Seguimiento de las actividades de quinasa y fosfatasa través del ciclo celular por Proporcional FRET

En este video, las actividades de quinasa y fosfatasa se monitorean a lo largo del ciclo celular utilizando la transferencia de energía de resonancia de Forrester o traste. Aquí, una sonda de actividad tipo polo kinasa one o LK one tiene la proteína fluorescente cian CFP colocada en un extremo y la proteína fluorescente amarilla YFP colocada en el otro. Esta sonda se transfecta en las celdas U2 OS.

A continuación, para examinar el estado de fosforilación de los objetivos LK one durante la transición G dos dos M, las células OS U2 TRANSFECTADAS se someten a imágenes de fluorescencia de lapso de tiempo. Cuando CFP e YFP están muy cerca y CFP está excitado, la energía se transfiere a YFP y se puede detectar la admisión de YFP. Sin embargo, cuando la sonda se fosforila, un cambio de confirmación en la proteína separa la CFP y la YFP.

Ahora, cuando se excita CFP, se detecta una fuerte emisión de CFP y solo una emisión débil de YFP. La cuantificación de la relación entre la emisión de YFP después de la excitación de CFP y YFP demuestra que la actividad de PLK one aumenta en G dos y alcanza su punto máximo durante la mitosis. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la filmación geométrica estándar, es que se presta especial atención a que el ciclo celular no se vea perturbado ni por las condiciones de filmación ni por la expresión de una sonda. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del ciclo celular, como dónde y cuándo se activan quinasas o fosfatasas específicas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las enzimas reguladas por el ciclo celular, también se puede aplicar a otros sistemas en los que se requieren condiciones difíciles, como los ensayos de proliferación celular. Para monitorizar el ciclo de las células humanas, las células U2 OS se transfectan con una sonda de una sola actividad PK basada en trastes. Utilizando un método estándar de transfección de fosfato de calcio, las células se seleccionan en purmicina durante al menos siete días.

Esto enriquece la población de células que expresan la sonda y limita el número de células con niveles de expresión tóxicos o niveles de expresión que afectan gravemente al ciclo celular. A continuación, se seleccionan los clones estables mediante una expresión de dilución limitada de CFP y se examina YFP para verificar que están presentes en todas las células aproximadamente en la misma proporción. Si algunas células contienen solo CFP o YFP, es probable que se haya producido una recombinación en este caso, repita la preparación del plásmido utilizando bacterias que sean menos propensas a la recombinación homóloga, como dos células, luego linealice el plásmido y repita la transfección.

Una vez que las células expresen de manera estable la sonda, siembróguelas en platos con fondo de vidrio número 1.5 después de que se hayan unido y tengan un 30 a 50% de confluente. Cambie el medio a uno que sea independiente de CO2 y que no contenga rojo de fenol, monte las células en un microscopio de epifluorescencia motorizado con el control de temperatura ajustado a 37 grados centígrados. El microscopio debe estar equipado con filtros de excitación y emisión CFP e YFP.

Un espejo ROIC adecuado para la monitorización de CFP e YFP y un objetivo adecuado para la resolución requerida. En este caso, se utiliza un objetivo aéreo de 20 x NA 0,75. Usando la luz transmitida, enfoca las células.

No utilice luz fluorescente en este punto, ya que inducirá una respuesta al estrés que puede perturbar el ciclo celular. Para evitar la fototoxicidad, ajuste la flexión al máximo disponible que permita la resolución subcelular requerida. Para este experimento, debería ser posible distinguir el núcleo y el citoplasma.

Establezca un tiempo de exposición corto e inserte un filtro de alta densidad neutra. A continuación, adquiera una imagen de prueba de 12 o 16 bits utilizando la excitación y emisión YFP, ajuste el tiempo de exposición y los filtros de densidad neutra para que la intensidad media de una celda sea aproximadamente igual a la intensidad de fondo más cinco veces la diferencia entre las intensidades de fondo mínima y máxima. Para comprobar que las imágenes no están saturadas, examine la intensidad de fluorescencia de la imagen de muestra.

La intensidad máxima en la imagen debe ser inferior a la mitad del rango dinámico para permitir las diferencias de intensidad cuando las células entran en mitosis. A continuación, repita este proceso utilizando la excitación CFP y los filtros de emisión YFP. Seleccione varias regiones con celdas transfectadas, excluyendo las regiones utilizadas para enfocar y optimizar las condiciones de exposición.

Dado que estos procedimientos pueden haber invocado una respuesta de estrés, asegúrese de que la intensidad máxima sea inferior a la mitad del rango dinámico en todas las celdas. Indique al software que adquiera dos imágenes cada 45 minutos utilizando la excitación YFP, la emisión YFP y la excitación CFP. Filtros de emisión YFP.

Establezca también la duración total del experimento para que supere la duración del ciclo celular. Una vez que todo esté configurado, comience a adquirir imágenes después de que se complete la adquisición, abra las imágenes adquiridas y controle el tiempo del ciclo celular de mitosis a mitosis. Para las células que expresan la sonda transfectada aquí, el tiempo del ciclo celular fue de aproximadamente 20 a 25 horas.

Compare esto con los datos de control para el tipo de celda utilizado. Si el tiempo de ciclo de la célula corresponde a los tiempos de referencia, se puede analizar el traste. Una vez verificado el tiempo, se pueden analizar las imágenes.

