Name: Mediante genética inversa para manipular el gen de Sociedades Nacionales del virus de la fiebre de Rift Valley MP-12 Cepa para mejorar la seguridad de la vacuna y la eficacia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprende a generar mutantes del virus de la fiebre de Rift Valley cepa MP-12 mediante genética inversa para desarrollar vacunas atenuadas más seguras y eficaces.

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Este trabajo fue financiado por la Subvención Número 5 U54 AI057156-07 a través del Centro Regional del Oeste de Excelencia (WRCE), 1 R01-A1 AI08764301 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, y un financiamiento interno del Centro Sealy para el Desarrollo de Vacunas de la Universidad de Texas Medical Branch.

<ol><li>Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+infectious+rift+valley+fever+virus+entirely+from+cDNA%2C+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene%2C+and+expression+of+a+foreign+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+I-mediated+expression+of+viral+RNA+for+the+rescue+of+infectious+virulent+and+avirulent+Rift+Valley+fever+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses.</a> Virology. 378, 377-384 (2008).</li>
<li>Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+RNA+polymerase-dependent+and+-independent+systems+for+cDNA-based+rescue+of+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus.</a> J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).</li>
<li>Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NSm+proteins+of+Rift+Valley+fever+virus+are+dispensable+for+maturation%2C+replication+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection.</a> Virology. 359, 459-465 (2007).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+blocks+interferon+production+by+inhibiting+host+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription.</a> J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).</li>
<li>May, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFIIH+transcription+factor%2C+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li>
<li>Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+protein+promotes+post-transcriptional+downregulation+of+protein+kinase+PKR+and+inhibits+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation.</a> PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).</li>
<li>Habjan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+valley+fever+virus+induces+the+specific+degradation+of+the+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).</li>
<li>Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+interferons+and+the+virus-host+relationship%3A+a+lesson+in+detente%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente.</a> Science. 312, 879-882 (2006).</li>
<li>Bon, A. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+i+interferons+potently+enhance+humoral+immunity+and+can+promote+isotype+switching+by+stimulating+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo.</a> Immunity. 14, 461-470 (2001).</li>
<li>Le Bon, A., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+innate+and+adaptive+immunity+via+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Links between innate and adaptive immunity via type I interferon.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).</li>
<li>Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+as+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity+through+dendritic+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation.</a> Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).</li>
<li>Ito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+recovery+of+rabies+virus+from+cloned+cDNA+using+a+vaccinia+virus-free+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system.</a> Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).</li>
<li>Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+tripartite+RNA+genome+packaging+in+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li>
<li>Diaz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+deletion+of+the+alpha-+and+beta+1-interferon+genes+in+human+leukemia+and+derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).</li>
<li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).</li>
<li>Constantinescu, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+signaling+specificity+of+the+IFNAR+chain+of+the+type+I+interferon+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).</li>
<li>Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF%28HOS%29+ubiquitin+ligase+mediates+the+ligand-induced+down-regulation+of+the+interferon-alpha+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor.</a> EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).</li>
<li>Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+phlebovirus+expression+strategy+and+protein+glycosylation.+Virology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology.</a> 170, 505-510 (1989).</li>
<li>Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+use+of+recombinant+vaccinia+viruses+to+study+Phlebovirus+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression.</a> J. Virol. 62, 826-833 (1988).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Muller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clone+13%2C+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus%2C+which+is+altered+in+the+small+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).</li>
<li>Le May, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SAP30+complex+inhibits+IFN-beta+expression+in+Rift+Valley+fever+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells.</a> PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+Protein+of+Rift+Valley+Fever+Virus+Promotes+Post-Translational+Downregulation+of+the+TFIIH+Subunit+p62%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li>
<li>Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF+family+of+transcription+factors+as+regulators+of+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF family of transcription factors as regulators of host defense.</a> Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).</li>
<li>Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+viral+induction+of+distinct+interferon-alpha+genes+by+positive+feedback+through+interferon+regulatory+factor-7%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7.</a> EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+mRNA+is+transcribed+from+an+incoming+anti-viral-sense+S+RNA+segment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment.</a> J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).</li>
<li>Mims, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+Fever+virus+in+mice.+I.+General+features+of+the+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection.</a> Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).</li>
<li>Bouloy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).</li>
<li>Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+lacking+NSm+proteins+retains+high+virulence+in+vivo+and+may+provide+a+model+of+human+delayed+onset+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease.</a> Virology. 362, 10-15 (2007).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Invertir los sistemas de la genética para RVFV han sido desarrollados por varios grupos mediante la utilización de promotor T7 2,4,5 o ratón de 3 o 4 humanos promotor de Pol-i. En este artículo, se describe un protocolo para generar recombinantes RVFV MP-12 cepas mediante el uso de células BHK/T7-9 15 que expresan establemente T7 ARN polimerasa. La eficiencia de la recuperación viral variado dependiendo de la condición de BHK/T7-9 las células, la cantidad de plásmidos, el núme...

