación del Rombencéfalo trazar trayectorias axonal y metas sinápticas en el embrión de pollo

La superficie pial es una zona de progenitor único en el sistema nervioso central que está recibiendo cada vez más atención. En esto, detallamos un método para la manipulación genética rápida de esta zona progenitor utilizando un método de electroporación modificado. Este procedimiento se puede utilizar para investigaciones celulares y moleculares de los linajes de células y vías de señalización implicadas en la diferenciación celular y para dilucidar el destino y las propiedades de las...

Neonatal electroporación superficie pial

Presentamos un método que describe el aislamiento y cultivo de explantes cocleares del oído interno de ratones embrionarios.  También demostramos un método para la transferencia de genes a explantes cocleares a través de electroporación de onda cuadrada. El cultivo in vitro de explantes, junto con la técnica de transferencia de genes, permite a los investigadores estudiar los efectos de la alteración de la expresión génica durante el desarrollo.

Cultura de embriones de ratón explantes cocleares y Gene Transfer por electroporación

La electroporación doble en el útero permite apuntar a las poblaciones celulares que están separadas espacial y temporalmente. Esta técnica es útil para visualizar las interacciones entre las poblaciones celulares que utilizan proteínas fluorescentes en condiciones normales, pero también después de experimentos funcionales para perturbar los genes de interés.

Doble en electroporación de utero para apuntar a poblaciones celulares separadas temporal y espacialmente

Aquí, presentamos un protocolo que combina la electroporación in vivo y la denervación del músculo elevador del auris largo craneal (LAL). Este procedimiento permite estudiar el papel potencial de las proteínas derivadas del músculo en la regeneración de la sinapsis neuromuscular.

Electroporación in vivo combinada y reinervación a corto plazo del músculo esquelético elevador del auris largo craneal

Aquí, presentamos la manipulación genética aguda de organoides corticales humanos cortados en rodajas por electroporación. Estos modelos de organoides corticales son particularmente susceptibles a la inyección, ya que las estructuras similares a los ventrículos se pueden identificar fácilmente después del corte, lo que permite la investigación funcional del desarrollo cortical humano, los trastornos del neurodesarrollo y la evolución cortical.

Electroporación de organoides corticales humanos cortados en rodajas para estudios de la función génica

Aprende a electroporar macromoléculas cargadas en el mesénquima craneofacial de Xenopus laevis. Esta técnica permite control temporal y espacial para estudiar el desarrollo craneofacial in vivo.

Electroporación de mesénquima craneofacial

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