El análisis puede ser realizado por la mayoría de los programas dedicados a la microscopía. Aquí, se utiliza el software gratuito image j con el complemento ratio plus. Comience el análisis abriendo las imágenes en la imagen J.Si las imágenes están en un formato de pila multicolor, separe los canales individuales convirtiéndolos en una hiperpila seleccionando la imagen.

A continuación, hiper pila y luego pila a hiper pila. Se abre la ventana de conversión a hyper stack con la configuración mostrada, haga clic en Aceptar. La imagen ahora se mostrará con dos barras deslizantes debajo.

Junto a dividir las imágenes en pilas de un solo canal, haga clic en la imagen y seleccione hyper stack reducir la dimensionalidad. Esto abrirá la ventana de reducción, asegúrese de que los fotogramas y la fuente de mantenimiento estén seleccionados. A continuación, haga clic en Aceptar.

Aparecerá una nueva imagen que contendrá solo un canal. Repita este proceso para que aparezca una nueva imagen con el segundo canal. A continuación, para aumentar la claridad visual de las imágenes finales, seleccione la pila de emisión YFP de excitación YFP.

Haga clic en procesar, luego haga clic en matemáticas. A continuación, multiplique Cuando se abra la ventana de multiplicación, introduzca tres para multiplicar la pila de emisiones YFP de excitación YFP por tres. El paso es opcional y garantiza que las proporciones no estén en el rango entre cero y uno.

A continuación, en la barra de herramientas de la imagen J, seleccione la herramienta a mano alzada. Luego, en la excitación de YFP, pila de emisión de YFP, dibuje una región de interés o ROI en un área que esté desprovista de celdas, pero que esté cerca de una celda que se medirá para agregar el ROI al administrador de ROI, haga clic en analizar herramientas. A continuación, gestor del ROI.

Aparecerá la ventana del administrador de ROI. Haga clic en agregar para guardar las coordenadas de ROI para medir la intensidad promedio del ROI en la pila de emisión de YFP excitación YFP. Haga clic en analizar, luego seleccione medir.

Se abrirá la ventana de resultados. Seleccione la pila de emisiones YFP de excitación CFP. A continuación, haga doble clic en el ROI en el administrador de ROI y repita la medición.

La medición se agrega a la ventana de resultados. Desplácese a otros lugares de la pila para repetir este proceso en varios puntos temporales. Verifique que las intensidades de fondo cercanas a la celda de interés sean similares a lo largo de la película comparando las mediciones en la ventana de resultados.

Para configurar las mediciones para que incluyan una intensidad mínima, haga clic en analizar, luego haga clic en establecer mediciones e indique el valor de gris mínimo y máximo. A continuación, aparecerá una ventana que muestra las alternativas de medición. Después de ajustar el brillo y el contraste según sea necesario, dibuje un ROI que cubra la mayor parte de una celda y mida la intensidad mínima en ambas pilas.

A continuación, tome las medidas como antes, utilizando una celda en lugar del fondo. Usando los valores de las secciones de resultados, calcule la diferencia entre la intensidad mínima medida y la intensidad de fondo y divídala por dos. Esto proporciona una estimación inicial de un valor de recorte a la relación de apertura más complementos seleccionados.

A continuación, la relación más. Luego, para la relación de trastes, seleccione la pila S de emisión YFP de excitación CFP uno o para la relación de trastes invertida visualizando sondas donde la eficiencia de los trastes disminuye con la fosforilación. Seleccione la pila S de excitación YFP emission YFP uno para insertar las intensidades de fondo medidas y los valores de recorte.

Utilice los valores de la ventana de resultados y péguelos en la ventana de proporción plus. Establezca la escala de la pila de proporciones resultante y aplique una tabla de búsqueda adecuada para visualizar los cambios de proporción. Las células U2 OS que expresan una sonda basada en trastes que monitorea la actividad PLK one se filmaron durante 60 horas, como se describe en este video.

Esta imagen muestra la entrada mitótica acumulativa de 50 células que expresan sonda de traste, incluidas las divisiones de células hijas. La mayoría de las células que expresan la sonda proliferan con un tiempo de ciclo celular de entre 20 y 25 horas, lo que indica que las condiciones de imagen y los niveles de expresión de la sonda no afectan el tiempo del ciclo celular. Una representación de color falso de la relación de trastes invertida después de una célula a través de cuatro divisiones demuestra que, aunque hay un ruido considerable, se observa una tendencia en la que la actividad de PK uno aumenta en G dos y alcanza su punto máximo durante la mitosis.

Cuando los datos brutos se filtran por la media y se presentan como un gráfico, el tiempo entre los picos de actividad es fácil de estimar. Esta figura muestra la cuantificación de la relación de trastes invertida de la celda que se muestra en las imágenes anteriores del gráfico. El momento de la activación se puede estimar y, como se puede ver aquí, la fosforilación de la sonda se hace visible aproximadamente cuatro horas antes de que la fosforilación alcance su punto máximo en la mitosis.

Al intentar este procedimiento, es importante mantener las células en una condición de estrés, por lo que esto se hace minimizando la exposición a la luz, así como minimizando los cambios de temperatura o pH. También es importante recordar que este método monitorea el equilibrio entre la actividad de la quinasa y la fosfatasa en una célula. Este procedimiento puede combinarse con cribados de interferencia de ARN o de inhibidores para identificar los reguladores aguas arriba de estas quinasas y fosfatasas.