Comparación cuantitativa de Cis-Elemento regulador (CRE) Las actividades de transgénicos Drosophila melanogaster

El objetivo general de este procedimiento es medir cuantitativamente las actividades reguladoras de los genes de los elementos reguladores de CIS o CRE activos durante el desarrollo gastrometamórfico de Drosophila melan. Comience con métodos de integración específicos del sitio para generar líneas de CRE incorporadas transgénicamente como transgenes reporteros. Usando un microscopio estereoscópico, obtenga especímenes transgénicos de la etapa de desarrollo correcta.

Retire las muestras del pub exterior y móntelas en un microscopio de vidrio. Proceda a registrar el nivel y el patrón de expresión de la proteína reportera fluorescente en muestras de montaje completo mediante análisis microscópico confocal. Por último, cuantifique el nivel de expresión de la proteína reportera fluorescente para las imágenes confocales grabadas utilizando la herramienta de software Image J.

Estos resultados asignan un nivel de actividad reguladora génica para ayudar al elemento regulador y facilitan estudios comparativos adicionales de expresión génica en versiones modificadas de CRE. Este procedimiento puede ayudar a responder preguntas clave y se siente interesado en la regulación génica y cómo se codifica esa regulación génica. El ADN se siente como biología evolutiva y del desarrollo.

Este procedimiento se desarrolló para proporcionar información sobre los elementos reguladores cis que funcionan durante el desarrollo metamórfico de Drosophila melanogaster. En principio, sin embargo, se puede aplicar a los elementos reguladores cis que funcionan durante otras etapas de desarrollo y a otras especies de moscas de la fruta, o incluso a otros organismos modelo. Con el fin de expandir las líneas transgénicas, se deben configurar dos viales con varias moscas macho y hembra en días alternos.

Transfiera las moscas de uno de los viales a un vial nuevo. Repita esto durante una semana. Al cabo de dos semanas, verifique que las moscas transgénicas de la fruta abarquen desde las etapas de desarrollo larvaria hasta la adulta.

Comience a estadificar los especímenes al final de la etapa larvaria del tercer estadio, cuando se forma el RE. Tenga en cuenta que el espécimen no es móvil. El ER se suaviza de color blanco y las esféricas se han desviado para especificar este punto de tiempo.

Como cero HAPF. Se distinguen los machos de las hembras por la presencia de gónadas bilateralmente situadas cerca del punto medio del cuerpo que aparecen como círculos translúcidos para la estadificación en función de la longitud de la metamorfosis. Con cero HAPF, transfiera las muestras a un vial nuevo con un pincel humedecido.

Agregue un trozo de toallita Kim y humedezca con agua para evitar que los especímenes se sequen. Ahora, incube el vial a 25 grados centígrados hasta el HAPF deseado. Alternativamente, el estadio de los especímenes se clasifica en función de la identificación de la presencia y posición de varios marcadores morfológicos, como se detalla en el texto adjunto.

Con cinta de laboratorio, adhiera un trozo de cinta de embalaje a una tabla de disección con la superficie de la cinta adhesiva hacia arriba. Humedece un pincel y humedece los especímenes con un pincel. Transfiera las muestras a una toallita Kim.

Transfiera las muestras a la cinta de embalaje y adhiéralas con la superficie dorsal hacia arriba. Deje que las muestras se sequen durante 15 minutos. Abra progresivamente la sala de emergencias con fórceps.

Comience en la parte anterior o permanente y continúe hacia el extremo posterior. A continuación, transfiera el pui a una gota de aceite viscoso en un portaobjetos de microscopio y evalúe la muestra microscópicamente para detectar muestras de montaje completo. Utilice el objetivo Forex o 10 x para enfocar el espécimen.

Utilizando el software del microscopio confocal, ajuste la longitud de onda de excitación de la proteína fluorescente deseada para evitar el fotoblanqueo. Comience con una intensidad láser de cinco a 10%Si la señal es decepcionante, aumente la intensidad según sea necesario para mejorar la relación señal-ruido. En el caso de las imágenes confocal, habilite la configuración de software que promedie las mediciones de píxeles a partir de escaneos replicados, como el promedio de kalman para comparaciones cuantitativas de la actividad de CRE utiliza la sección C, donde la fluorescencia parece más intensa.