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Medio esencial mínimo (MEM)-alfa </td><td> Invitrogen </td><td> 32561037 </td><td></td></tr><tr><td> Medio esencial modificado de Dulbecco mínimo </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> Modificado Medio Eagle (MEM 2x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11935046 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> Cellgro </td><td> 30 a 240-CR </td><td></td></tr><tr><td> Triptosa fosfato de caldo </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1682149 </td><td></td></tr><tr><td> Agar Noble </td><td> VWR </td><td> 101170-362 </td><td></td></tr><tr><td> Transit-LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300</td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td><td></td></tr><tr><td> Tapa hermética de aerosol </td><td> Eppendorf </td><td> C-2223-25 </td><td></td></tr><tr><td> 0,33% de solución de rojo neutro </td><td> Sigma Aldrich </td><td> N2889-100ML </td><td></td></tr><tr><td> C57/WT MEF células </td><td> Invivogen </td><td> MEF-c57wt </td><td></td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> Invivogen </td><td> Ant-V-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invivogen </td><td> ant-Zn-1 </td><td></td></tr><tr><td> Quanti-Blue </td><td> Invivogen </td><td> rep-QB1 </td><td></td></tr><tr><td> BHK/T7-9 células 15 </td><td> Universidad de Gifu, Japón </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Células Vero E6 </td><td> ATCC </td><td> CRL-1586 </td><td></td></tr></table>

mediante genética inversa para manipular el gen de sociedades nacionales del virus de la fiebre de rift valley mp-12 cepa para mejorar la seguridad de la vacuna y la eficacia

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Valle del Rift virus de la fiebre (RVFV), que causa la fiebre hemorrágica, trastornos neurológicos o ceguera en los seres humanos, y una alta tasa de aborto y de malformaciones fetales en los rumiantes 1, ha sido clasificado como HHS / USDA se superponen agente de seleccionar un agente patógeno y el nivel 3. Pertenece al género Phlebovirus de la familia Bunyaviridae, y es uno de los miembros más virulenta de esta familia. Varios sistemas de genética inversa para la cepa RVFV MP-12 2,3 vacuna, así como las cepas salvajes RVFV 4-6, incluyendo ZH548 y ZH501, se han desarrollado desde el año 2006. El MP-12 cepa (que es un grupo de riesgo 2 y un agente patógeno no seleccionar) está muy atenuado por varias mutaciones en su M y L-segmentos, pero todavía lleva virulenta S-segmento de ARN 3, que codifica una virulencia funcional factor, NSS. El rMP12-C13type (C13type) la realización de 69% en el marco de la eliminación de Sociedades Nacionales ORF carece de todas las funciones conocidas Sociedades Nacionales, al mismo tiempo que se replica como eficient al igual que el MP-12 en células que carecen de VeroE6 tipo I IFN. Sociedades Nacionales induce una desconexión de la transcripción de host, entre ellos el interferón (IFN) beta-ARNm 7,8 y promueve la degradación de la doble hélice de proteína quinasa dependiente de ARN (PKR) en el nivel post-traduccional 9,10. IFN-beta es transcripcionalmente regulado al alza por el interferón factor regulador 3 (IRF-3), NF-kB y la proteína activadora-1 (AP-1), y la unión de IFN-beta de IFN-alpha/beta receptor (IFNAR) estimula la transcripción de IFN-alfa genes u otros genes de interferón estimulado (ISGs) 11, lo que induce a las actividades de acogida antiviral, mientras que la supresión de acogida transcripción incluyendo IFN-beta de genes por Sociedades Nacionales evita que el gen de los upregulations ISGs en respuesta a la replicación viral a pesar de la FIC-3, NF-kB y activador proteína-1 (AP-1) puede ser activada por RVFV7. . Por lo tanto, NSS es un excelente objetivo para atenuar aún más MP-12, y para mejorar las respuestas inmunitarias del huésped natural por la abolición de la función de supresión de IFN-beta. Aquí, Se describe un protocolo para la generación de una proteína recombinante MP-12 Sociedades Nacionales de codificación mutado, y proporcionar un ejemplo de un método de cribado para identificar mutantes que carecen de Sociedades Nacionales de la función de reprimir IFN-beta síntesis de ARNm. Además de su papel esencial en la inmunidad innata, el tipo de IFN-I es importante para la maduración de las células dendríticas y la inducción de una respuesta adaptativa inmune 12-14. Por lo tanto, la inducción de mutantes Sociedades Nacionales de tipo I IFN son más atenuados, pero al mismo tiempo son más eficientes para estimular respuestas inmunes del huésped de tipo salvaje MP-12, que los convierte en candidatos ideales para los enfoques de vacunación.

