Name: Comparación cuantitativa de Cis-Elemento regulador (CRE) Las actividades de transgénicos Drosophila melanogaster /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprende a medir cuantitativamente la actividad de elementos reguladores cis en Drosophila melanogaster mediante líneas transgénicas con genes reportadores. Este método permite analizar patrones de expresión génica durante el desarrollo metamórfico.

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Agradecemos a: Nicolas Gompel y Benjamin Prud&#39;homme por su contribución al desarrollo de este protocolo, Melissa Williams y cuatro revisores anónimos por los comentarios sobre el manuscrito, la Universidad de Dayton Escuela de Graduados de becas de investigación a la guerra, y la Universidad de Dayton Biología Departamento e Instituto de Investigación (Udri) para apoyar la investigación de TMW. Este trabajo fue apoyado por la Asociación Americana del Corazón subvención 11BGIA7280000 a TMW.

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</ol>

No tenemos nada que revelar.

elementos reguladores cis-codificar el programa de genómica que especifica los patrones de expresión génica y de ese modo el proceso de desarrollo 1, y son lugares importantes para ambas mutaciones subyacentes evolución morfológica 2-4 y la variación fenotípica de los rasgos humanos 5,6,19. A pesar de esta importancia, la lógica de regulación de CRE siguen siendo poco conocidos. Una razón importante de este déficit la comprensión ha sido la falta de métodos adecuados para compar...

comparación cuantitativa de cis-elemento regulador (cre) las actividades de transgénicos drosophila melanogaster</em

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Patrones de expresión génica se especifican por cis-elemento regulador (CRE) de secuencias, que también son llamados potenciadores o módulos cis-reguladoras. Un típico CRE cuenta con un arreglo de sitios de unión de varias proteínas del factor de transcripción que le confieren una lógica de regulación especifica cuándo, dónde y en qué nivel del gen regulado (s) se expresa. El conjunto completo de CRE dentro de un genoma animal codifica el programa del organismo para el desarrollo 1, y empíricos, así como los estudios teóricos indican que las mutaciones en CRE desempeñado un papel destacado en la evolución morfológica 2-4. Por otra parte, los estudios del genoma humano de asociación amplia indican que la variación genética en CRE contribuir sustancialmente a la variación fenotípica 5,6. Por lo tanto, la comprensión de la lógica de regulación y de cómo las mutaciones afectan a esa lógica es un objetivo central de la genética. Transgenes reportero de proporcionar un método eficaz para estudiar la función in vivoción de la CRES. Aquí una secuencia CRE sabe o se sospecha está acoplado al promotor heterólogo y las secuencias codificadoras de un gen que codifica un producto de proteína fácilmente observables. Cuando un reportero transgén se inserta en un organismo huésped, la actividad de la CRE se hace visible en forma de la proteína codificada reportero. P-elemento de transgénesis mediada por la mosca de la fruta especies de Drosophila (D.) melanogaster 7 ha sido utilizado durante décadas para introducir transgenes reportero en este organismo modelo, aunque la ubicación genómica de los transgenes es aleatorio. Por lo tanto, la actividad del gen está fuertemente influenciada por la cromatina locales y el medio ambiente del gen, lo que limita las comparaciones CRE a ser cualitativa. En los últimos años, el sistema de integración basado phiC31 fue adaptado para su uso en D. melanogaster para insertar los transgenes en el genoma específico lugares de aterrizaje 10/08. Esta capacidad ha hecho que la medición cuantitativa del gen y, pertinente en este caso, la actividad de CRE 11-13 feasible. La producción de moscas de la fruta transgénicas pueden ser subcontratados, incluyendo phiC31 basado en la integración, eliminando la necesidad de adquirir equipos costosos y / o tienen una habilidad especializada en protocolos de inyección transgénica. A continuación, presentamos un protocolo general para evaluar cuantitativamente la actividad de la CRE, y mostrar cómo este método puede ser usado para medir los efectos de una mutación introducida en la actividad de una CRE y comparar las actividades de la CRES orthologous. Aunque los ejemplos son para un activo CRE durante la metamorfosis mosca de la fruta, el enfoque se puede aplicar a otras etapas de desarrollo, las especies de mosca de la fruta, o de los organismos modelo. En definitiva, un uso más generalizado de este enfoque de la CRE estudio debe avanzar la comprensión de la lógica de regulación y de cómo la lógica puede variar y evolucionar.

La variación fenotípica de rasgos puede ser consecuencia de mutaciones en cis-elemento regulador (CRE) secuencias de patrones genéticos que controlan la expresión. Métodos derivados de su uso en Drosophila melanogaster cuantitativamente se puede comparar los niveles de la distribución espacial y temporal de la expresión génica mediada por la modificación o naturales variantes CRE.

Comparación cuantitativa de Cis-Elemento regulador (CRE) Las actividades de transgénicos Drosophila melanogaster</em

Los patrones de expresión génica están especificados por secuencias de elementos reguladores en cis (CRE), que también se denominan potenciadores o módulos reguladores en cis. Un CRE típico...