Cambie a una tabla de búsqueda de advertencia de saturación y ajuste la ganancia de voltaje del canal y el desplazamiento a la configuración en la que haya pocos píxeles saturados. Si es necesario, ajuste la apertura confocal. Una vez que se determinan los ajustes óptimos, ejecute el escaneo ZS para obtener una serie de imágenes a lo largo del eje Z.

Una vez finalizado el escaneo, convierta la pila de imágenes en una proyección y guarde este archivo de imagen en formato TIF. Para la comparación cuantitativa de las actividades de CRE, utilice la misma configuración confocal para todos los especímenes replicados y las líneas de transgenes reporteros. Para el experimento con el programa Image J iniciado, abra una imagen TIFF para ser evaluada.

Haga clic en el botón de selección a mano alzada y delinee el área de la muestra donde se desea cuantificar. Para obtener una estadística de valor de píxel, haga clic en la pestaña analizar y luego seleccione medir. Registre la puntuación media del valor de píxel desde el cuadro de resultados.

Recopile también un segundo valor medio de píxel de una región de fondo en la que el CRE no esté activo. Para derivar un valor de píxel medio ajustado, continúe generando estadísticas de valor de píxel para los especímenes replicados. A continuación, a partir de los valores de píxel medios ajustados de la réplica, determine la actividad reguladora media de A CRE y también calcule el error estándar de la media.

Este experimento utiliza la intensidad del fenotipo del ojo blanco de rescate para hacer que las líneas transgénicas sean homocigóticas. Para la integración de transgenes específicos se utiliza un fondo genético mutante de gen blanco con una secuencia de sitio de aterrizaje TTP A. Los individuos transgénicos, hemicigotos y homocigotos para el vector integrado se distinguen por la intensidad del fenotipo de color de ojos rescatado por el número de copias del gen mini blanco integrado.

A continuación, se establecen líneas homocigóticas cruzando moscas macho y hembra con el fenotipo de color de ojos más oscuro. Los marcadores morfológicos se utilizan para determinar la etapa metamórfica de Drosophila durante la metamorfosis de larva a mosca de la fruta adulta. El espécimen transita a través de una serie de morfologías estereotipadas que pueden utilizarse para determinar el sexo y aproximar la etapa de desarrollo. Aquí.

Una versión de tipo salvaje de A CRE conocida como elemento dimórfico impulsa altos niveles de expresión de EGFP reportero en el segmento abdominal ASIC de la hembra puy. Se encontró que una secuencia de 13 pares de bases dentro de este CRE es un sitio de unión para el factor de transcripción DSX y la importancia in vivo de esta secuencia se demuestra cuantificando la actividad reguladora del CRE cuando este sitio de unión está mutado. Los análisis cuantitativos indican que la mutación de este sitio DSX redujo la actividad reguladora a 28 más o menos 3% de la expresión de tipo salvaje en el contexto del sitio de inserción del transgén utilizado aquí.

Comparaciones similares evalúan las actividades reguladoras para alelos CRE intraespecíficos o entre CRE autólogos de especies separadas, por ejemplo, en comparación con los niveles de EGFP en el segmento femenino. A seis impulsados por la cepa gástrica D Melin Canina S CRE autóloga para las especies D estimulantes y D willi poseen actividades reguladoras iguales a 75 más o menos 4% y cero más o menos 0% respectivamente. Los siguientes métodos de procedimiento, como la interferencia de ARN, se pueden utilizar con genes de factores de transcripción para responder preguntas adicionales sobre cómo estos genes de factores de transcripción interactúan con los elementos reguladores de CYS.

Esto estaría indicado por el aumento y disminución de la expresión de proteínas reporteras fluorescentes que son impulsadas por elementos reguladores de CIS después de su desarrollo. Este procedimiento allanó el camino para que los investigadores en el campo de la regulación génica exploraran la importancia funcional que los motivos de los elementos reguladores cis y las mutaciones evolucionadas tienen sobre la expresión génica.