A la inversa sistema de genética de la cepa del virus de la fiebre del Valle del Rift MP-12 vacuna es una herramienta útil para la creación de nuevas MP-12 mutantes con mayor atenuación e inmunogenicidad. Se describe el protocolo para la generación y caracterización de cepas mutantes Sociedades Nacionales.

Mediante genética inversa para manipular el gen de Sociedades Nacionales del virus de la fiebre de Rift Valley MP-12 Cepa para mejorar la seguridad de la vacuna y la eficacia

El virus de la fiebre del valle del Rift (RVFV), que provoca fiebre hemorrágica, trastornos neurológicos o ceguera en humanos, y una elevada tasa de abortos y muerte fetal...

Este procedimiento genera el virus recombinante del Nilo Occidental cepa MP 12 que expresa NSS mutado mediante genética inversa y tiene como objetivo caracterizar los fenotipos para el desarrollo de vacunas. Primero, utilizando un sistema de transfección en células Bhk T seven nine, que expresan establemente la ARN polimerasa T seven, se recuperan mutantes recombinantes de la cepa MP 12; luego se amplifica el mutante recombinante recuperado de la cepa MP 12 en células Vero E six y se titran los mutantes MP 12 amplificados mediante ensayo de placas. El paso final del procedimiento consiste en analizar la ausencia de supresión de interferón alfa o beta por las proteínas NS mutantes.En última instancia, los resultados pueden facilitar la preparación de una vacuna viva atenuada candidata para la fiebre del Valle de Rift mediante un sistema de genética inversa. La principal ventaja de esta técnica frente al método existente, como la introducción aleatoria de mutaciones en el genoma viral mediante nitrógeno químico o pasajes seriados, es la capacidad de introducir mutaciones específicas en el genoma viral utilizando un sistema genético. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las vacunas contra la fiebre del Valle, tales como la importancia del factor principal de virulencia NSS en la inmunogenicidad de los candidatos a vacuna.En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el virus de la fiebre del Nilo Occidental, al igual que en forma de bloques diana, y la visualización del bloque requieren una técnica optimizada. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de recuperación viral y de hidratación son difíciles de aprender porque no se ha reportado un protocolo paso a paso para este método. Utilizando placas de seis centímetros, coloque las células renales de hámster bebé T79, que expresan establemente la ARN polimerasa T7, y colóquelas en un incubador con una confluencia celular del 70 al 80 %. Cambie el medio a MEM alfa completo sin higromicina B. Dentro de una hora, inicie el proceso de transfección para la recuperación del virus de la fiebre de Rift Valley.Cree un conjunto de plásmidos que codifiquen ARN genómicos virales de longitud completa para la expresión de ARN viral completo y un segundo conjunto que codifiquen marcos abiertos de lectura de genes virales para la expresión de proteínas virales. Añada ahora 30 microlitros de Transit LT1 a 385 microlitros de Opti-MEM en un tubo de 1,5 mililitros. Agite brevemente mediante vortex e incube durante cinco minutos.A temperatura ambiente, agregue lentamente los liposomas resultantes a los conjuntos de plásmidos de 10 microgramos mezclados suavemente mediante pipeteo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Añada la mezcla de transfección a las células bhk T seven nine gota a gota e incube durante 24 horas. Reemplace el sobrenadante de cultivo con MEM alfa completo y cultive durante cuatro días adicionales. Recopile los sobrenadantes de cultivo en un tubo de 50 mililitros y elimine los restos celulares mediante centrifugación.Ahora, transfiera los sobrenadantes a tubos criogénicos de cinco mililitros con tapón roscado y almacene este pasaje. Guarde el stock de virus P0 a menos 80 grados Celsius para facilitar experimentos posteriores. Amplifique el virus P0 en células que carecen de los genes de interferón alfa y beta; cultive cultivos de Vero E6 al 80 % de confluencia en DMEM completo, reemplace el medio con el virus P0 diluido e incube durante una hora.Retire el inóculo y cultive en 10 mililitros de DMEM completo durante tres a cuatro días hasta que el efecto citopático en las células Vero E6 sea evidente. Recupere el sobrenadante como se describió anteriormente y etiquete las muestras como E6P1. En placas de seis pocillos, siembre