El objetivo general de este procedimiento es medir cuantitativamente las actividades reguladoras de genes de elementos reguladores cis o CRE activos durante el desarrollo metamórfico de Drosophila melanogaster. Comience con métodos de integración sitio-específica para generar líneas de CRE incorporados transgénicamente como transgenes reporteros. Mediante el uso de un microscopio estereoscópico, obtenga especímenes transgénicos del estadio de desarrollo correcto.Retire los especímenes del pub externo y móntelos sobre un microscopio de vidrio. Deslice para registrar el nivel y el patrón de expresión de la proteína reportera fluorescente en muestras enteras mediante análisis microscópico confocal. Finalmente, cuantifique el nivel de expresión de la proteína reportera fluorescente en las imágenes confocales registradas utilizando la herramienta de software Image J.Estos resultados asignan un nivel de actividad reguladora génica al elemento regulador auxiliar y facilitan estudios comparativos adicionales sobre expresión génica en versiones modificadas de CRE. Este procedimiento puede ayudar a responder preguntas clave y resulta de interés en la regulación génica y en cómo se codifica d

quantitative-comparison-cis-regulatory-element-cre-activities

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Investigación

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Biología

Este protocolo describe un método simple y económico para cuantificar la actividad de los elementos reguladores cis (es decir, potenciador / promotores) que viven en la retina del ratón a través de electroporación explante. Preparación del análisis de ADN, la disección de la retina, la electroporación, la cultura de explantes de retina, y después de la fijación y cuantificación se describen.

La cuantificación de la actividad de Cis Elementos reguladores en la retina del ratón por electroporación explante

Drosophila melanogaster es un organismo modelo excepcional para estudiar el sistema inmune innato y las consecuencias fisiológicas de la infección y la enfermedad. Este protocolo describe cómo administrar infecciones bacterianas robustas y cuantitativamente repetibles a D. melanogaster, y cómo medir posteriormente la gravedad de la infección y cuantificar la respuesta inmunitaria del huésped.

La infección bacteriana sistémica y Defensa Inmune fenotipos en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

En este trabajo proporcionamos un flujo de trabajo experimental de cómo se pueden identificar y validar experimentalmente los potenciadores activos.

Predicción y validación de los elementos reguladores de genes activados durante ácido retinoico inducida por la diferenciación de células madre embrionarias

Este protocolo se muestra cómo generar tumores clonales fluorescente marcada, genéticamente definidos en el ojo de Drosophila / discos imaginales de las antenas (EAD). En él se describe cómo diseccionar el EAD y el cerebro de la tercera fase larvaria y la forma de procesarlos para visualizar y cuantificar cambios de expresión génica y la invasividad tumoral.

los<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal modelo de tumor de disco: visualización y cuantificación de la expresión génica y la invasividad tumoral Uso Genético Mosaicos

Reglamento de medio ambiente de la cromatina es un proceso esencial para expresión génica adecuada. Aquí, describimos un método para controlar la expresión génica a través de la contratación de modificadores de la cromatina maquinaria de manera gene-específica y reversible.

Reprimiendo la transcripción genética redirigiendo la maquinaria celular con modificadores químicos de epigenéticas

Presentamos un protocolo para un ensayo colorimétrico de la actividad citrato sintasa para la cuantificación de la masa mitocondrial intacta en el tejido Drosophila homogeneatos.

Un ensayo colorimétrico de la actividad de citrato sintasa en Drosophila Melanogaster

Este artículo describe un protocolo detallado para el uso de la enzima Cas13D dirigida al ARN (RfxCas13D) en moscas.

Orientación de ARN ubicuo y específico del tejido en Drosophila Melanogaster utilizando CRISPR / CasRx

Este artículo toma como ejemplo la transgénesis mediada por la integrasa phiC31 en Drosophila y presenta un protocolo optimizado para la microinyección de embriones, un paso crucial para la creación de moscas transgénicas.

Microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila

Este protocolo proporciona una canalización computacional optimizada para cuantificar las transcripciones de potenciadores nacientes. Al integrar la accesibilidad de la cromatina, la característica de la cromatina y los datos transcripcionales, permite una detección precisa y un análisis específico de la actividad potenciadora de la hebra en regiones intragénicas complejas, sin dejar de ser accesible para los investigadores sin una amplia formación en bioinformática.

Una canalización computacional para la cuantificación de ARN potenciador intergénico / intragénico en células madre embrionarias de ratón

En este artículo se muestra cómo disecar el sistema nervioso central del tercer estadio las larvas de Drosophila.

La disección del sistema nervioso central de larvas de Drosophila melanogaster

Aprende a medir cuantitativamente la actividad de elementos reguladores cis en Drosophila melanogaster mediante líneas transgénicas con genes reportadores. Este método permite analizar patrones de expresión génica durante el desarrollo metamórfico.

Comparación cuantitativa de Cis-Elemento regulador (CRE) Las actividades de transgénicos Drosophila melanogaster

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