células Vero E6 hasta alcanzar un 80 % de confluencia en DMEM completo. Aspire el medio de las células Vero E6 y añada 400 microlitros de diluciones seriadas diez veces del preparado del virus E6P1 e incube durante una hora.Mientras tanto, prepare dos tubos de 15 mililitros para el tubo de agar en capa superior: un tubo A que contenga siete mililitros de agar noble al 1,2% en agua y un tubo B que contenga siete mililitros de MEM completo 2x y caldo fosfato al 10%. Después de 15 minutos en los baños de agua, vierta el contenido del tubo B en el tubo A y utilice una pipeta para mezclarlos. Reemplace el inóculo viral con dos mililitros por pocillo de una mezcla uno a uno de los tubos A y B. Continúe cultivando las células durante tres a cuatro días.Prepare la capa de agar adicionando 1,2 % de agar noble al MEM completo dos veces en los tubos A y B, y agregue rojo neutro en un tercer tubo etiquetado como rojo neutro. Coloque el tubo A en un baño de agua a 42 grados Celsius y los otros dos tubos en un baño de agua a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Luego, mezcle juntos siete mililitros del tubo A, siete mililitros del tubo B y 0,5 mililitros de rojo neutro. Aliquote dos mililitros de la mezcla en cada pocillo de una placa de seis pocillos e incube la placa durante la noche. Ahora determine el número de unidades formadoras de colonias por mililitro. Los fibroblastos embrionarios de ratón C57 de tipo silvestre codifican un gen de fosfatasa alcalina embrionaria secretada, inducible por NF kappa B y IRF tres o siete.Aquí analizamos la actividad de secreción inducida por respuestas inmunitarias innatas. Infecte células subconfluentes en placas de 12 pocillos con MP 12 recombinante que codifique mutaciones en NS o con el control MP 12, e incube durante una hora. Retire el inóculo, añada un mililitro por pocillo de DMEM completo y cultive durante 14 horas. Recopile los sobrenadantes del cultivo para un ensayo de secreción; a cada pocillo de una placa de 96 pocillos añada 200 microlitros de quantum blue y 50 microlitros de cada muestra, selle la placa e incúbela a 37 grados Celsius durante una hora.Mida la DO a 650 nanómetros utilizando un lector de placas. El virus de la fiebre de Rift Valley tiene un genoma de ARN de sentido negativo tripartito denominado segmentos S, M y L en comparación con el NSS de la cepa MP 12. El marco abierto de lectura del tipo C 13 está truncado en un 69 %. Típicamente, el sistema de genética inversa genera virus recombinantes viables de MP 12 con títulos superiores a 1 × 10⁶ PFU por mililitro del virus tipo C 13.Las funciones deficientes en N forman placas turbias grandes, mientras que MP 12 formó placas claras de diversos tamaños en comparación con las células infectadas simuladamente a las 14 horas posteriores a la infección. Células madre tipo silvestre C57 infectadas con MP 12 no aumentan el nivel de seep en cultivo.El sobrenadante, por el contrario, la infección por el tipo C 13 induce un aumento del nivel de exudado a las 14 horas posteriores a la infección; los análisis de Northern blot utilizando una sonda de ARN específica para el ARNm del ISG 56 de ratón confirman la sobreexpresión del ARNm de ISG 56 en ausencia de la expresión de N'S. Siguiendo este procedimiento como método, experimentos como la inmunización de ratones y la evaluación de anticuerpos neutralizantes pueden abordar cuestiones tales como la inmunogenicidad del mutante NSS. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la fiebre del Valle exploraran las funciones de los genes no estructurales en células y animales infectados.No olvide que trabajar con virus infecciosos puede ser extremadamente peligroso, por lo que siempre debe tomar precauciones para evitar inhalar partículas en aerosol. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recuperar y titular cepas recombinantes de MP 12 y cómo seleccionar mutantes de NSS que carezcan de función supresora del interferón alfa beta.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Mediante genética inversa para manipular el gen de Sociedades Nacionales del virus de la fiebre de Rift Valley MP-12 Cepa para mejorar la seguridad de la vacuna y la eficacia (Video) | JoVE Journal

Mediante genética inversa para manipular el gen de Sociedades Nacionales del virus de la fiebre de Rift Valley MP-12 Cepa para mejorar la seguridad de la vacuna y la eficacia

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